Nuôi cấy trên môi trường lỏng

III.NI CẤY 3.1 MỤC ĐÍCH 3.2 PHÂN LOẠI + Ni cấy môi trường lỏng + Nuôi cấy môi trường đặc 3.3 QUY TRÌNH 3.3.1 Ni cấy mơi trường lỏng A Nguyên lý Một lớp chất phát quang nhạy cảm với oxy gắn vào lớp silicon đáy tuýp môi trường Lượng oxy môi trường làm mờ phát quang phát quang Khi vi khuẩn sinh trưởng tiêu thụ oxy , hợp chất phát quang thoát ức chế phát quang, mức độ phát quang tương ứng với mật độ vi khuẩn có mơi trường, máy báo dương mật độ vi khuẩn tuýp khoảng 105 - 106 /1ml B VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ  Vật liệu • Mẫu thử Tất loại bênh phẩm trừ máu phân Bệnh Phẩm phải khử tạp Bệnh phẩm không khử tạp( lấy vô trùng) Đờm Dịch màng phổi Dịch phế quản Dịch não tủy Dịch dầy Dịch màng bụng Nước tiểu Dịch màng tim Mủ từ tổn thương hở Dịch khớp Tăm phết họng Mủ từ ổ apxe lạnh kín Tinh dịch, dịch âm đạo, máu kinh Tủy xương Tổn thương da Mảnh sinh thiết từ tổn thương kín Mơ Chất lượng số lượng bệnh phẩm Đờm: – ml có chất nhày mủ Dịch: 20–40 ml Dịch não tủy, màng tim (5 – 10 ml) Chứa túyp vô trùng 50 ml, vặn chặt nắp Ghi đầy đủ thông tin theo quy định lấy mẫu ( tên tuổi khoa, loại xét nghiệm) thân b) Hóa chất – mơi trường • Hóa chất - NaOH (khử tạp & tan đờm) - Natri citrat (giữ lại ion kim loại nặng để phát huy tác dụng NALC) - NALC: N-acetyl L-cystein: Làm tan đờm • - KH2PO4, Na2HPO4 - Nước cất - Băng thử pH - Hóa chất sát khuẩn: cồn 70%, Presept, Javel 5% phenol - Hóa chất nhuộm ZN Bộ môi trường lỏng MGIT BACTEC - Môi trường lỏng tuýp ml gồm: Approximate Foomura, Middlebrook 7H9, nước tinh khiết… - Growth Supplement gồm hợp chất dinh dưỡng thích hợp cho phát triển vi khuẩn lao gồm: Oleic acid, Albumin, Dextrose and Catalase - PANTA: hỗn hợp kháng sinh gồm Polymyxin B, Amphotericin B, Nalidixic Acid, Trimethoprim, Azlocillin c) Các vật liệu khác - Tuýp ly tâm: loại 50 ml có nắp xốy Pipet : loại thủy tinh (dùng lại) nhựa (dùng lần) Lam kính Hộp lưu tiêu - Dụng cụ bảo hộ lao động cá nhân áo choàng, trang, găng tay… - Các vật liệu khác khay để mẫu, dụng cụ đựng chất thải… - Bút viết kính, sổ sách, biểu mẫu cần thiết… d) Trang thiết bị - Tủ an toàn sinh học cấp II - Máy lắc (votex) Hệ thống MGIT BACTEC Tủ lạnh, tủ mát Nồi hấp ướt (02 cái: hấp bẩn hấp ) Cân (đĩa phân tích) Máy ly tâm: đạt lực ly tâm 3000 x g, cối ly tâm rời có nắp đậy, thích hợp cho - tuýp ly tâm 50 ml, đáy hình chữ V Kính hiển vi C AN TỒN − Tối thiểu nguy nhiễm chéo, thao tác nhẹ nhàng tránh tạo hạt mù, mở − tuýp bệnh phẩm thời điểm Rót nhẹ nhàng dung dịch khử tạp, dung dịch đệm ly tâm, nước sau ly tâm hạn chế bắn tung tóe tạo hạt mù − Xử lý mẫu AFB(+) riêng mẻ khác cuối − Sử dụng pipet vô trùng cho bệnh phẩm, nên dùng pipet nhựa tiệt trùng có chia vạch dùng lần Chuẩn bị lượng dung dịch khử tạp ít, dung dịch đệm chia nhỏ dùng ống − dung dịch đệm/1 mẫu bệnh phẩm D TIẾN HÀNH Chuẩn bị hóa chất a) Dung dịch MycoPrept Thành phần: NaOH: 20 g ; Natri Citrat: 14,5 g ; Nước cất: 1000 ml Hòa tan NaOH Natri Citrat nước cất - Hấp 121 C / 15 phút Chia nhỏ lượng để dùng dần ; Bảo quản nhiệt độ phòng; sử dụng < tháng Hủy phát có vẩn đục, đổi màu b) Dung dịch NALC - NAOH (Chỉ sử dụng ngày) - Cân sẵn NALC theo lượng 50 mg, 100 mg, 200 mg bảo quản ngăn mát – C - Tùy theo số mẫu đờm (tính trung bình ml dung dịch khử tạp cho bệnh phẩm, ml đờm cần 25 mg NALC) - Chuẩn bị dung dịch khử tạp theo bảng sau: - Dung dịch MycoPrep (ml) NALC ( mg) 10 50 20 100 30 150 40 200 50 250 60 300 70 350 80 400 90 450 100 500 c) Chuẩn bị dung dịch đệm Phosphate, pH 6,8 - Dung dịch A: Na2HPO4 9,47 g Nước cất 1000 ml - Dung dịch B: KH2PO4 Nước cất 9,07 g 1000 ml Trộn A B theo tỉ lệ 1/1 thể tích Kiểm tra pH ( 6,8 ÷ 0,2) - Đóng ống 40 ml hấp 121 ºC/15 phút - Bảo quản nhiệt độ phòng Hạn sử dụng tuần d) Chuẩn bị dd bổ sung supplement Hút 15 ml dd supplement vào lọ đựng PANTA/OADC Trộn cho tan hoàn toàn Ghi ngày pha lọ Bảo quản tối – 8oC, sử dụng vòng ngày Lưu ý: Nếu tỉ lệ nhiễm trùng cao, giảm thể tích supplememt xuống 14 13 ml e) Chuẩn bị tuýp MGIT cấy - Cấy 01 ống MGIT / mẫu - Ghi số XN, tên BN, tuổi ngày cấy - Thông tin phù hợp với phiếu XN tuýp BP - Không chạm tay vào mã vạch - Thêm dung dịch bổ sung trước cấy (khi chờ khử tạp ly tâm) - Lắc lọ dd supplement trước sử dụng - Cho 0,8 ml supplement vào ống MGIT - Thao tác vơ trùng tủ ATSH Quy trình ni cấy a) Quy trình cấy áp dụng bệnh phẩm đờm Thêm dung dịch MycoPrep bổ sung NALC ngang thể tích đờm Vặn chặt nắp, votex đến đờm tan hồn tồn (khơng q 20 giây) Lộn ngược tuýp để tiếp xúc toàn mặt tuýp Để đứng 15 phút (ở nhiệt độ phòng) Thêm dd đệm đến vạch 40 - 45ml Ly tâm với lực ly tâm 3000 x g /15 phút Chắc bỏ vào bocan có sẵn chất khử nhiễm Thêm 1ml dung dịch đệm, trộn để tạo huyền dịch Cấy 0,5 ml vào tuýp MGIT (đã bổ sung 0,8 ml PANTA - Supplement) Phết tiêu nhuộm ZN Cho tuýp môi trường vào máy b) Quy trình cấy áp dụng bệnh phẩm khơng xử lí Dịch não tủy, dịch màng phổi, dịch màng bụng, dịch màng tiim, dich khớp Ly tâm lấy cặn (3000 x g/15 p) Cấy 0,5 - ml vào môi trường MGIT Phết tiêu nhuộm ZN Lưu ý: Nếu nghi ngờ dịch không vô trùng xử lý nước tiểu c) Dịch phế quản Thêm dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:1, trộn Ly tâm (3000 x g/15p) lấy cặn Chắc bỏ nước nổi, thêm ml dung dịch đệm Xử lý đờm Nhập ống vào máy MGIT BACTEC Mở ngăn kéo muốn nhập 2.Nhấn phím có biểu tượng cấy có hình mũi tên xuống Đặt mã vạch tuýp cấy vào vị trí quét mã vạch bên góc máy có tiếng bíp Đặt cấy vào vị trí đèn LED sáng xanh ngăn kéo Lặp lại bước từ đến để nhập hết cấy lại Đóng ngăn kéo lại nhập hết tuýp cấy Diễn giải báo cáo kết a)Diễn giải kết từ máy MGIT Máy báo hiệu kết quả: - Dương tính: dấu cộng màu đỏ âm báo bíp bíp - Âm tính: dấu trừ màu xanh - Máy báo lỗi: Đèn nháy màu vàng (dấu chấm than) Lấy tuýp khỏi máy - Khi có đèn báo, mở ngăn kéo có đèn báo - Lấy tuýp có đèn báo đỏ xanh khỏi vị trí giếng - Quét mã vạch - Đóng ngăn kéo  Các tình máy báo kết  Máy báo dương * Trong vòng 24 – 72 h: thường nhiễm trùng * AFB: – 12 ngày  Máy báo âm * Sau tuần * Quét mã vạch, lấy tuýp âm, kiểm tra có tượng vi khuẩn mọc, làm tiêu loại trừ trường hợp máy lỗi không báo dương  Máy báo lỗi: sau có cố xảy b) Nhận định kết Các phương pháp đánh giá kết - Quan sát tượng đục ống MGIT Làm tiêu nhuộm soi Ziehl – Neelsen Định danh : * Test nhanh phát kháng nguyên * Niacin phát Nicotinic * Sinh học phân tử (HAIN – CM/AS) Các tình máy báo dương  Quan sát ống MGIT - Nếu môi trường đục: thường nhiễm trùng Có hạt vụn màu trắng ngà đáy tuýp, lắc lên, hạt vụn vẩn lên môi trường ống MGIT trong: khả mẫu cấy dương tính Lưu ý: tất tuýp báo dương, làm smear tiêu trứng nhuộm Ziehl – Neelsen tìm Cord factor  Làm tiêu trứng nhuộm ZN  Chuẩn bị tiêu gắn albumin trứng Rửa trứng gà, lau cồn Đập lỗ nhỏ đầu trứng, chắt lấy lòng trắng trứng cho vào tuýp 3 Hút ml lòng trắng trứng, ml nươc muối sinh lý (NACl 0,9 %) vào tuýp có nắp xoáy Votex nhẹ mức thấp khoảng -5 phút Nhỏ giọt huyền dịch trứng lên lam kính Dàn tạo tiêu có kích thước 1x2 cm Để tiêu khơ hồn toàn, xếp vào hộp tiêu Bảo quản nhiệt độ phòng sử dụng tuần tránh nhiễm nấm  Làm smear tiêu trứng nhuộm ZN tìm Cord factor Hút cặn đáy (+), nhỏ giọt lên albumin, dàn nhẹ Để khô tự nhiên tủ ATSH Cố định tiêu Nhuộm tiêu theo quy trình nhuộm ZN  Quan sát tiêu nhuộm ZN - Soi định danh vật kính x 10 tìm Cord factor Soi vật kính x 100 cấn quan sát chi tiết Trên tiêu gặp hình ảnh sau biện pháp xử lý: + AFB có dạng cuộn thừng, vụn thành đám, kết dải nhỏ sắc nét rải rác vi trường Tiến hành định danh phương pháp sắc ký miễn dịch tìm kháng nguyên MPT64 + AFB lẫn với vi khuẩn khác nấm: phải khử nhiễm, cấy chuyền sang LJ để theo dõi định danh + Vi khuẩn khác nấm: tuýp cấy ngoại nhiễm, xin lại cấy khác để cấy lại + Các loại tế bào: ủ ấm theo dõi tiếp + Khơng thấy gì: Có thể tiêu bị bong trôi, làm lại tiêu khác, máy báo sai dương, ủ ấm theo dõi tiếp  • Định danh vi khuẩn lao (MTB) Định danh Niacin + Cấy chuyển sang môi trường đặc (LJ) + Thời gian cấy chuyển - tuần • Định danh MPT 64: Nguyên lý Thử nghiệm sắc kí miễn dịch phát kháng nguyên MPT 64 đặc trưng M tuberculosis complex cách nhỏ mẫu cấy dương tính vào giếng thử, kháng nguyên MPT 64 (nếu có mẫu cấy) kết hợp với kháng thể kháng MPT 64 gắn thử tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên, phức hợp di chuyển tới vùng phản ứng giữ lại kháng thể cố định thứ Nếu mẫu cấy có mặt kháng nguyên MPT 64, vùng phản ứng xuất vạch màu hồng - đỏ Cấu tạo thử: Trên bề mặt thử có giếng thử “S” để nhỏ mẫu, cửa sổ đọc kết có ký tự T “Test Line -vạch thử nghiệm” C “Control Line – vạch chứng” Cả vạch T C không xuất trước thực thử nghiệm Sau thử nghiệm vạch chứng ln xuất tiến trình xét nghiệm thực thử tình trạng tốt Vạch thử nghiệm xuất có đủ kháng nguyên MPB64 vi khuẩn lao Nếu mẫu thử khơng có kháng ngun MPT64 có hàm lượng thấp khơng có vạch màu xuất vùng T • Các bước tiến hành Lấy thử khỏi túi, ghi số XN lên thử Trộn nhẹ nhàng canh khuẩn tuýp MGIT pipet vô trùng Nhỏ giọt (hoặc 100 μl) huyền dịch vào giếng thử Huyền dịch thấm từ giếng thử qua vùng T C Đọc kết sau 15 phút Kết quả: + Dương tính với MTB: xuất vạch màu đỏ hồng vị trí T C + Âm tính: Chỉ xuất vạch màu vùng C, khơng có vạch màu vùng T + Không phân biệt kết quả: Khơng có vạch màu vùng C, phải làm lại với test khác  Quy định trả kết Máy báo Soi ZN Dương Vi khuẩn, Định danh MTB nấm Trả kết Ngoại nhiễm AFB (-) Dương Cuộn thừng Dương tính Cuộn thừng, kết Dương M.Tuberculosis dải nhỏ, rải rác AFB vụn Âm tính (lần 1) NTM Cấy thêm mẫu Âm tính (lần 2) NTM Dương AFB lẫn vi khuẩn Dương tính M.Tuberculosis khác, phân lập Khơng thấy  ủ Âm tính ấm theo dõi tiếp  làm lại tiêu  Khơng thấy Âm tính Âm tính E LƯU Ý - Khi xử lý mẫu cấy: Với tube bệnh phẩm có nhiều đờm > 5ml , cần bỏ bớt để tránh xử lý khơng hồn - tồn dễ gây ngoại nhiễm Khơng xử lý mẫu đờm > ml nồng độ NaOH cấy cao, máy báo dương sai Ghi số XN, tên bệnh nhân vào tp, mơi trường, lam kính …trước cấy kiểm tra - đối chiếu thông tin bước • Khi máy báo dương: Máy báo dương cần lấy tube dương ra, in báo cáo tube dương lấy ghi mã • số bệnh nhân lên tờ báo cáo, ghi ngày báo dương tube dương vừa lấy để tiện việc theo dõi Tờ báo cáo in cần lưu vào hồ sơ máy MGIT & có xem xét - trưởng khoa Với mẫu dương nhuộm soi không thấy cần ủ ấm , theo dõi tiếp, 25 ngày làm smear để kiểm tra lại, nên làm đủ lần trước trả kết cuối 3.3.2 Nuôi cấy môi trường đặc A Nguyên lý - Bệnh phẩm phải xử lí trước cấy để loại bỏ vi khuẩn khơng phải Mycobacteria Sau xử lí bệnh phẩm cấy vào môi trường, ủ ấm theo dõi nhiệt độ thời gian thích hợp - Mycobacteria có phát triển thành khuẩn lạc quan sát thấy bề mặt môi trường - Kỹ thuật ni cấy có độ nhạy cao, giới hạn phát 10-100 vi khuẩn /ml bệnh phẩm - Nuôi cấy xác định xác vi khuẩn lao thu thập chủng để phát tính kháng thuốc B Tiến hành Xử lý bệnh phẩm  Bệnh phẩm đờm: phương pháp khử nhiễm thông dụng a Phương pháp cấy ly tâm khử nhiễm NALC– NaOH N-acetyl L-cysteine (NALC) có tác dụng làm tan đờm, NaOH có tác dụng tan đờm khử nhiễm, natri citrat có tác dụng cố định ion kim loại nặng có mặt mẫu đờm để khơng ảnh hưởng tới hoạt tính tan đờm NALC Phương pháp ảnh hưởng đến sống vi khuẩn lao nồng độ NaOH thấp - Chuẩn bị: + Dung dịch NALC – NaOH: Mỗi bệnh phẩm chuẩn bị khoảng ml tương ứng ml đờm + Môi trường Lowenstein – Jeelsen - Các bước thực hiện: + Lấy - ml đờm (ít 2ml, khơng q ml) vào li tâm, thêm lượng ngang dung dịch NALC – NaOH xoáy chặt nắp + Lắc đảo tuýp đờm tan hồn tồn (khơng q 20 giây làm bất hoạt NALC) + Lộn ngược tuýp đờm để hóa chất khử nhiễm tiếp xúc với tồn mặt tuýp + Để đứng tuýp nhiệt độ phòng 15 phút + Thêm dung dịch đệm đến vạch 40 ml, trộn + Li tâm 3000g/15 phút + Chắt bỏ + Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc tạo huyền dịch để cấy b - Phương pháp cấy ly tâm khử tạp NaOH 4% (Petroff cải tiến) Chuẩn bị: + Dung dịch NaOH 4% + Môi trường LJ - Các bước thực hiện: + Lấy 3- ml đờm (ít 2ml không ml) vào tuýp li tâm, thêm lượng ngang dung dịch NaOH 4% xoáy chặt nắp + Lộn ngược tuýp để hóa chất khử nhiễm tiếp xúc với toàn mặt tuýp đến đờm tan hồn tồn (khơng q 20 giây) + Để đứng tuýp nhiệt độ phòng 15 phút + Thêm dung dịch đệm đến vạch 40 ml + Li tâm 3000 g / 15 phút + Chắt bỏ + Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc tạo huyền dịch để cấy c Phương pháp cấy không ly tâm khử tạp NaOH 4% (phương pháp đơn giản) Thường áp dụng với mẫu đờm AFB (+) nhằm mục đích thu thập chủng làm kháng sinh đồ phòng xét nghiệm triển khai ni cấy - Chuẩn bị: + Dung dịch NaOH 4% + Môi trường Ogawa cải tiến - Các bước thực hiện: + Lấy – ml đờm (ít 2ml khơng q ml) vào nắp xốy + Thêm lượng ngang dung dịch NaOH %, vặn chặt nắp + Lắc tuýp đến đờm tan hồn tồn (khơng q 20 giây) + Lộn ngược đờm để hóa chất khử nhiễm tiếp xúc với tồn mặt tuýp + Để đứng tuýp nhiệt độ phòng 15 phút, khơng ly tâm, tạo huyền dịch để cấy Lưu ý: Làm tiêu XNTT trước cho dung dịch khử tạp, không làm tiêu từ huyền dịch cấy Sơ đồ mô tả bước nuôi cấy  Các dịch khác ( dịch não tủy, dịch màng phổi, màng bụng ) - Dịch nhiều, thêm dung dịch đệm theo tỉ lệ 1:1, trộn - Ly tâm 3.000 x g / 15 phút - Chắt bỏ nước - Thêm 0,5-1ml dung dịch đệm, lắc tạo huyền dịch để cấy - Nếu nghi ngờ ngoại nhiễm, xử lý cặn phương pháp NALC-NaOH Lượng dịch < 2ml (thường gặp dịch màng tim, dịch não tủy) không cần li tâm, dịch vô trùng cấy trực tiếp vào môi trường, nghi ngờ ngoại nhiễm, xử lí theo phương pháp NALC-NaOH Cấy vào mơi trường (huyền dịch bệnh phẩm đã khử nhiễm cặn dịch vô trùng sau ly tâm) ủ ấm  Chuẩn bị - Tuýp môi trường phải dán nhãn rõ ràng, ghi đủ thông tin: số cấy, tên bệnh nhân, ngày cấy - Số cấy thống từ tuýp bệnh phẩm, phiếu xét nghiệm, sổ xét nghiệm, tuýp môi trường cấy tiêu - Tp mơi trường có nhiều nước phải hút bỏ nước trước cấy - Mỗi mẫu bệnh phẩm cấy vào tuýp môi trường đặc LJ, (hoặc Ogawa phương pháp đơn giản) - Mỗi mẫu cấy làm tiêu nhuộm soi để đánh giá kĩ thuật cấy  Thao tác cấy ủ ấm - - Sử dụng riêng pipet nhựa vô trùng chia vạch (hoặc pasteur) cho mẫu cấy - Nhỏ vào tuýp môi trường 0,1 ml huyền dịch (tương đương 2-3 giọt) - Đồng thời nhỏ giọt huyền dịch lên lam kính, làm tiêu để nhuộm ZN Láng huyền dịch bề mặt môi trường Để tuýp môi trường nghiêng khay, vặn nắp lỏng Ủ ấm 35-37 0C C DIỄN GIẢI VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ  Quy định thời gian theo dõi định kỳ - Kiểm tra nhiễm trùng : sau 24 – 48h - Sau tuần ủ nghiêng tủ ấm, vặn chặt nắp cấy để ống cấy thẳng đứng - Theo dõi vòng ngày phát Mycobacteria mọc nhanh - Đọc kết cấy hàng tuần đến tuần  Tính chất khuẩn lạc - Khuẩn lạc M tuberculosis điển hình dạng R xốp, màu trắng, mọc chậm sau ngày - Khuẩn lạc nhóm Mycobacteria khơng phải lao (NTM) dạng S trơn bóng, nhày, có (hoặc khơng) sắc tố, mọc nhanh vòng ngày Hình ảnh khuẩn lạc MTB Hình ảnh khuẩn lạc của số loài NTM  Vấn đề ngoại nhiễm Ngoại nhiễm xảy suốt q trình ủ ấm Có loại ngoại nhiễm sau: a) Nhiễm vi khuẩn Thường xảy vòng 24 - 48 h, thờng gặp ống cấy, khử tạp cha đạt, nhiễm trùng rầm rộ, mặt môi trờng nhày, ớt, chí vữa toàn môi trờng Khi nhiễm khun môi trờng chuyển màu, chuyển hoá vi khuẩn sinh acid làm pH môi trờng giảm, chất thị Malachit đổi màu xanh tối, đậm độ màu xanh phụ thuộc lợng vi khuẩn nhiễm môi trờng Khi nhiễm toàn ống cấy M.tuberculosis mọc điều kiện pH thấp, phải huỷ bỏ ống cấy Hiếm gặp nhiễm khuẩn muộn, thờng nhiễm phần ống cấy, tiếp tục trình ủ ấm, có khuẩn lạc lao cần phân lập cấy truyền chủng b) Nhin nm Thờng xảy muộn trình tn đ Êm, thêng nhiƠm tõ mơi trường ủ ấm (tủ ấm, buồng ấm), nÕu ph¸t hiƯn sím nấm mọc rải rác phân lập đợc chủng vi khuẩn lao mọc lẫn môi trờng, phát muộn thờng chủng, nấm mọc kín toàn bé m«i trêng NhiƠm nÊm sím thêng bƯnh phÈm bị nhiễm nấm, dụng cụ hay thao tác, nấm mọc phong phú sau vài ngày đến tuần, ph¶i hủ èng cÊy  Quy định trả kết Kết cấy Kết định Trả kết danh MTB Ngoại nhiễm ống cấy Ngoại nhiễm không phân lập khuẩn lạc lao Dương tính Âm tính Dương tính M.tuberculosis Âm tính NTM (số lượng khuẩn lạc) ( lần 1) Cấy thêm mẫu Âm tính NTM ( mẫu có KQ (lần 2) giống nhau) Âm tính - Mẫu cấy âm tính trả kết sau tuần - Mẫu cấy ngoại nhiễm trả kết phát ngoại nhiễm - Mẫu cấy dương tính phải định danh trước trả kết - Mẫu cấy nghi NTM yêu cầu cấy thêm mẫu khác, mẫu có loại NTM kết cấy có giá trị D LƯU Ý - Để đảm bảo chất lượng cấy XNV phải thực nghiêm ngặt qui trình kỹ thuật, phải đào tạo, có kĩ cần kinh nghiệm - Phải phân loại mẫu trước xử lí: dịch vơ trùng, dịch lẫn máu, đờm tươi, đờm bảo quản, nguồn mẫu từ địa khác MDR, bệnh nhân thường để xử lí thích hợp - Xử lí mẫu sớm tốt Mẫu bảo quản - 0C không 72 giờ, dịch dày, nước tiểu xử lí sớm trước kể từ lấy mẫu - Mỗi mẻ xử lí - mẫu + Ly tâm đủ 3000g/15-20 phút, nhiệt độ 10 C, máy ly tâm thường, nên có khoảng chờ lần ly tâm để nhiệt độ máy giảm xuống + Tn thủ qui trình xử lí: nồng độ hóa chất, thời gian tiếp xúc Xử lí mạnh làm chết vi khuẩn lao, xử lí khơng đạt tăng tỉ lệ ngoại nhiễm Trường hợp đặc biệt tăng thể tích nồng độ hóa chất, khơng kéo dài thời gian khử nhiễm + Tránh nhiễm chéo nhầm lẫn, không mở đồng thời tuýp mẫu Chia nhỏ lượng dung dịch khử nhiễm dung dịch đệm, không chắt trực tiếp dung dịch khử nhiễm hay dung dịch đệm vào bệnh phẩm + Mơi trường, hóa chất, sinh phẩm dụng cụ hạn sử dụng vô trùng + Kiểm tra cẩn thận hành từ khâu nhận bệnh phẩm, vào sổ, trả kết để tránh nhầm lẫn ... - Số cấy thống từ tuýp bệnh phẩm, phiếu xét nghiệm, sổ xét nghiệm, tuýp môi trường cấy tiêu - Tuýp môi trường có nhiều nước phải hút bỏ nước trước cấy - Mỗi mẫu bệnh phẩm cấy vào tuýp môi trường. .. Cấy vào môi trường (huyền dịch bệnh phẩm đã khử nhiễm cặn dịch vô trùng sau ly tâm) ủ ấm  Chuẩn bị - Tuýp môi trường phải dán nhãn rõ ràng, ghi đủ thông tin: số cấy, tên bệnh nhân, ngày cấy. .. lần trước trả kết cuối 3.3.2 Nuôi cấy môi trường đặc A Nguyên lý - Bệnh phẩm phải xử lí trước cấy để loại bỏ vi khuẩn Mycobacteria Sau xử lí bệnh phẩm cấy vào mơi trường, ủ ấm theo dõi nhiệt độ