Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây mãn đình hồng althaea rosea để thu nhận hợp chất flavonoid có hoạt tính sinh học

MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 SƠ LƯC VỀ CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHEAE ROSEA L 1.1.1 Đặc điểm phân loại .2 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh thái .3 1.1.4 Đặc điểm phân boá .4 1.1.5 Các hợp chất có giá trị Mãn Đình Hồng 1.1.6 Giá trị y dược Mãn Đình Hồng 1.2 TỔNG QUAN VỀ HP CHẤT FLAVONOID 1.2.1 Cấu tạo đặc điểm hợp chất tự nhiên Flavonoid 1.2.2 Tác dụng dược lý 1.2.2.1 Tác dụng kiểu Vitamine P 1.2.2.2 Taùc dụng chống oxy hóa 1.2.2.3 Các tác dụng khác 1.2.3 Sơ lược số hợp chất Flavonoid có Mãn Đình Hồng .7 1.2.3.1 Hợp chất Rutin a Đặc điểm hóa lý b Giá trị y dược .7 1.2.3.2 Hợp chaát Quercetin a Đặc điểm hóa lý b Giá trị y dược .9 1.2.3.3 Hợp chất Kaempferol 11 a Đặc điểm hóa lý 11 b Giá trị y dược .11 1.2.3.4 Hợp chất Myricetin 12 a Đặc điểm hóa lý 12 b Giá trị y dược .12 1.2.4 Một số đối tượng chứa hợp chất Flavonoid 13 1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU HP CHẤT THỨ CẤP .15 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 15 1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo .16 1.3.2.1 Khái niệm mô sẹo 16 1.3.2.2 Phương pháp tạo mô sẹo 16 1.3.2.3 Đường cong tăng trưởng 17 1.3.2.4 Ứng dụng nuôi cấy mô .18 1.3.3 Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học 18 1.3.4 Các điều kiện nuôi cấy tế bào ảnh hưởng đến sản xuất chất thứ cấp 20 1.3.4.1 Chất điều hòa sinh trưởng 20 1.3.4.2 Nguoàn ñaïm 20 1.3.4.3 Nguoàn Carbon 21 1.3.4.4 AÙnh saùng 21 1.3.4.5 Các chất khác 21 1.4 SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY) .21 1.4.1 Lý thuyết sắc ký lỏng cao áp HPLC 21 1.4.2 Cấu tạo hoạt động máy sắc ký lỏng cao áp HPLC 22 CHƯƠNG – MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .27 CHƯƠNG – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 A ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28 B TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28 C THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 29 3.1 THIẾT LẬP QUI TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO, TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HOÀNG ALTHAEA ROSEA L .29 3.1.1 Vật liệu .29 3.1.1.1 Nguyên liệu nuôi cấy 29 3.1.1.2 Hoùa chất khử trùng 29 3.1.1.3 Môi trường nuôi cấy 29 3.1.1.4 Điều kiện nuôi cấy 29 3.1.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm .29 3.1.2.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 29 a Mục đích tiến haønh 29 b Bố trí thí nghiệm .30 c Chỉ tiêu theo dõi .30 d Các bước tiến hành 30 3.1.2.2 Thí nghiệm 2: nh hưởng BA NAA lên khả tạo mô sẹo 31 a Mục đích thí nghiệm 31 b Boá trí thí nghiệm .31 c Chỉ tiêu theo dõi .32 d Các bước tiến hành thí nghiệm .32 3.1.2.3 Thí nghiệm Xác định đường cong tăng trưởng tế bào Mãn Đình Hồng 32 a Mục đích thí nghiệm 32 b Bố trí nghiệm thức 32 c Chỉ tiêu theo dõi 32 d Các bước tiến hành thí nghiệm .33 3.1.2.4 Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu lượng sinh khối cao .33 a Muïc đích thí nghiệm 33 b Bố trí nghiệm thức 33 c Chỉ tiêu theo dõi .33 d Các bước tiến hành thí nghiệm 34 3.2 ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG FLAVONOID CÓ TRONG MÔ SẸO DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L 35 3.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavonoid có Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L 35 3.2.1.1 Mục tiêu tiến hành thí nghiệm 35 3.2.1.2 Nguyên liệu .35 3.2.1.3 Hóa chất_Thiết bị 35 3.2.1.2 Bố trí thí nghiệm 35 3.2.1.5 Phương pháp tiến hành 36 a Xử lý nguyên liệu .36 b Các bước tiến hành thí nghiệm 36 3.2.2 Thí nghiệm 6: Định lượng Flavone 37 3.2.2.1 Mục tiêu thí nghiệm 37 3.2.2.2 Nguyên vật liệu .37 3.2.2.3 Hóa chất 37 3.2.2.4 Điều kiện chạy HPLC .38 3.2.2.5 Phương pháp tiến hành 38 a Bố trí nghiệm thức 38 b Các bước tiến hành thí nghiệm 38 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .40 4.1 THIẾT LẬP QUI TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO, TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L 40 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 40 4.1.2 Thí nghiệm 2: nh hưởng BA NAA lên khả tạo mô sẹo .41 4.1.3 Thí nghiệm 3: Xác định đường cong tăng trưởng tế bào Mãn Đình Hồng Althase Rosea L 47 4.1.4 Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu lượng sinh khối cao 48 4.2 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƯNG HP CHẤT FLAVONE 51 4.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavone có Mãn Đình Hồng Althaea Rose L.51 4.2.2 Thí nghiệm 6: Định lượng Flavone phương pháp HPLC 51 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .53 5.1 KẾT LUẬN 53 5.1.1 Thiết lập qui trình nuôi cấy in vitro, tạo mô sẹo dịch huyền phù tế bào Mãn Đình Hồng .53 5.1.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy .53 5.1.1.2 nh hưởng BA NAA lên khả tạo mô sẹo 53 5.1.1.3 Xác định đường cong tăng trưởng tế bào Mãn Đình Hồng 53 5.1.1.4 Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu lượng sinh khối cao nhaát .53 5.1.2 Kết định tính định lượng Flavone .54 5.1.2.1 Kết định tính Flavone .54 5.1.2.2 Kết định lượng Flavone 54 5.2 KIẾN NGHỊ 54 5.2.1 Nuôi cấy in vitro 54 5.2.2 Định tính định lượng Flavonoid .54 5.2.3 Nghieân cứu ứng dụng 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT • NAA : Naphthalenacetic acid • BA : 6–Benzyl–aminopurine • MS : Murashine & Skoog, 1962 • HPLC : Hight Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng cao áp) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Khảo sát hàm lượng Javel dùng để khử trùng 30 Bảng 3.2 Nghiệm thức bố trí giai ñoaïn 31 Bảng 3.3 Nghiệm thức bố trí giai đoạn 31 Baûng 3.4 Nghiệm thức khảo sát đường cong tăng trưởng tế bào mô sẹo 32 Bảng 3.5 Bố trí nghiệm thức khảo sát điều kiện tối ưu hóa ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng để thu lượng sinh khối cao 33 Bảng 3.6 Bố trí nghiệm thức định tính Flavone 35 Bảng 3.7 Màu của Flavonoid ánh đèn tử ngoại có xử lý với kiềm 37 Bảng 3.8 Các nghiệm thức định lượng Rutin phương pháp HPLC 38 Bảng 4.1 Kết khử trùng hạt Mãn Đình Hồng 40 Bảng 4.2 Kết khảo sát phạm vi roäng 41 Bảng 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng NAA BA phạm vi hẹp 44 Bảng 4.4 Kết khảo sát đường cong tăng trưởng 47 Bảng 4.5 Kết khảo sát điều kiện tối ưu hóa chất điều hòa sinh trưởng 48 Bảng 4.6 Kết theo dõi màu định tính Flavone 51 Bảng 4.7 Kết định lượng hàm lượng hợp chất Rutin mẫu thiên nhiên, mô sẹo khô dịch huyền phù 51 DANH MUÏC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Hoa Mãn Đình Hồng mãu đỏ màu trắng Hình 1.2 Cây hoa Mãn Đình Hồng trồng vườn Hình 1.3 Cấu trúc C6-C3-C6 Hình 1.4 Cầu truùc Benzo-dihypyran Hình 1.5 Công thức cấu tạo Rutin Hình 1.6 Công thức cấu tạo Quercetin Hình 1.7 Dạng glucoside Quercitin Hình 1.8 Công thức cấu tạo Kaempferol 11 Hình 1.9 Dạng glycoside Kaempferol 11 Hình 1.10 Công thức cấu tạo chất Myricetin 12 Hình 1.11 Dạng glycoside cuûa Myricetin 12 Hình 1.12 Biểu đồ biểu diễn đường cong tăng trưởng 17 Hình 1.13 a Cấu tạo tổng máy HPLC 24 Hình 1.13 b Sơ đồ khối máy HPLC 25 Hình 1.13 c Các loại máy HPLC thông dụng phòng thí nghiệm 26 Hình 4.1 Mẫu Mãn Đình Hồng Khử trùng in vitro 41 Hình 4.2 (a,b)Mẫu mô sẹo hình thành giai đoạn 1, khảo sát phạm vi rộng 43 Hình 4.3 (a, b) Mẫu mô sẹo khảo sát giai đoạn phạm vi hẹp 46 Hình 4.4 Mẫu nuôi cấy huyền phù tế bào 50 Hình 4.5 Mẫu tế bào Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L 50 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 3.1 Xử lý mẫu định tính 36 Biểu đồ 4.1 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát điều kiện khử trùng 40 Biểu đồ 4.2 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát ảnh hưởng NAA BA phạm vi rộng 43 Bieåu đồ 4.3 Biểu diễn kết khảo sát điều kiện tạo mô sẹo 46 Biểu đồ 4.4 Biểu diễn đường c4ông tăng trưởng dịch nuôi cấy huyền phù tế bào 48 Biểu đồ 4.5 Biểu diễn kết theo dõi tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 49 Chương 4: Kết bàn luận 4.2 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG HP CHẤT FLAVONE 4.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavone có Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L Bảng 4.6 Kết theo dõi màu định tính Flavone Bố trí Không có M1 Màu F1 Không màu F3 Xanh dương F2 Vàng F4 Vàng F5 Không màu F7 Xanh dương F6 Vàng F8 Vàng Thường thuốc thử UV365nm Có phun xịt với kiềm Thường UV365nm Không có M2 Nghiệm thức Thường thuốc thử UV365nm Có phun xịt với kiềm Thường UV365nm Căn theo bảng 3.7 phần định tính mẫu thiên nhiên mô sẹo có diện Flavone Từ kết tiếp tục nghiên cứu hợp chất Flavone có giá trị sinh học cao Rutin theo phương pháp HPLC 4.2.2 Thí nghiệm 6: Định lượng Flavone phương pháp HPLC Bảng 4.7 Kết định lượng hàm lượng hợp chất Rutin mẫu thiên nhiên, mô sẹo khô dịch huyền phù Thời gian lưu Mẫu (phút) Ký hiệu Rutin mẫu (mg/g)* Chuẩn Mẫu Mẫu thiên nhiên 18,216 18,219 M1 0,72 Mẫu mô sẹo in vitro 20,293 20,052 M2 0,035 Dịch huyền Sinh khối tế bào 20,293 - M3 - phù Dịch lỏng ngoại bào 18,216 18,739 M3 0,820** (Căn theo bảng phụ lục kết kiểm nghiệm) Trần Chấn Đại Trang 51 Chương 4: Kết bàn luận Ghi chú: * hàm lượng hợp chất Rutin 1g trọng lượng sinh khối khô ** hàm lượng quy đổi Sinh khối nuôi lít dung dịch thu 25,584g sinh khối khô, lít dung dịch nuôi cấy xác định 21,20mg hợp chất rutin Từ bảng kết cho thấy thiên nhiên có hàm lượng Rutin cao Hàm lượng Rutin thu nhận từ phương pháp nuôi cấy huyền phù cao 0,82 mg/g thu nhận từ dịch ngoại từ dịch ngoại bào Kết chứng minh tiềm thu nhận hợp chất Flavonoid từ phương pháp nuôi cấy tế bào đơn với khả điều chỉnh điều kiện tăng sinh hợp chất tối ưu Trần Chấn Đại Trang 52 Chương Kết luận kiến nghị 5.1 KẾT LUẬN Qua thí nghiệm thực hiện, đưa kết luận sau 5.1.1 Thiết lập qui trình nuôi cấy invitro, tạo mô sẹo dịch huyền phù tế bào Mãn Đình Hồng 5.1.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy Hàm lượng Javel 9,5g/l lắc với thời gian 15 phút (86,67%) có tỉ lệ hạt mầm cao cho tỷ lệ hạt nhiễm khuẩn chết thấp 5.1.1.2 nh hưởng BA NAA lên khả tạo mô sẹo Qua kết ta thấy hàm lượng môi trường tối ưu hóa tạo mô sẹo NAA=1,0mg/l Ba=0,4mg/l số lượng (80,61 ± 0,01) hình thái (trắng, to, xốp) 5.1.1.3 Xác định đường cong tăng trưởng tế bào Mãn Đình Hồng Sinh khối mô sẹo bắt đầu phát triển tốt tuần thứ tức sau 14 ngày cấy, bắt đầu giảm sau tuần thứ tức ngày thứ 21 Tế bào mô sẹo Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L có thời gian phát triển sinh khối cao ngày thứ 14 5.1.1.4 Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu lượng sinh khối cao Ở hàm lượng NAA = 1,1 mg/l vàBA = 0,4 mg/l cho hàm lượng sinh khối cao 1,698g ± 0,040g Trần Chấn Đại Trang 53 Chương Kết luận kiến nghị 5.1.2 Định tính định lượng Flavonoid có mô sẹo dịch huyền phù tế bào Mãn Đình Hồng ALthaea Rosea L 5.1.2.1 Kết định tính Flavonoid có Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L Mẫu thiên nhiên mô sẹo có diện Flavone 5.1.2.2 Kết định lượng hàm lượng Flavone phương pháp HPLC Cây thiên nhiên có hàm lượng đáng kể Rutin với hàm lượng 0,780 mg/g hàm lượng Rutin thu nhận từ phương pháp nuôi cấy huyền phù cao 0,82 mg/g thu nhận từ dịch ngoại từ dịch ngoại bào 5.2 KIẾN NGHỊ 5.2.1 Nuôi cấy in vitro - Khảo sát thêm điều kiện nuôi cấy tế bào đơn (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc…) để nuôi cấy tế bào huyền phù cho hàm lượng Rutin thu cao - Nghiên cứu phương pháp tăng sinh hợp chất phương pháp cố định tế bào, bổ sung tiền chất, biến đổi gen … 5.2.2 Định tính định lượng Flavonoid Tiến hành kiểm tra định tính định lượng hợp chất Flavonoid có giá trị sinh học khác Quercetin, Kaempferol Myricetin… đối tượng tự nhiên nuôi cấy in vitro 5.2.3 Nghiên cứu ứng dụng - Tiến hành thử nghiệm phương pháp khác để thu nhận hàm lượng Rutin tinh từ mẫu nuôi cấy huyền phù - Tiến hành thử nghiệm điều kiện tối ưu để sản xuất dịch huyền phù nói chung, việc thu nhận hợp chất Rutin nói riêng theo quy mô công nghiệp Trần Chấn Đại Trang 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học, Năm 1985 Nguyễn Minh Đức, Sắc ký lỏng cao áp ứng dụng vào kiểm nghiệm, nghiên cứu dược liệu hóa hợp chất tự nhiên Giáo trình cao học chuyên ngành dược liệu, ĐH Y-Dược, TP HCM, 2001 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, trang 108-109, NXB Trẻ, năm 2006 Trần Hùng, Bài giảng Dược liệu học, Đại học Thành phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Dược Liệu, Nămg 2003 Nguyễn Kim Phi Phụng, Các phương pháp nhận danh trích ly cô lập hợp chất tự nhiên từ cỏ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2000-2001 Dương Công Kiên, Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2002 Trần Văn Minh, Công nghệ tế bào, trường Đại học Nông lâm Tp.HCM, Năm 2000 Tài liệu tham khảo nước Acram M.Tại, Willain A.Dodd, Richard R.Williams, plant tissue culture practice, University if New England, Armidale, 1990 Crystal Smith, Kevin A Lombard, Ellen B Peffley, Weixin Liu (2003) (Q)"Genetic Analysis of Quercetin in Onion (Allium cepa L.) Lady Raider" The Texas Journal of Agriculture and Natural Resource 16: 2428 Agriculture Consortium of Texas 10 Gong-Jun Yang a,∗, Ping Liu a, Xi-Long Qua, Min-Juan Xub, Qi-Shu Qua,Cheng-Yin Wang a, Xiao-Ya Hu a, Zhi-Yue Wang b,∗, The simultaneous separation and determination of six flavonoids and troxerutin in rat urine and chicken plasma by reversed-phase highperformance liquid chromatography withultraviolet–visible detection, Journal of Chromatography B, 856 (2007) , P 222–228 11 Hilliard JJ, Krause HM, Bernstein JI, Fernandez JA, Nguyen V, Ohemeng KA, Barrett JF 'A comparison of active site binding of 4-quinolones and novel flavone gyrase inhibitors to DNA gyrase Adv Exp Med Biol 1995;390:59-69 PMID 8718602 12 Hegnauer R.: Chemotaxonomie der Pflanzen, Birkhauser Verlag, Stuttgart, 1996 13 Jun Seong Park, Ho Sik Rho, Duck Hee Kim, and Ih Seop Chang (2006) "Enzymatic Preparation of Kaempferol from Green Tea Seed and Its Antioxidant Activity" J Agric Food Chem 54 (8): 2951 -2956 doi:10.1021/jf052900a 14 Mat¡Ýawska I.: Herba Pol 4, 163 (1992) 15 Marlena Dudek, Irena Mat£Awska, Maurycy Szkudlarek, Phenolic Acids In The Flowers Of Althaea Rosea var nigra, Acta Poloniae Pharmaceutica ñ Drug Research, Vol 63 No 3, 2006 16 MilinV., Kustrak D.: Farm Glas 59, 141(2003) 17 Paul Knekt et al (September 2002) Flavonoid intake and risk of chronic diseases Retrieved on May 24, 2006 18 Sari H Häkkinen et al (1999) "Content of the Flavonols Quercetin, Myricetin, and Kaempferol in 25 Edible Berries" Journal of Agricultural and Food Chemistry 47 (6): 2274 -2279 ACS Publications doi:S00218561(98)01106-6 10.1021/jf9811065 S0021-8561(98)01106-6 PMID 10794622 Retrieved on 2007-06-13 19 Shoskes, DA et al (1999) "Quercetin in men with category III chronic prostatitis: a preliminary prospective, double-blind, placebo-controlled trial." Urology 54 (6) Tài liệu tham khảo từ Internet 20 http://www.140.115.43.2/facility/facility_eng.htm 21 http://www.beepharmacy.com/web/SanPham.aspx?load=detail&id=1793 &type=pnthuocdongy 22 http://www.brnt.hcmut.edu.vn/TDCNGL/DAC%20DIEM%20CONG%20 NGHE%20MOT%20SO%20NGANH/TRA.htm 23 http://caythuocquy.info.vn/modules.php?mcid=247&mid=1010&name=N ews&opcase=detailsnews 24 http://en.wikipedia.org/wiki/Alcea_rosea 25 http://en.wikipedia.org/wiki/Kaempferol 26 http://en.wikipedia.org/wiki/Quercetin 27 http://en.wikipedia.org/wiki/Myricetin 28 http://en.wikipedia.org/wiki/Rutin 29 http:// KyhoadithaoCác loại hoa q, thủ đức_.htm 30 http://suckhoecongdong.com/content/view/830/105/ 31 http://The compounds from the hollyhock extract (Althaea _[Folia Histochem Cytobiol_ 2002] - PubMed Result.htm 32 http://www.tvvn.org/vbthuvien.php?do=viewarticle&artid=21&cpage=1& page=19 33 http://www.vietpharm_com_vn.htm 34 http://www.vgdusa.com/chemicals_r.htm 35 http://www.yhcotruyentw.org.vn/tintuc_chitiet.php?tintuc_id=32&lang= PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MURASHINE & SKOOG * - NH4NO3 1,065 mg - CaCl2.2H2O 440 mg - MgSO4.7H2O 370 mg - KNO3 1,900 mg - KH2PO4 170 - CoCl2.6H2O 0,0025mg - CuSO4.5H2O 0,0025mg - FeSO4.7H2O 27,85 mg - Na2-EDTA 37,25 mg - MnSO4.4H2O 22,3 mg - KI 0,83 mg - Na2MoO4.2H2O 0,25 mg - ZnSO4.7H2O 8,6 mg - H3BO3 6,2 mg - Inositol mg - Thiamin(Vitamine B1) mg - Glycine mg - Glucose 30 g - pH 5,8 - Agar* g - Bổ sung nước cất vô trùng vừa đủ lít mg Trong môi trường lỏng nuôi cấy huyền phù không sử dụng agar PHỤ LỤC BẢNG SỐ LIỆU – KẾT QUẢ Bảng phụ lục 2.1 Kết khảo sát điều kiện khử trùng Laàn Nghiệm Laàn Laàn Tỷ lệ (%) thức SL Tỷ lệ (%) SL Tỷ lệ (%) SL Tỷ lệ (%) Trung bình ±SE A1 11 36,67 30,00 10 33,33 33,33 0,11 A2 18 60,00 19 63,33 16 53,33 58,89 0,26 A3 16 53,33 12 40,00 17 56,67 50,00 0,78 A4 15 50,00 13 43,33 14 46,67 46,67 0,11 A5 26 86,67 27 90,00 24 80,00 85,56 0,26 A6 21 70,00 19 63,33 22 73,33 68,89 0,26 A7 13 43,33 10 33,33 12 40,00 38,89 0,26 A8 20 66,67 21 70,00 19 63,33 66,67 0,11 A9 18 60,00 18 60,00 16 53,33 57,78 0,15 Bảng phụ lục 2.2 Kết khảo sát ảnh hưởng NAA BA phạm vi rộng Nghiệm thức Lần Lần Laàn Tỷ lệ (%) SL Tỷ lệ (%) SL Tỷ lệ (%) SL Tỷ lệ (%) Trung bình ±SE B1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 B2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 B3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 B4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 B5 26,67 20,00 30,00 19,17 0,26 B6 21 70,00 19 63,33 22 73,33 51,67 0,26 B7 18 60,00 16 53,33 20 66,67 45,00 0,44 B8 12 40,00 11 36,67 13 43,33 30,00 0,11 B9 24 80,00 23 76,67 25 83,33 60,00 0,11 B10 26 86,67 24 80,00 28 93,33 65,00 0,44 B11 30,00 26,67 13 43,33 25,00 0,78 B12 24 80,00 22 73,33 25 83,33 59,17 0,26 B13 21 70,00 22 73,33 18 60,00 50,83 0,48 B14 20 66,67 22 73,33 19 63,33 50,83 0,26 B15 17 56,67 17 56,67 16 53,33 41,67 0,04 B16 14 46,67 15 50,00 14 46,67 35,83 0,04 Bảng phụ lục 2.3 Kết khảo sát ảnh hưởng NAA BA phạm vi hẹp Nghiệm thức Lần SL Tỷ lệ(%) Lần Lần SL Tỷ lệ (%) SL Tỷ lệä(%) Tỷ lệä(%) Trung bình ±SE C1 24 80,00 24 80,00 25 83,33 81,11 0,04 C2 15 50,00 15 50,00 13,33 37,78 0,48 C3 24 80,00 26 86,67 23 76,67 81,11 0,26 C4 16 53,97 10 33,33 19 63,33 50,21 2,36 C5 15 50,0 15 50,00 17 56,67 52,22 0,15 C6 22,92 20,00 30,00 24,31 0,26 C7 24 79,17 26 86,67 23 76,67 80,83 0,27 C8 17 57,14 17 56,67 18 60,00 57,94 0,03 C9 13 42,86 15 50,00 12 40,00 44,29 0,27 C10 14 45,83 16 53,33 11 36,67 45,28 0,70 C11 18 60,87 17 56,67 20 66,67 61,40 0,25 C12 25 81,82 24 80,00 24 80,00 80,61 0,01 C13 22 73,33 21 70,00 22 73,33 72,22 0,04 C14 21 68,42 20 66,67 21 70,00 68,36 0,03 C15 31,43 10 33,33 11 36,67 33,81 0,07 C16 26 86,96 25 83,33 24 80,00 83,43 0,12 C17 19 62,50 18 60,00 21 70,00 64,17 0,27 C18 24 80,00 22 73,33 25 83,33 78,89 0,26 C19 22 73,4 21 70,00 22 73,33 72,26 0,04 C20 26 85,71 25 83,33 23 76,67 81,90 0,22 C21 20,00 23,33 10 33,33 25,56 0,48 C22 12 40,00 10 33,33 11 36,67 36,67 0,11 Nghiệm Lần Lần Lần thức SL C23 23 77,78 20 66,67 24 C24 15 50,00 16 53,33 C25 25 83,33 23 76,67 Tỷ lệ(%) Tỷ lệä(%) Trung bình ±SE 80,00 74,81 0,51 13 43,33 48,89 0,26 24 80,00 80,00 0,11 SL Tyû lệ (%) SL Tỷ lệä(%) Bảng phụ lục 2.4 Kết khảo sát đường cong tăng trưởng Nghiệm Trọng lượng tươi (g) thức Lần Lần Lần D1 1,000 1,000 1,000 Trong lượng khô (g) Lần Lần Laàn TB ±SE 1,000 0,000 0,005 0,005 0,005 0,005 0,000 D2 30,822 26,096 28,308 28,409 2,365 0,123 0,072 0,096 0,097 0,015 D3 61,635 66,000 57,271 61,635 4,365 0,647 0,693 0,601 0,647 0,027 D4 54,632 46,899 42,261 47,931 6,250 0,498 0,466 0,478 0,481 0,009 D5 47,500 43,667 45,583 45,583 1,917 0,469 0,458 0,469 0,465 0,004 TB ±SE Bảng phụ lục 2.5 Kết khảo sát điều kiện tối ưu tạo sinh khối Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) TB Trọng lượng khô (g) ±SE Lần Lần Lần TB ±SE Laàn Laàn Laàn E1 12,822 8,519 11,175 10,839 1,254 0,499 0,331 0,435 0,422 0,049 E2 2,930 3,476 3,247 3,217 0,274 0,114 0,135 0,126 0,125 0,006 E3 5,222 4,659 4,071 4,650 0,576 0,203 0,181 0,158 0,181 0,013 E4 36,782 36,850 35,037 36,223 0,593 1,603 1,195 1,474 1,424 0,120 E5 43,936 41,643 45,344 43,641 1,079 1,704 1,626 1,764 1,698 0,040 E6 34,421 29,361 30,866 31,550 1,254 1,339 1,142 1,201 1,228 0,058 E7 42,989 38,508 37,812 39,770 1,622 1,673 1,498 1,471 1,547 0,063 E8 32,062 33,958 29,877 31,966 1,179 1,247 1,399 1,085 1,244 0,091 E9 36,927 40,667 36,776 38,123 1,273 1,437 1,582 1,431 1,483 0,049 PHUÏ LUÏC HÌNH A Một số hình kết khử trùng Javel theo nghiệm thức khác Hình a.1 Kết khảo sát hàm lượng Javel 7,6g/l, thời gian khử 10 phút Hình a.2 Kết khảo sát hàm lượng Javel 9,5g/l, thời gian khử 15 phút ... chịu mặn… 1.3.3 Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học Các mô sẹo rời thường chọn để nuôi cấy tế bào đơn Các tế bào từ mô sẹo phát triển phân tán tự môi trường lỏng... ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG FLAVONOID CÓ TRONG MÔ SẸO DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L 35 3.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavonoid có Mãn Đình Hồng Althaea Rosea. .. động gọi dịch nuôi cấy tế bào hay huyền phù tế bào Sau thời gian ngắn nuôi cấy, dịch huyền phù tế hỗn hợp tế bào đơn, tế bào liên kết với với kích thước khác nhau, tế bào phân chia tế bào chết