Xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài trà hoa vàng ở vườn quốc gia tam đảo

Với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, một phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật phân tích ADN đã được nghiên cứu và phát triển sử dụng các đoạn mã vạch ADN đặc trưng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG MINH TRANG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG Ở VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG MINH TRANG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG Ở VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội – 2016

1 PGS.TS Hà Văn Huân

2 PGS.TS Nguyễn Trung Thành

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Hà Văn Huân và PGS.TS Nguyễn Trung Thành Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào

Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn

Học viên

Hoàng Minh Trang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hà Văn Huân – Viện CNSH Lâm nghiệp – Đại học Lâm nghiệp và PGS.TS Nguyễn Trung Thành – Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này Xin được cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước “Xây dựng cơ sở dữ liệu

mã vạch ADN (DNA barcode) cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoài

gỗ có giá trị kinh tế” do PGS TS Hà Văn Huân chủ nhiệm đã hỗ trợ tôi về mọi phương diện để thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu Xin được cảm ơn Ban Quản lý VQG Tam Đảo đã cho phép thu thập mẫu vật làm nguồn vật liệu cho đề tài, cảm ơn chuyên gia thực vật học Lê Thành Cương đã giúp tôi thu thập và nhận dạng các loài Trà hoa vàng trong nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên

Hoàng Minh Trang

1 MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Trà hoa vàng ở Vườn Quốc gia Tam Đảo 3

1.1.1 Điều kiện tự nhiên và đa dạng thực vật ở Vườn Quốc gia Tam Đảo 3

1.1.2 Lược sử nghiên cứu Trà hoa vàng VQG Tam Đảo 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái và phân bố một số loài Trà hoa vàng VQG Tam Đảo 5

1.1.4 Trà hoa vàng và giá trị sử dụng 8

1.2 Tổng quan về mã vạch ADN 9

1.2.1 Giới thiệu về mã vạch ADN (DNA barcode) 9

1.2.2 Một số đoạn mã vạch ADN được sử dụng 12

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân biệt của các mã vạch ADN thực vật 20

1.2.4 Ứng dụng của mã vạch ADN 21

1.2.5 Một số nghiên cứu về mã vạch ADN ở các loài Trà 22

Chương 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 26

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

Chương 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số các mẫu trà hoa vàng 29

3.2 Kết quả PCR các đoạn mã vạch ADN 30

3.3 Giải trình tự và phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN 32

3.3.1 Kết quả giải trình tự 33

3.3.2 Khoảng cách di truyền trong và giữa các loài 58

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 64

1 Kết luận 64

2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng 26Bảng 3.1 Mẫu vật nghiên cứu 29Bảng 3.2 Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu ADN tổng số (pha loãng 10 lần) 30Bảng 3.3 Đánh giá trình tự các đoạn mã vạch thu được 33

Bảng 3.4 So sánh trình tự đoạn matK giữa các loài Trà hoa vàng 34 Bảng 3.5 So sánh trình tự matK giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu 36 Bảng 3.6 Mức độ tương đồng đoạn matK các loài Trà nghiên cứu với một số loài

khác 37

Bảng 3.7 So sánh trình tự đoạn rbcL giữa các loài Trà hoa vàng 39 Bảng 3.8 So sánh trình tự rbcL giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu 41 Bảng 3.9 Mức độ tương đồng đoạn rbcL các loài Trà nghiên cứu với một số loài

khác 41Bảng 3.10 So sánh trình tự đoạn trnH-psbA giữa các loài Trà hoa vàng 44

Bảng 3.11 So sánh trình tự trnH-psbA giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu 45 Bảng 3.12 Mức độ tương đồng đoạn trnH-psbA các loài Trà nghiên cứu với một số

loài khác 46Bảng 3.13 So sánh trình tự đoạn ycf1b giữa các loài Trà hoa vàng 49

Bảng 3.14 So sánh trình tự ycf1b giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu 51 Bảng 3.15 Mức độ tương đồng đoạn ycf1b các loài Trà nghiên cứu với một số loài

khác 51Bảng 3.16 So sánh trình tự đoạn ITS2 giữa các loài Trà hoa vàng 54Bảng 3.17 So sánh trình tự ITS2 giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu 55Bảng 3.18 Mức độ tương đồng đoạn ITS2 các loài Trà nghiên cứu với một số loài khác 55Bảng 3.19 Khoảng cách di truyền của từng đoạn mã vạch riêng rẽ và khi kết hợp các đoạn mã vạch 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hệ gen lục lạp một số loài thuộc chi Camellia [94] 24

Hình 2.1 Chu trình nhiệt nhân bản đoạn mã vạch ADN 28

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số các mẫu Trà hoa vàng 29

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR các đoạn mã vạch ADN 32

Hình 3.3 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen matK 38

Hình 3.4 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen rbcL 43

Hình 3.5 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn trnH-psbA 48

Hình 3.6 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn ycf1b 53

Hình 3.7 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn ITS2 57

Hình 3.8 Khoảng cách di truyền các đoạn mã vạch 58

Hình 3.9 Cây phân loại sinh học dựa trên sự kết hợp một vài trình tự mã vạch 63

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Tên viết tắt Tên đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

3 ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm giữa các vùng

phiên mã

5 NCBI National Center for

carboxylase large subunit

Tiểu đơn vị lớn enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase

0 MỞ ĐẦU

Trà hoa vàng thuộc chi Trà Camellia (họ Theaceae, bộ Ericales) có hoa màu

vàng, được phát hiện lần đầu tiên ở Việt Nam vào những năm đầu thế kỉ XX Cho đến nay các nhà khoa học đã phát hiện ra khoảng trên 30 loài Trà hoa vàng, trong đó

có 28 loài được tìm thấy ở Trung Quốc và 24 loài tìm thấy ở Việt Nam [2] Các loài trà hoa vàng có giá trị lớn về mặt dược liệu, được biết đến với tác dụng kiềm chế sinh trưởng khối u, ngăn ngừa ung thư, giảm lượng cholesterol và lipoprotein trong máu

do có các nguyên tố vi lượng như Germanium (Ge), Selenium (Se), Mangan (Mn)… Ngoài ra trà hoa vàng còn có giá trị thẩm mỹ cao, được trồng làm cây cảnh do có hoa lớn màu vàng đặc trưng [5]

Ở Việt Nam, Trà hoa vàng được phát hiện chủ yếu ở một số địa phương như VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc), VQG Cúc Phương (Ninh Bình), Phước Lộc (Lâm Đồng)… [21, 65, 67], trong đó ở VQG Tam Đảo phát hiện ra 8 loài với một số loài

đặc hữu của Việt Nam như Camellia tamdaoensis, Camellia crassiphylla, Camellia

petelotii … [63, 65] Đây là nguồn gen vô cùng quý hiếm cho hệ thực vật ở Tam Đảo

nói riêng và Việt Nam nói chung, cần được bảo vệ và phân loại để đưa ra biện pháp thích hợp cho việc bảo tồn nguồn gen, đa dạng sinh học Tuy nhiên, hiện nay Trà hoa vàng ở Tam Đảo đang bị đe dọa nghiêm trọng do việc khai thác quá mức từ phía người dân, đồng thời việc bảo tồn và nghiên cứu còn chưa được chú ý nhiều [65]

Cho đến nay, việc phân loại thực vật nói chung và các loài thuộc chi Trà nói riêng chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu bên trong [94] Việc phân loại này trong một số trường hợp gặp nhiều khó khăn do một số loài Trà hoa vàng có đặc điểm hình thái tương đối giống nhau Với sự phát triển của sinh học phân

tử và công nghệ gen, một phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật phân tích ADN đã được nghiên cứu và phát triển sử dụng các đoạn mã vạch ADN đặc trưng cho loài (DNA barcode) [17] Phương pháp này trở thành công cụ đắc lực cho các nhà khoa học trong việc phát hiện loài mới, phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ

di truyền các loài Mỗi đoạn mã vạch ADN có đặc trưng riêng và có khả năng phân

biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau (chi, loài, dưới loài) Một số đoạn Mã vạch

ADN được sử dụng phổ biến ở thực vật có thể kể đến như matK, rbcL, trnH-psbA,

rpoB, rpoC1, psbI-psbK, atpF-atpH, trnL-trnF [40, 47, 94]

Với mục xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử cho các loài Trà hoa vàng ở VQG

Tam Đảo, cụ thể là 5 loài Hải đường vàng (Camellia tienii Ninh), Trà vàng Hakoda (Camellia hakoda Ninh, Tr.), Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda), Trà vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoesis Hakoda et Ninh), Trà vàng Petelo (Camellia petelotii (Merr.) Sealy), đề xuất mã vạch thích hợp đặc trưng cho các loài

trà này thông qua việc xác định và phân tích trình tự của một số đoạn mã vạch, tác

giả tiến hành đề tài “Xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài Trà hoa

vàng ở Vườn Quốc gia Tam Đảo” với đối tượng phân tích là năm vùng trình tự

rbcL, matK, ycf1b, trnH – psbA và ITS2 Kết quả thu được sẽ đóng góp vào Ngân

hàng gen Quốc tế để giám định các loài Trà hoa vàng, xác định mối quan hệ di truyền

giữa các loài Trà hoa vàng với nhau và với các loài trong chi trà Camellia, nâng cao

hiệu quả bảo tồn và phát triển các loài Trà hoa vàng quý hiếm ở không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới

1 Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Trà hoa vàng ở Vườn Quốc gia Tam Đảo

1.1.1 Điều kiện tự nhiên và đa dạng thực vật ở Vườn Quốc gia Tam Đảo

Vườn Quốc gia (VQG) Tam Đảo có vị trí địa lý nằm ở phía bắc đồng bằng Bắc Bộ, từ 21 độ 21' đến 21 độ 42' vĩ Bắc và 105 độ 23' đến 105 độ 44' kinh Đông, nằm trên địa phận 3 tỉnh: Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Tuyên Quang, chiếm giữ toàn bộ

hệ núi Tam Đảo, chạy dài theo hướng Tây Bắc – Đông Nam Đây Khối núi có đặc điểm chung là đỉnh nhọn, sườn dốc, độ chia cắt sâu và dầy, tạo nên các dạng địa hình khác biệt Khí hậu VQG Tam Đảo nằm trong vùng khí hậu ẩm nhiệt đới, hai sườn đông tây ngăn cách cùng với sự thay đổi về lượng mưa hàng năm đã tạo nên sự đa dạng về các tiểu vùng khí hậu cho khu vực này Phong phú về dạng địa hình, chia vùng khí hậu và đa dạng về mặt thổ nhưỡng là nguyên nhân chính đã tạo ra sự đa dạng về các hệ sinh thái rừng, các quần xã sinh học và đa dạng về loài của rừng Tam Đảo Dựa trên cơ sở các cuộc điều tra, khảo sát đã thống kê được cho đến năm 2005, VQG Tam Đảo có 1436 loài thuộc 741 chi, 219 họ, 6 ngành thực vật bậc cao Trong

số đó, ngành Mộc lan (Magnoliophyta) có số loài nhiều nhất (1149 loài), ngành Cỏ tháp bút (Equisetophyta) có số loài ít nhất (1 loài) Trong số các loài thực vật ở VQG Tam đảo, có 68 loai đặc hữu và 58 loài quý hiếm được ghi vào sách đỏ Việt Nam hay theo tiêu chuẩn của Liên minh bảo tồn thiên nhiên Quốc tế IUCN [102] cần được bảo

tồn như Lan hài tam đảo (Paphiopedilum gratrixianum), Trà vàng tam đảo (Camellia

tamdaoensis), Trà vàng petelo (Camellia petelotii), Kim giao (Nageia fleuryii)

Trong số đó, đa dạng về các loài trà nói chung và Trà hoa vàng nói riêng nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu không chỉ trong nước mà còn mở rộng ra phạm vi quốc tế [5]

1.1.2 Lược sử nghiên cứu Trà hoa vàng VQG Tam Đảo

Trà hoa vàng nói riêng và các loài thuộc chi trà Camellia nói chung ưa khí hậu

nóng ẩm, thường mọc ở nơi đất tơi xốp bên bờ suối có bóng râm, thoát nước tốt Với khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa vùng núi cao, địa hình phân hóa mạnh và đa dạng tạo

nên các thung lũng ẩm ướt, VQG Tam Đảo trở thành khu bảo tồn có số lượng loài trà phong phú nhất ở Việt Nam Cho đến nay đã tìm ra 16 loài và 1 thứ thuộc chi trà được tìm thấy ở đây, trong đó có 8 loài trà hoa vàng phân bố rải rác trong dãy núi Tam Đảo [65]

Loài Trà hoa vàng đầu tiên được tìm thấy ở VQG Tam Đảo là loài trà vàng

petelo Camellia petelotii bởi thầy thuốc người Pháp Alfred Petelot vào năm 1923

Trong những năm của nửa đầu thế kỷ 20, nhiều cuộc khảo sát và thu thập đã được

tiến hành trong đó có các loài thuộc chi Camellia [5] Tháng 01 năm 1998 trong đợt khảo sát sự đa dạng sinh học chi Camellia ở VQG Tam Đảo, PGS.TS Trần Ninh cùng

với GS Hakoda Naotoshi trường đại học Tokyo (Nhật Bản) đã công bố 3 loài trà mới

trong đó có loài trà vàng lá dày Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda Các loài mới

này được công bố trong tạp chí Trà quốc tế (International Camellia Journal) [64][101] Dựa trên các tài liệu tham khảo và nghiên cứu của tác giả, năm 2002 PGS.TS Trần Ninh đã công bố trên tạp chí Trà quốc tế 50 loài trà ghi nhận có mặt ở Việt Nam Trong số 50 loài đó có 12 loài trà gặp ở VQG Tam Đảo Trong nhiều năm tiếp theo PGS.TS Trần Ninh đã tiến hành nhiều đợt khảo sát ở các địa điểm khác nhau của VQG Tam Đảo Năm 2007 trong tạp chỉ khoa học trường ĐHQG Hà Nội, ông

cho công bố 2 loài trà hoa vàng mới đó là Camellia hakoda Ninh và Camellia

tamdaoensis Ninh et Hakoda Năm 2008 PGS.TS Trần Nình cùng đồng nghiệp đã thu

thập được thêm 3 loài ở VQG Tam Đảo, trong đó có 2 loài Trà hoa vàng lần đầu tiên

được tìm thấy ở đây là Camellia hirsuta Hakoda et Ninh, Camellia phanii Hakoda et

Ninh [5] Cho đến nay, 8 loài Trà hoa vàng đã được phát hiện ở VQG Tam Đảo là các loài:

 Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda (Trà vàng lá dày)

 Camellia gilberti (A.Chev.) Sealy (Trà vàng ginbec)

 Camellia hakodae Ninh (Trà vàng hakoda)

 Camellia hirsuta Hakoda et Ninh (Trà vàng nhiều lông)

 Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Trà vàng petelo)

 Camellia phanii Hakoda et Ninh (Trà vàng phan)

 Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh (Trà vàng tam đảo)

 Camellia tienii Ninh, Tr (Hải đường vàng) [65]

Trong số đó có một số loài đặc hữu của Việt Nam như Camellia crassiphylla,

Camellia hakodae, Camellia tamdaoensis… Tuy đa dạng về loài nhưng phân bố của

các loài trà hoa vàng ở VQG Tam Đảo lại khá hẹp trừ loài Camellia gilberti Hai loài

Camellia tamdaoensis và Camellia tienii phân bố ở sườn dốc phía Tây Nam dãy núi

Tam Đảo, ở độ cao 200 – 600m Trong khi đó, các loài Camellia hakodae, Camellia

hirsuta, Camellia phanii lại thường được tìm thấy ở phía đông nam Đăc biệt, loài

Trà vàng petelo (Camellia petelotii) – loài đặc hữu của VQG Tam Đảo là loài trà hoa

vàng duy nhất ở Bắc Việt Nam phân bố ở độ cao trên 900m Hiện nay, với hệ thống bảo vệ còn lỏng lẻo và chưa được quan tâm đúng mức, số lượng cá thể của các loài trà hoa vàng sụt giảm đáng kể do việc khai thác quá mức từ phía người dân do các loài trà này có giá trị kinh tế rất lớn [65]

1.1.3 Đặc điểm hình thái và phân bố một số loài Trà hoa vàng VQG Tam Đảo

Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda (Trà vàng lá dày)

Cây gỗ nhỏ; cao 3-5 m Lá có cuống dài, không lông, phiến lá hình bầu dục rộng hoặc bầu dục, xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới, có nhiều điểm tuyến màu đen, lá dày, gốc lá tròn hoặc tim nông, chóp lá tù, mép lá có răng cưa lõm nông, gân bên 8-9 cặp Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 4-4,3 cm Lá đài 5, có lông Tràng hoa gồm 9-10 cánh, các cánh bên ngoài có lông mịn ở mặt lưng, các cánh bên trong hình bầu dục thuôn, có lông mịn Quả hình cầu dẹp, khía 3 rãnh Quả 3 ô, 1-3 hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 2-3 mm

Mùa ra hoa: Mùa đông đến đầu xuân

Sinh thái: Mọc rải rác trong thung lũng rừng thường xanh ở độ cao 500-600 m [5, 65]

Camellia hakodae Ninh (Trà vàng hakoda)

Cây gỗ nhỏ, cao 3-4 m Cành non màu nâu nhạt, nhẵn Phiến lá hình bầu dục, bầu dục rộng hoặc thuôn, xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới với nhiều điểm tuyến màu đen, cả hai mặt đều không lông, mép lá có răng cưa nhỏ cách đều nhau, hệ gân lõm ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 6-8 cm Lá đài 5, hình vẩy đến gần tròn, mép

và mặt trong có lông Tràng hoa gồm 16-17 cánh, gần tròn đến bầu dục, có lông ở mặt trong và thưa dần ở các cánh bên trong Quả gần dạng cầu, 3-4 hạt trong mỗi ô,

vỏ quả dày 4,5-6,5 mm Hạt dài 2,2 cm, có lông

Mùa ra hoa: Đầu mùa đông tới đầu xuân

Điều kiện sinh thái: Mọc trong thung lũng của rừng thường xanh ở độ cao

Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Trà vàng petelo)

Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, cao 3-5 m, cành non màu xám nhạt, nhẵn Lá có cuống, hình bầu dục thuôn, đôi khi hình bầu dục hoặc thuôn, mặt trên phiến lá màu xanh đậm, mặt dưới xanh sáng với nhiều điểm tuyến màu nâu nhạt, nhẵn, gốc lá hình nêm hoặc nêm rộng, chóp lá có mũi nhọn mép lá có răng cưa nhọn nhưng cách nhau không đều Hoa màu vàng, mọc đơn độc ở đầu các cành non, đường kính khi nở khoảng 4,7 cm Cuống hoa to, lá đài 5, hình trứng rộng ngược Cánh hoa gồm 14 cánh, hình trứng rộng ngược, bầu dục Cánh hoa bên ngoài có lông mịn màu trắng ở mặt ngoài, tất cả hợp với nhau và với bộ nhị khoảng 8 mm ở gốc Quả hình cầu dẹt Hạt dài 1-2 cm, có lông

Mùa ra hoa: Mùa đông tới đầu mùa xuân năm sau

Sinh thái: Mọc trong rừng thường xanh ở độ cao 950-1100 m

Phân bố: Vĩnh Phúc, VQG Tam Đảo Loài đặc hữu của Việt Nam [5, 65]

Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh (Trà vàng tam đảo)

Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, cao 2 - 4 m, cành non màu nâu nhạt, có lông mịn, cành già nhẵn Lá có cuống nhẵn phiến lá hình bầu dục thuôn hoặc bầu dục rộng, dài, mặt trên phiến lá màu xanh đậm, láng, không lông, mặt dưới màu xanh tía đỏ, không lông, có nhiều điểm tuyến màu nâu đen Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 3,5-4 cm Cuống hoa dài 5-7 mm Lá bắc 5 Lá đài 5, hình móng hay gần tròn, có lông ở mặt trong và mép Cánh hoa gồm 11-12 cánh, gần tròn, trứng ngược hoặc bầu dục Quả hình cầu dẹt, khía 3 rãnh, đường kính

4 cm, cao 2,3 cm Quả 3 ô, 3 hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 2 mm Hạt có dạng bán cầu hay nêm, vỏ hạt nhẵn

Mùa ra hoa: Mùa đông

Điều kiện sinh thái: mọc trong những thung lũng ẩm ướt trong rừng nhiệt đới

ở độ cao 300-400 m,

Phân bố: Vĩnh Phúc (VQG Tam Đảo) Đây là loài đặc hữu của Việt Nam [5, 65]

Camellia tienii Ninh, Tr (Hải đường vàng)

Cây gỗ nhỏ, thân màu trắng nhợt, cao 2,5 m Cành và lá non màu tím, không lông Lá có cuống gần trònx, không lông, lá dạng da, dày, phiến lá thuôn, cả hai mặt đều không có lông, mặt trên láng, mặt dưới có nhiều tuyến màu đen Hoa màu vàng, mọc ở nách lá, kích thước 5-6 cm Lá đài 5, hình vẩy đến gần tròn, cao 3-7 mm, rộng 8-10 mm, có lông ở mép Cánh hoa 14, các cánh ngoài phủ nhiều lông, các cánh còn lại có lông thưa, mặt trong của tất cả các cánh đều không lông, hình dạng cánh hoa thay đổi từ ngoài vào, các cánh từ gần tròn, bầu dục hay bầu dục thuôn

Mùa ra hoa: Mùa đông tới đầu xuân

Điều kiện sinh thái: Mọc ven suối trong rừng thường xanh núi thấp ở độ cao 250m

Phân bố: Vườn Quốc gia Tam Đảo [5, 65]

Đồ uống từ lá, hoa trà

Đây là một giá trị đáng kể và phổ biến không chỉ với trà hoa vàng mà còn đối

với các loài thuộc chi Trà Camellia nói chung Từ những năm trước Công nguyên,

người Trung Quốc đã sử dụng trà như một thứ nước uống và trà được phổ biến ở nhiều nước châu Á sau đó Với một số đất nước như Nhật Bản, Trung Quốc, thức uống từ trà đã trở thành một nét văn hóa đặc trưng Ở Việt Nam cây trà cũng được trồng từ khá lâu, hầu như tỉnh nào cũng có cây trà Tuy nhiên, phổ biến hiện nay vẫn

là các loài Trà xanh, Trà hoa vàng còn chưa được biết đến nhiều Một ưu điểm so với trà xanh thông thường đó là chiết suất từ lá Trà hoa vàng không chứa caffein vốn là một chất chiếm tỷ lệ đáng kể ở trà xanh [5]

Tách dầu từ hạt trà

Hạt của các loài trà có thể dùng để chưng cất dầu Ở Trung quốc và Nhật Bản, dầu ăn chiết từ hạt trà khá phổ biến Dầu của hơn 200 loài thuộc chi trà đã được sử dụng làm thực phẩm và dung cho các ngành công nghiệp khác Ngoài ra, một số hợp chất trong lá và quả trà như acid tanic, oleic acid … là những thành phần quan trọng được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm [5]

Giá trị dược liệu của trà hoa vàng

Giá trị dược liệu là giá trị đáng quý nhất của cây Trà hoa vàng Ngày nay, các công trình khoa học đã chỉ ra ngày càng nhiều công dụng của cây trà Riêng đối với trà hoa vàng, các nghiên cứu đã cho thấy trà hoa vàng có khả năng kiềm chế sự sinh trưởng của các khối u đến 33,8% Ngoài ra nó còn giúp giảm đến 35% hàm lượng cholesterol, 36,1% lượng lipoprotein trong máu, cao hơn 10% so với các biện pháp

sử dụng tây dược hiện nay Các chế phẩm từ trà hoa vàng có khả năng làm giảm biểu hiện triệu chứng xơ vữa động mạch, điều hòa huyết áp Bên cạnh đó, một số bệnh về đường hô hấp, bài tiết đều có thể sử dụng thức uống nay như một phương pháp chữa trị đơn giản và sớm mang lại kết quả

Đất nước Trung Quốc từ lâu đã khai thác tiềm năng to lớn từ giá trị dược liệu

của cây trà hoa vàng Họ đã xây dựng nên Vườn Camellia Quốc tế, trồng nhân tạo

vùng Trà hoa vàng nguyên liệu, nghiên cứu và sản xuất thành công các chế phẩm từ trà hoa vàng như Golden Camellia, Superior tea… là những mặt hàng có giá trị và đem lại nguồn lợi nhuận khổng lồ hàng năm Việt Nam cũng là một trong số các nước

có số loài trà hoa vàng phong phú bậc nhất trên thế giới, tuy nhiên việc nghiên cứu ứng dụng và khai thác giá trị dược liệu của các loài này còn chưa được chú trọng Công tác bảo tồn chưa được tốt, lượng cá thể tự nhiên hàng năm suy giảm đáng kể là một thực trạng đáng buồn và đe dọa trực tiếp đến nguồn gen quý giá này [5]

Giá trị thẩm mỹ - làm cây cảnh

Chi trà là chi có hoa lớn, đẹp, nhiều màu sắc, một số loài hoa nở đúng vào dip Tết Nguyên đán nên thường được sử dụng để chơi như cây cảnh Việc lai tạo, phối hợp các màu hoa cũng như thu hút sự chú ý của các nhà lai tạo, làm tăng giá trị của cây trà lên nhiều lần nếu có thể tạo ra giống trà có màu hoa hiếm và độc đáo [5]

1.2 Tổng quan về mã vạch ADN

1.2.1 Giới thiệu về mã vạch ADN (DNA barcode)

Phân loại thực vật từ lâu đã chứng minh được vai trò quan trọng trong việc làm nền tảng cho các nghiên cứu về sinh thái, tiến hóa và đa dạng thực vật Phương pháp phân loại truyền thống được xây dựng và phát triển xưa nay là phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái các loài thực vật Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt hình thái của các cơ quan thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy đây chưa phải là phương pháp tối ưu trong việc phân loại các mẫu đang trong giai đoạn phát triển, các mẫu có đặc điểm giống nhau do hiện tượng tiến hóa đồng quy, các mẫu không có đủ các bộ phận [3]… Ngoài

ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [31] Khắc phục những hạn chế của phương pháp phân loại hình thái, từ giữa những năm 1990, một phương pháp loại mới dựa trên lĩnh vực sinh học phân tử đã được hình thành Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân (ADN) hoặc sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [83] Trong phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi Một số kỹ thuật có thể kể đến được sử dụng phổ biến trên thế giới như RFLP (đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế), VNTR (số lượng thay đổi các chuỗi lặp lại liền kề), DNA barcode (mã vạch ADN) [41, 42]

Năm 2003, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Canada – Paul Hebert - đã đề xuất một phương pháp xác định loài dựa trên mã vạch ADN (DNA barcode) [31] Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay đổi theo quá trình tiến hóa [31, 46] Ngoài ra việc lựa chọn một vùng trình tự làm mã vạch ADN còn cần phải mang những đặc điểm sau: có độ dài thích hợp (không quá ngắn để có độ đa hình về trình tự giữa các taxon, không quá dài để có thể giải trình tự theo cách thông thường, thậm chí cả khi trong điều kiện chưa được tối ưu); không phải vùng dị hợp

để có thể nhân bản trực tiếp trình tự mà không cần tách dòng; thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt các base và không có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài đoạn lặp microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [36] Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật, tương tự như máy quét mã vạch trong siêu thị [60] Hai mẫu vật của hai loài

có thể có hình thái bên ngoài rất giống nhau, song chúng có thể được phân biệt bằng cách sử dụng mã vạch ADN Với ưu thế đó, mã vạch ADN có thể được sử dụng cho

hai mục đích chính: nhận dạng về mặt phân tử cho các loài đã được mô tả [90] và tìm

ra các loài mới chưa được mô tả [33]

Mã vạch ADN là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus [29, 34,

50, 79] Việc xác định loài bằng mã vạch ADN có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ

sở để định danh hoặc phân biệt loài [15, 81]

Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém nhiều công sức và kinh phí nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện được Thay vào đó, việc xác định một đoạn DNA đã biết, đặc trưng cho loài (thậm chí cá thể) để làm căn cứ phân biệt cá thể này với cá thể khác, loài này với loài khác

là giải pháp hiệu quả trong phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học Vì vậy, hướng nghiên cứu mã vạch ADN đang được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định loài, giám định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây trồng, vật nuôi, sản phẩm nông - lâm - thủy sản,…)[43]

Việc sử dụng mã vạch ADN để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩa ngày càng lớn Cho đến nay, sau hơn 10 năm nghiên cứu đã có trên 6000 công trình khoa học được công bố với khoảng 5 triệu trình tự Mã vạch ADN ở các loài sinh vật theo số liệu của BOLD [98] Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng mã vạch ADN, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [39, 54, 97]

Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

- Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự)

- Trình tự có tính đặc hiệu cao

- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [39]

Mỗi đoạn mã vạch có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật

ở các mức độ khác nhau: chi, họ, loài hay dưới loài Các đoạn mã vạch ADN có thể

là những đoạn nằm trong hệ gen nhân (18S, 5.8S, 26S, ITS…)[8, 18, 19, 78], hệ gen

ty thể (Cytb, CO1…)[8, 12, 34], hệ gen lục lạp (matK, rbcL, trnH – psbA ) [36, 38,

58, 85] Tuy nhiên, chưa có đoạn ADN nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất

cả các loài sinh vật, thay vào đó cần lựa chọn những đoạn ADN đặc trưng và việc phối hợp các đoạn mã vạch ADN sẽ đem lại hiệu quả cao hơn [25, 27] Tùy vào đối tượng giám định mà các đoạn mã vạch ADN sẽ được sử dụng một cách hợp lý [16,

sự sai khác trong loài, tuy nhiên phải đủ nhanh để có thể phân biệt những cá thế khác loài [31, 37] Ở động vật, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể là vùng gen có ưu thế hơn trong việc lựa chọn ra các locus là mã vạch ADN do có tốc độ tiến hóa nhanh [13, 75] Hệ gen ty thể (mtDNA) ở động vật là một vòng xoắn kép bao gồm 13 gene mã hóa protein, 2 gen ribosome, vùng điều hòa không mã hóa protein và các gen mã hóa tRNA Mỗi tế bào có thể có một vài ty thể, do vậy trong trường hợp phân tích một lượng mẫu nhỏ, hệ gen ty thể cho thấy ưu thế hơn do có nhiều bản sao của trình tự quan tâm [84, 89]

Cytochrome c oxidase là một họ protein xuyên màng lớn được tìm thấy ở ty

thể, là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp [92] Protein này bao gồm một vài tiểu đơn vị có nguồn gốc từ nhân và 3 tiểu đơn vị được tổng hợp từ ty thể Các tiểu đơn vị ở ty thể được biết đến là các tiểu đơn vị I, II, III, trong đó tiểu đơn vị COI chủ yếu được gắn trên màng của mào ty thể [68, 89] Các nucleotide của gen mã hóa cho tiểu đơn vị này có sự biến đổi đủ để phân biệt giữa các loài Ngược lại, sự biến đổi trong loài thường thấp hơn 10% so với quan sát ở các loài khác nhau [34] Cùng với việc đột biến mất đoạn hay thêm đoạn ít khi xảy ra, đoạn trình tự COI là sự lựa chọn phù hợp và được sử dụng rộng rãi để làm mã vạch ADN ở động vật [89]

Do có sự khác biệt lớn ở hệ gen ty thể giữa các loài nên cặp mồi được thiết kế

để sử dụng nhân bản đoạn CO1 ở từng loài cũng khác nhau [56, 87] Tuy nhiên khi

cặp mồi được thiết kế phù hợp với trình tự, hiệu quả sử dụng gene COI để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài Nhiều nghiên cứu đã được thử

nghiệm và đưa ra hiệu quả của mã vạch CO1 trong phân loại các nhóm động vật đa

dạng, phân bố trên đất liền cũng như dưới biển, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới, giúp phân biệt được khoảng 98% các loài với nhau Trong phần còn lại, nó xác định hẹp đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, các loài chỉ vừa mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên [32, 34, 89] Ở động vật ngoài locus

gen COI còn có một vài đoạn trình tự khác cũng được sử dụng làm Mã vạch ADN như đoạn Cytb (cytochrome b), đoạn gene mã hóa ARN ribosome 12S, 16S… Đây

đều là những đoạn trình tự thuộc hệ gen ty thể và có mức độ sai khác lớn giữa các

loài, từ đó có thể cùng với đoạn COI đem lại khả năng giám định và nhận diện các

loài tốt hơn [8, 31]

Mã vạch ADN ở thực vật

Khác với ở động vật, hệ gen ty thể không phù hợp để lựa chọn ra các đoạn mã vạch ADN do hệ gen này tiến hóa chậm ở thực vật [29, 36] Thay vào đó, một số vùng trình tự trong hệ gen lục lạp đã được nghiên cứu và chứng minh có khả năng

phân biệt tốt ở các loài thực vật và nghiên cứu phát sinh loài [11, 36, 66] Hệ gen lục lạp được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1962 Lượng ADN ở hệ gen lục lạp tương đối lớn, chiếm khoảng 15% tổng lượng ADN của tế bào Phần lớn các hệ gen ở lục lạp là một phân tử ADN dạng mạch vòng, dài khoảng 120000-170000bp với khoảng

100 gen mã hóa protein và các gen mã hóa tRNA và rRNA [20, 80] Một đặc điểm của hệ gen lục lạp đó là có các trình tự lặp đảo ngược với chiều dài có thể lên tới 25000bp [45] Ngoại trừ một vài trường hợp ngoại lệ, hệ gen lục lạp thường bao gồm hai trình tự lặp đảo ngược như hai tấm gương phản chiếu lẫn nhau Hai vùng trình tự này được ngăn cách bởi vùng trình tự đơn bản lớn và nhỏ Nghiên cứu thực nghiệm

đã cho thấy tỷ lệ nucleotide thay thế ở vùng đơn bản thường cao gấp 2,3 lần so với vùng lặp lại đảo ngược, do đó phần lớn các nghiên cứu về mã vạch ADN thường tập trung ở vùng trình tự đơn bản [80] Các gen thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có thể được chia thành 3 nhóm như sau: Nhóm 1 là các gen mã hóa những yếu tố thuộc

hệ thống quang hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB ), cytochrome b6f (petA, petB ), ATP synthase (atpA, atpB ), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenease (ndhA, ndhB ); Nhóm 2 là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16,

rrn5 ), trnA (trnH, trnK ), RNA polymerase (rpoA, rpoB ), các gen tiểu phần

ribosome (rps2,rps3 ); và nhóm 3 gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng) và các gen mã hóa protein như matK, cemA Mỗi đoạn mã vạch ADN có

những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau Ví

dụ, các đoạn ADN như: 18S, 16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và

chi; các đoạn ADN, như: 26S, rbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn ADN, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức

loài và dưới loài [99] Cho đến nay đã có 7 dấu chuẩn gen lục lạp được sử dụng rộng

rãi làm Mã vạch ADN cho thực vật, bao gồm 4 đoạn trình tự mã hóa là matK, rbcL,

rpoB, rpoC1 và 3 đoạn không mã hóa là atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI [29, 36,

39] Ngoài các đoạn mã vạch trong hệ gen lục lạp, một đoạn trình tự khác trong hệ gen nhân cũng được sử dụng rộng rãi làm dấu chuẩn nhận biết ở thực vật đó là đoạn ITS Đây là đoạn trình tự cho thấy mức độ khác biệt tương đối lớn giữa các loài bên

cạnh các trình tự trong hệ gen lục lạp [38, 39] Mỗi đoạn mã vạch đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, do đó tùy vào từng trường hợp để có thể lựa chọn đoạn Mã vạch ADN cho phù hợp hoặc kết hợp nhiều đoạn mã vạch với nhau nhằm nâng cao hiệu quả trong việc giám định và nghiên cứu phát sinh loài ở thực vật [48, 53]

Đoạn trình tự matK là một trong những đoạn trình tự tiềm năng nhất được sử dụng làm Mã vạch ADN ở thực vật [48] Đoạn matK có độ dài xấp xỉ 1570bp và mã

hóa cho protein maturase K Trình tự này nằm bên trong đoạn intron của đoạn gen

trnK ở lục lạp và nằm trên vùng trình tự đơn bản lớn [97] Ờ loài cây mô hình Arabidopsis thaliana đoạn mã vạch matK có độ dài 801bp, nằm ở vị trí 205-1046 của

đoạn gen [39] Với mức độ tiến hóa cao, đoạn matK được sử dụng để xây dựng nên

hệ thống phát sinh của những taxon bậc cao như bộ và họ, một vài trường hợp ở

những bậc thấp hơn là chi và loài [97] Ưu điểm của đoạn trình tự matK là có khả

năng phân biệt tốt, tuy nhiên nhược điểm của đoạn trình tự này đó là khó khuếch đại, đặc biệt là khi đối tượng nghiên cứu không phải là thực vật hạt kín [29, 36, 39]

Để khắc phục nhược điểm trên của trình tự matK, nhóm nghiên cứu CBOL đã

đề xuất một mã vạch cốt lõi bao gồm hai vùng trình tự trong hệ gen lục lạp là

matK+rbcL [29] Đoạn trình tự rbcL mã hóa cho enzyme Rubisco tham gia vào quá

trình cố định carbon ở thực vật, có chiều dài 599bp ở đầu 5’ của gen trong hệ gen lục

lạp của loài Arabidopsis thaliana [39] Ưu điểm của đoạn trình tự này là dễ khuếch

đại ở phần lớn thực vật và được biết đến như một locus chuẩn trong nghiên cứu hệ thống phát sinh loài bởi nó đưa ra một vị trí đáng tin cậy cho taxon trong các họ hay chi thực vật [46] Mặc dù tiến hóa chậm và khả năng phân biệt khiêm tốn, nhưng khi

kết hợp với đoạn trình tự matK, bộ đôi rbcL+matK đã cho thấy ưu thế như một mã vạch cốt lõi dựa trên sự khuếch đại đơn giản của đoạn rbcL và khả năng phân biệt cao của đoạn matK [14, 29]

Một đoạn mã vạch khác nằm trong hệ gen lục lạp được sử dụng rộng rãi ở các

loài thực vật có hoa là đoạn trình tự không mã hóa trnH-psbA [10, 36] Đây là đoạn

trình tự có chiều dài thay đổi ở các loài khác nhau, khoảng 286-504bp [88] Với ưu

điểm là dễ dàng nhân lên bằng một cặp mồi ở 95% các loài, đoạn trình tự này cho

thấy được ưu thế so với matK khi cùng với trình tự ITS là hai vùng có khả năng phân biệt tốt nhất [46, 69] Tuy nhiên, việc sử dụng đoạn mã vạch trnH-psbA như một mã vạch tiêu chuẩn gặp phải khó khăn khi đọc trình tự do thường xuyên có những đơn

nucleotide lặp lại dẫn đến việc đọc bị dừng lại sớm Nhằm hạn chế nhược điểm đó,

các thử nghiệm sử dụng các enzyme polymerase mới đã được nghiên cứu và đem lại hiệu quả đáng kể khi có thể chạy được đoạn trình tự dài 13 đơn nucleotide lặp lại [39]

Đoạn trình tự liên gen atpF-atpH và psbK-psbI được đề xuất làm mã vạch cho

thực vật ở hội thảo quốc tế Barcode of life lần thứ hai [51] Cả hai đoạn đều nằm

trong vùng trình tự đơn bản lớn của hệ gen lục lạp Hai đoạn gen atpF và atpH mã hóa cho hai tiểu đơn vị tổng hợp ATP là CFO I và CFO III, trong khi đó hai gen psbK

và psbI mã hóa cho hai polypeptide có khối lượng phân tử thấp là K và I của hệ thống quang hóa II [49] Giống như trnH-psbA, hai đoạn trình tự liên gen này cũng có chiều dài thay đổi giữa các loài, khoảng 579-622bp với đoạn atpF-atpH và 185-576bp đối với psbK-psbI [88] Hai trình tự này trước đó không được sử dụng rộng rãi trong hệ

thống học và phân loại học thực vật, do vậy không có nhiều kết quả được công bố

Theo nghiên cứu của nhóm nghiên cứu thực vật CBOL, psbK-psbI cho kết quả phân biệt tốt, song chất lượng trình tự và tính phổ biến không cao, trong khi đó atpF-atpH

cho kết quả khiêm tốn nhất trong việc phân biệt các loài và mức độ phổ biến cũng như chất lượng trình tự chỉ ở ngưỡng trung bình [29, 39] Một số nghiên cứu gần đây

đã cung cấp những kết quả khả quan cho cả hai đoạn atpF-atpH [62, 88] đối với các loài thuộc chi Ceratozamia cùng một số loài trong họ Lemnaceae, và psbK-psbI đối với các loài thuộc chi Dioon và Zamia (>50%) [61] Kết quả này cũng được báo cáo

trong các nghiên cứu về thực vật có hoa ở Hàn Quốc (Ki-Joong Kim)

Hai đoạn trình tự còn lại trong số 7 đoạn trình tự lục lạp được sử dụng phổ

biến là làm mã vạch ADN là rpoB và rpoC1 [24, 39, 71] Hai gen này đều thuộc họ gen RPO bao gồm rpoA, rpoB, rpoC1 và rpoC2, mã hóa cho các tiều đơn vị khác

nhau của RNA polymerase lạp thể (Các gen trong hệ thống quang hợp của thực vật bậc cao đều được phiên mã bởi ít nhất hai RNA polymerase) Tuy được sử dụng tương đối phổ biến như đoạn mã vạch ADN ở thực vật, song độ phân biệt loài của hai đoạn gen này không cao [54] Trong nghiên cứu về loài trầm hương của Shiou Yih Lee và cộng sự, hai đoạn trình tự này không có khả năng phân biệt giữa các loài trầm [52] Nghiên cứu của nhóm CBOL trên 397 mẫu thực vật cũng đã chỉ ra được mức độ phân biệt các loài của 7 đoạn trình tự trong hệ gen lục lạp lần lượt từ thấp đến cao như sau:

rpoC1< rpoB< atpF-atpH< rbcL< matK< psbK-psbI< trnH-psbA Trong đó, đoạn

trình tự rpoC1 có khả năng phân biệt 43% loài, rpoB là 49%, atpF-atpH 55%, rbcL

và matK lần lượt là 61% và 66%, psbK-psbI và trnH-psbA là 68% là 69% [29]

Hệ gen lục lạp ngoài 7 đoạn trình tự kể trên còn có một số đoạn trình tự cũng

được sử dụng làm mã vạch ADN ở thực vật như trnL-trnF, các đoạn gen của họ gen

ycf1… [23, 39, 77, 85] Vùng liên gen trnL-trnF nằm trong vùng tình tự đơn bản lớn

của hệ gen lục lạp ở thực vật, ngăn cách vùng exon của đoạn gen trnL và exon của gen trnF, bao gồm các đoạn lặp của gen trnF Các đoạn lặp này có chiều dài 94-260

bp gây ra sự biến đổi về chiều dài đáng kể ở vùng liên gen do sự khác nhau về số

đoạn copy của gen giả [72-74] Đoạn intron trnL được sử dụng rộng rãi trong hệ thống

học và phân loại học thực vật từ trước những năm 1990 Vùng trình tự này nhìn chung tương đối dễ đọc, mặc dù đôi khi các trình tự đơn nucleotide lặp lại có thể gây ảnh hưởng ở một số taxon [39] Ưu điểm của đoạn trình tự này là có thể được nhân bởi một cặp mồi và trình tự cặp mồi này đã được thiết kế từ khoảng hơn 15 năm trước, sau đó đã được sử dụng rộng rãi Đây là vùng trình tự duy nhất nằm trong nhóm I intron ở lục lạp thực vật, có nghĩa là có cấu trúc bậc hai với các vùng thay thế và bảo

tồn xen kẽ nhau Phần lớn chiều dài đoạn intron trnL dùng để phân biệt các loài là

một cấu trúc thân vòng (stem-loop) nhỏ có tên P6 [85] Đoạn minibarcode rất ngắn này đã cho thấy tình khả dụng cao trong nghiên cứu về DNA suy biến của các nhà sinh thái học, đồng thời giúp đánh giá sự đa dạng của các phức mẫu trong môi trường [39]

Nghiên cứu mới đây của Wenpan Dong và cộng sự đã cho thấy một đoạn gen lục lạp khác có tiềm năng rất lớn trong việc phân loại và giám định các loài thực vật

bậc cao - đoạn ycf1 [23, 53, 70] Là đoạn gen lớn thứ 2 trong hệ gen lục lạp, ycf1 mã hóa cho protein có độ dài xấp xỉ 1800 amino acid Gen ycf1 kéo dài từ vùng trình tự

đơn bản nhỏ sang vùng lặp trong hệ gen lục lạp, tuy nhiên đoạn nằm trong vùng lặp

có chiều dài tương đối ngắn (dưới 1kb) và là vùng bảo tồn Ngược lại, đoạn nằm trong vùng trình tự đơn bản nhỏ là đoạn có trình tự biến đổi Sự biến đổi này được cho là

hơn đoạn gen matK ở phần lớn taxon với khả năng phân biệt khoảng 75% các loài,

do đó có thể được sử dụng để giám định cho các taxon bậc thấp Đoạn gen bao gồm

hai vùng là ycf1a và ycf1b, được sự đoán là có mức độ đa dạng nucleotide lớn nhất ở

cấp độ loài trong hệ gen lục lạp ở thực vật hạt kín [23]

Ngoài hệ gen lục lạp, một vùng trình tự trong nhân cũng được sử dụng phổ biến để làm mã vạch ADN ở thực vật đó là vùng ITS (internal transcribed spacers) từ vùng DNA ribosome [6, 30, 78] Đối với một vài loài thực vật kí sinh, đoạn trình tự

này có thể là đoạn mã vạch có ý nghĩa duy nhất (mặc dù đoạn matK có thể vẫn còn

trong một số loài tự dưỡng hoàn toàn) [57] Đặc điểm vượt trội của đoạn ITS so với các đoạn trình tự của lục lạp đó là có khả năng xây dựng hệ thống học phân tử rất tốt Tuy nhiên, có ba lý do cơ bản dẫn đến việc đoạn ITS không phải đoạn Mã vạch ADN trọng điểm Thứ nhất, sự tiến hóa chưa hoàn toàn có thể dẫn đến sự phân chia ra các bản sao paralog trong một cá thể [7, 9] Các bản sao này yêu cầu xác định tính thống nhất và cụ thể của vị trí các base đa hình (khó khăn trong trường hợp các đoạn mã vạch cao năng và khó để tái bản trong điều kiện phòng thí nghiệm) hay thậm chí là chúng có khả năng ngăn cản việc đọc trình tự thu được Thêm vào đó, sự biến đổi khác nhau có thể do nguyên nhân là các phương pháp khuếch đại, primer được sử dụng hay hiệu suất PCR dẫn đến sự sai khác ngay trong loài [59] Lý do thứ hai được quan tâm đó là sự nhiễm nấm, đặc biệt trong trường hợp mẫu thực vật thu được có nấm hội sinh Việc này có thể dẫn đến khuếch đại một hay nhiều đoạn trình tự không đặc hiệu khác [7] Lý do cuối cùng đó là mặc dù primer nhân bản đoạn ITS đã được tìm ra, xong việc nhân bản và giải trình tự có thể gặp khó khăn Nghiên cứu của

Gonzalez và cộng sự đã cho thấy chỉ 41% trong số 285 loài cây nhiệt đới được nghiên

cứu có khả năng nhân bản và giải trình tự đoạn mã vạch này [28, 39]

Tuy vậy, không thể phủ nhận hiệu quả phân biệt của đoạn trình tự ITS khi nó giúp làm tăng hiệu quả phân biệt các loài từ 50-62% khi chỉ sử dụng 3 đoạn mã vạch

trong hệ gen lục lạp là rbcL, matK, trnH-psbA lên 77-82% khi kết hợp cùng các đoạn

mã vạch đó [38] Đoạn trình tự ITS ở thực vật bao gồm 3 phần là ITS1 – 5,8S – ITS2 Trên thực tế, một số nghiên cứu đã sử dụng đoạn ITS2 với trình tự ngắn hơn thay thế cho trình tự ITS Việc sử dụng đoạn ITS2 do đó là sự đánh đổi giữa việc dùng một đoạn trình tự ngắn hơn để có thể dễ dàng nhân bản và giải trình tự với việc chấp nhận

sẽ có ít đoạn biến đổi hơn [18, 39] Kết quả cho thấy tuy trình tự ngắn hơn và ít đoạn biến đổi hơn, song đoạn ITS2 vẫn có khả năng phân biệt loài đáng kể và là đoạn trình

tự được sử dụng rộng rãi làm mã vạch ADN ở thực vật bên cạnh các đoạn trình tự ở

hệ gen lục lạp [18, 19]

Trên thực tế, trong các nghiên cứu về hệ thống học và phân loại học thực vật dựa trên dấu chuẩn về mặt phân tử, các nhà nghiên cứu thường kết hợp các đoạn mã vạch ADN với nhau để mang lại hiệu quả phân biệt cao nhất Mỗi một đoạn trình tự lại có ưu nhược điểm khác nhau, do vậy có thể bổ sung cho các khiếm khuyết của

nhau: rpoB, rpoC1 và rbcL có trình tự bảo thủ, dễ dàng nhân bản và so sánh trình tự nhưng độ đa hình không cao, matK có khả năng phân biệt tốt nhưng lại khó để khuếch đại, trnH-psbA, atpF-atpH và psbK-psbI có tốc độ tiến hóa nhanh song lại có độ dài thay đổi giữa các taxon, ITS và ITS2 có khả năng phân biệt tốt song dễ gặp phải các

vấn đề bên ngoài như nhiễm nấm… [36] Mức độ phổ biến (khả năng nhân bản và

giải trình tự) của các mã vạch ADN ở đối tượng thực vật trên cạn như sau: rpoC1 (100%), rbcL (97%), trnH-psbA (79%), rpoB/matK (65%), psbK-psbI (50%), atpF-

atpH (49%) [36], ITS (41%) [39], khả năng nhân bản bởi một cặp mồi phổ biến nhất

của các đoạn rpoC1, trnH-psbA, rbcL, psbK-psbI, atpF-atpH, rpoB và matK lần lượt

là 100%, 79%, 78%, 50%, 49%, 32% và 27% [36]

Nhóm nghiên cứu về mã vạch ADN ở thực vật đã công bố kết quả về việc sử dụng kết hợp các mã vạch trên Theo đó, việc kết hợp 2 mã vạch có thể đem là hiệu

quả phân biệt từ khoảng 59 - 75% (kết hợp rpoB+rpoC1 đem lại hiệu quả thấp nhât 59%, psbK-psbI+rbcL ~75%, matK+rbcL ~72%), sử dụng kết hợp 3 mã vạch là 65- 76% (atpF-atpH+rpoB+rpoC1 65%, rpoC1+psbK-psbI+rbcL 76%) Nhóm các đoạn

mã vạch phát huy tối đa chức năng khi kết hợp với các trình tự khác bao gồm rbcL,

psbK-psbI, matK và trnH-psbA Khi sử dụng kết hợp cả 7 đoạn mã vạch trong hệ gen

lục lạp nói trên, hiệu quả phân biệt đạt 73% [29] Trong một nghiên cứu khác của KiJoong Kimvà cộng sự [51], việc kết hợp các trình tự matK+atpF-atpH+psbK-psbI

mang lại hiệu quả phân biệt các loài vào khoảng 69%, trong khi đó

rpoB+rpoC1+matK là khoảng 61% [16] Tuy nhiên, so sánh khả năng phân biệt khi

kết hợp ba đoạn mã vạch và hai đoạn mã vạch không có sự khác nhau nhiều, do vậy nhóm nghiên cứu mã vạch thực vật đã khuyến nghị nên dùng kết hợp hai đoạn trình

tự nhằm tiết kiệm chi phí và giảm thiểu các rủi ro khi nhân bản và giải trình tự [29]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân biệt của các mã vạch ADN thực

vật

Các yếu tố sinh học có khả năng ảnh hưởng đến mức độ thành công của ứng dụng công nghệ mã vạch ADN thực vật Khả năng phân biệt và nhận diện các loài có thể sẽ không còn chuẩn xác khi gặp phải một trong các trường hợp sau đây:

- Cách biệt địa lý: khi các quần thể trong loài bị cách li sẽ tạo ra sự sai khác trong hệ gen, hoặc ngược lại khi hai loài có quan hệ họ hàng gần nhau khi sống trong cùng một khu vực có thể xảy ra hiện tượng lai giữa các loài

- Các loài mới hình thành: trong cùng một nhóm khi mới hình thành loài mới, hoặc tỷ lệ đột biến là rất chậm, các trình tự mã vạch có thể chung giữa các loài

có mối quan hệ gần nhau

- Các loài đa bội: Sự hình thành các loài đa bội có thể dẫn đến trình tự mã vạch không phù hợp với những đặc điểm của taxon [26] Khi nhiều loài dị đa bội

có cùng loài bố mẹ, chúng có thể có trình tự gen lục lạp giống hệt nhau

- Các nhóm chưa được phân loại rõ ràng: khi đó, giới hạn các loài thường rất hạn hẹp, việc nhận diện chính xác các loài sử dụng mã vạch là không phù hợp

do hiện tượng hồi quy trong sinh thái của các taxon, hoặc các loài xuất hiện bằng một vài phương pháp như chuyển bội thể, hình thành loài lai hoặc tiếp hợp vô tính [39]

1.2.4 Ứng dụng của mã vạch ADN

Ứng dụng chung của mã vạch ADN

Ứng dụng của mã vạch ADN không chỉ dừng lại ở việc nhận diện nhanh các mẫu mà còn mở rộng nghiên cứu sắp xếp theo nhóm những loài còn mơ hồ hoặc phức tạp Trong hệ sinh thái, mã vạch ADN phát huy tính hữu dụng trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu vật dù chúng có thể không giống nhau về mặt hình thái Ngoài

ra, trong đời sống, mã vạch ADN cũng hỗ trợ xác định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu do tính chất nhận dạng được cả với lượng mẫu nhỏ, bị biến dạng [43] Các ứng dụng nổi bật có thể kể đến của mã vạch ADN là kiểm soát các tác nhân gây hại trong nông nghiệp, nhận diện các tác nhân gây bệnh, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên, bảo vệ các loài nguy cấp, quản lý chất lượng nước, xác định các sản phẩm tốt cho sức khỏe từ tự nhiên, nhận biết các cây dược liệu [43]

Việt Nam là một trong số các quốc gia có tính đa dạng sinh học rất cao với nhiều loài nguồn thực vật, động vật, nấm có giá trị kinh tế lớn Việc quản lý khai thác nguồn gen quý hiếm này đã được Chính phủ quan tâm từ những năm 2010 thông qua việc hình thành Quỹ gene cấp Quốc gia để định hướng, nghiên cứu, khai thác, ứng dụng và bảo tồn các nguồn gen sinh vật quý hiếm Việc ứng dụng mã vạch ADN để nhận dạng các mẫu sinh vật trước khi tiến hành các công tác nghiên cứu sâu hơn là điều kiện tiên quyết để đảm bảo tính chuẩn mực và thành công của các nghiên cứu khai thác bảo tồn nguồn gen [1]

Ứng dụng của mã vạch ADN thực vật

Ngày nay, nghiên cứu về mã vạch ADN ở thực vật thực chất là nghiên cứu so sánh sự khác biệt của các đoạn trình tự, từ đó ứng dụng ra thực tiễn với các mục đích

khác nhau Những ứng dụng này có thể chia ra làm hai hướng chính Thứ nhất, cung cấp cái nhìn sâu hơn về phân loại học ở cấp độ loài và đóng góp vào tiến trình phân định rõ đặc điểm và ranh giới các loài Ứng dụng thứ hai, cũng là ứng dụng chính, đó

là hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật chưa biết vào các loài đã biết hoặc xác định loài mới [39]

Mã vạch ADN ở thực vật cung cấp cái nhìn sâu vào phân loại học ở cấp độ loài đối với những nhóm có hình thái đơn giản, nhóm có phân bố rộng, nhóm có kích thước nhỏ hoặc những nhóm đã được phân loại nhưng không đầy đủ, chưa tương xứng với đặc điểm đa dạng của chúng (ví dụ như trong trường hợp phân loại dựa trên hình thái học gặp khó khăn hoặc chưa được phân loại triệt để) Một nhóm thực vật điển hình được nghiên cứu với mục đích này đó là ngành rêu – nhóm không phân hóa nhiều về đặc điểm hình thái [55, 58] Mã vạch ADN cũng được sử dụng rộng rãi nhằm tìm hiểu giới hạn loài cho nhóm thực vật có hạt, thông qua việc đóng góp tìm ra các loài ẩn danh hoặc làm căn cứ để phân biệt các nhóm loài đã biết [39]

Có rất nhiều ngành nghề liên quan đến mã vạch ADN hiện nay, bao gồm nhận dạng và ứng dụng nhận dạng các loài thực vật như phân loại học, sinh thái học, bảo tồn thiên nhiên, nông lâm nghiệp, khoa học pháp y, kiểm dịch… [37] Khi sử dụng

mã vạch ADN để nhận dạng các loài thực vật, cần thiết phải nắm vững kỹ thuật này Trong nhiều trường hợp, các mã vạch ADN thu được cho kết quả nhận dạng của một nhóm loài thay vì một loài Tuy nhiên, với một số ứng dụng, thậm chí ngay cả khi mã vạch ADN có khả năng phân biệt khiêm tốn nhất cũng có thể hữu ích (đối với các trường hợp nghiên cứu tập trung vào khác biệt địa lý, phân biệt loài mục tiêu với các loài khác trong thương mại hay thu hẹp giới hạn nhận dạng các loài hoàn toàn xa lạ) [39]

1.2.5 Một số nghiên cứu về mã vạch ADN ở các loài Trà

Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về các loài thuộc chi Trà, chia thành nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như tìm kiếm và phân loại các loài trà dựa trên đặc điểm hình thái, nghiên cứu phân tích thành phần hợp chất trong

lá và hoa trà, nghiên cứu nhân giống và bảo tồn các loài trà và phân tích cơ sở dữ liệu phân tử phục vụ cho phân loại và giám định Trong số đó, các công trình nghiên cứu

về di truyền phân tử nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Một vài công trình nghiên cứu tiêu biểu có thể kể đến như nghiên cứu của Singh và cộng sự

sử dụng kỹ thuật lai Southern, phân biệt loài trà Camellia sinensis ở Trung Quốc với

cùng loài này ở Ấn Độ và Campuchia dựa trên sự biến đổi của đoạn lặp 5S rDNA [81]; nghiên cứu của Yanglong và cộng sự với đoạn mã vạch ITS trên đối tượng 11 mẫu trà nghiên cứu

Một vài nghiên cứu gần đây với sự trợ giúp của các công cụ tin sinh đã thu được những kết quả đáng kể trong việc nghiên cứu các dấu chuẩn phân tử ở chi Trà Điển hình là nghiên cứu của Yang và cộng sự [94] đã xây dựng được mô hình hoàn chỉnh

hệ gen lục lạp ở bảy loài trà (hình 1.1), trong đó đề xuất 11 vùng trình tự lục lạp tiềm

năng để phân tích mối quan hệ di truyền cho các loài trà bao gồm: accD-psaI,

atpF-atpH, ccsA-nshD, clpP-psbB, ndhC-trnV, ndhF-rpl32, petD-rpoA, psbH-petB, trnL, trnG_intron, trnS-trnG Kết quả nghiên cứu của Huang và cộng sự trên đối

rpl32-tượng 13 loài trà cũng đã đề xuất 15 trình tự thích hợp để nghiên cứu di truyền phân

tử đối với các loài chi Camellia, bổ sung thêm các trình tự psbK-psbI, trnH-psbA,

trnE-trnT, trnS-psbZ, pabA-ycf3, trnP-psaJ, ycf15-trnL so với nghiên cứu trước đấy

của Yang và cộng sự [40] Kết quả nghiên cứu của cả hai công trình này đều cho thấy các vùng trình tự thích hợp để phân tích di truyền phân tử chủ yếu nằm ở vùng trình

tự không mã hóa và vùng gen đơn bản (Single copy region) của hệ gen lục lạp các loài trà

Việt Nam là quốc gia đứng thứ hai trên thế giới về số lượng các loài trà hoa vàng (sau Trung Quốc) cùng với đa dạng chi Trà phong phú, các công trình nghiên cứu về trà hoa vàng nói riêng và chi trà nói chung tương đối nhiều nhưng tập trung chủ yếu theo hướng phát hiện loài mới và nhân giống bảo tồn các loài trà quý hiếm này Một vài công trình nghiên cứu về mã vạch ADN trên đối tượng trà hoa vàng có

thể kể đến như nhân bản đoạn gen 5,8S rRNA ở loài trà vàng Petelo (Camellia

Petelotii) của tác giả Nguyễn Thị Nga và cộng sự (2003) [4], nhân bản đoạn matK

loài trà vàng Tam đảo của tác giả Hà Văn Huân và cộng sự [2] Tuy nhiên những công trình nghiên cứu này chưa mạng lại nhiều kết quả trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho các loài trà hoa vàng, cần có những nghiên cứu sâu và rộng hơn, làm tiền đề cho việc giám định các loài trà hoa vàng dựa trên phương pháp phân tử

Hình 1.1 Hệ gen lục lạp một số loài thuộc chi Camellia [94]

2 Chương 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các loài Trà hoa vàng được nghiên cứu ở VQG Tam Đảo

 Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda (Trà vàng lá dày)

 Camellia hakodae Ninh (Trà vàng hakoda)

 Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Trà vàng petelo)

 Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh (Trà vàng tam đảo)

 Camellia tienii Ninh, Tr (Hải đường vàng)

Một số đoạn mã vạch được xác định cho các loài Trà hoa vàng

 Maturase K (matK)

 Rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/oxygenase large-subunit (rbcL)

 TrnH – psbA intergenic spacer

 Ycf1b

 ITS2

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Bao gồm các nội dung chính sau đây:

 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá các loài trà hoa vàng ở VQG Tam Đảo thu được, 3 mẫu/loài x 5 loài

 Nhân bản các đoạn mã vạch ADN quan tâm bằng phương pháp PCR

 Phân tích và xác định trình tự các đoạn mã vạch ADN thu được

 Xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài trà hoa vàng nghiên cứu và với

các loài khác trong chi trà Camellia dựa trên các trình tự thu được

 Xác định đoạn mã vạch đặc trưng cho các loài trà hoa vàng ở VQG Tam Đảo

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Gen và

Di truyền phân tử - Viện CNSH Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp, sử dụng các máy móc, thiết bị chuyên môn đạt tiêu chuẩn Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ nguồn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước “Xây dựng cơ sở dữ liệu

mã vạch ADN (DNA barcode) cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoài

gỗ có giá trị kinh tế”, bao gồm bộ KIT tách chiết ADN thực vật “Plant/Fungi DNA Isolation KIT” - Norgen, Canada; hóa chất PCR: Master mix 2X, nước PCR, mồi nhân gen; bộ KIT tinh sạch sản phẩm PCR “PCR Purification KIT” – Norgen, Canada; hóa chất điện di: Agarose; đệm TAE; Redsafe solution Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm bao gồm găng tay, khẩu trang, pipette các loại, cối chày sứ… Máy móc

sử dụng gồm có máy PCR, cân phân tích, máy ly tâm, máy đo nano drop, tủ lạnh

-80o, bộ điện di, máy chụp ảnh bản gel…

Mồi được sử dụng để nhân các đoạn trình tự được thiết kế dựa trên các tài liệu

đã được công bố

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng Vùng

Tm ( o C)

matK

[2]

mTHV F 5’-TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT-3’ 60.7 mTHV R 5’-CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA-3’ 60.5

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thu mẫu lựa chọn mẫu lá bánh tẻ không bị sâu bệnh nấm mốc, lấy 3 mẫu/loài

x 5 loài từ các cá thể độc lập Sau khi thu, mẫu được bảo quản trong túi nilon có chứa hạt silica gel hút ẩm, ghi đầy đủ thông tin mẫu và được giữ ở -80oC để tách chiết ADN phục vụ nghiên cứu Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá của 5

loài Hải đường vàng (Camellia tienii Ninh), Trà vàng Hakoda (Camellia hakoda Ninh, Tr.), Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda), Trà vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoesis Hakoda et Ninh), Trà vàng Petelo (Camellia petelotii

(Merr.) Sealy) theo hướng dẫn của Kit (Plant/Fungi DNA Isolation Kit) Xác định

nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch ADN tổng số bằng máy đo nano drop Nhân bản đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS2 và ycf1b từ các mẫu ADN tổng số tách

chiết được bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ), mỗi phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl, bao gồm: H2O deion (7 µl), 2x PCR Master mix Solution (10 µl), 10 pmol/ µl mồi xuôi (1,0 µl), 10 pmol/ µl mồi ngược (1,0 µl) và 50 ng/µl ADN khuôn (1 µl) Chương trình phản ứng PCR: 94oC trong 3 phút; (94oC: 30 giây, 55oC : 30 giây, 72oC : 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72oC trong 5 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC Nhiệt độ gắn mồi các phản ứng khác nhau phụ thuộc và cặp mồi sử dụng Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0 %, quan sát kết quả dưới đèn cực tím (UV) và chụp ảnh bằng hệ thống Dolphin - Doc Image system của hãng Wealtec (Mỹ) Sản phẩm PCR được tinh sạch theo hướng dẫn của kit tinh sạch sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) của Norgen, Canada Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi cho phòng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải trình tự Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Trình

tự nucleotide của đoạn ADN được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như DNAClub, Bioedit, Mega6, Trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ADN sau khi phân tích được đăng ký trong ngân hàng cơ sở dữ liệu ADN của Việt Nam (www.dnabank.vn)

Hình 2.1 Chu trình nhiệt nhân bản đoạn mã vạch ADN

(*): nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào cặp mồi sử dụng, cụ thể:

matK – 57oC; rbcL – 52oC; trnH-psbA – 50oC; ycf1b – 48oC; ITS2 – 50oC Trình tự ADN sau khi được giải trình tự sẽ được so sánh và sắp xếp thẳng hàng

sử dụng thuật toán MUSCLE [100] Kết quả sắp xếp thẳng hàng sẽ được sử dụng sau

đó để tính khoảng cách di truyền, sử dụng phần mềm MEGA6 trên cơ sở phương pháp tính Kimura 2-parameter [44], xây dựng cây phân loại theo phương pháp Maximum Likelihood trong MEGA6 Cây phân loại xây dựng theo mô hình Kimura 2-parameter, giá trị bootstrap 1000, tất cả các vị trí bao gồm các gap và dữ liệu trống đều được sử dụng để phân tích

T88.1 T88.2 T88.3 T89.1 T89.2 T89.3 T90.1 T90.2 T90.3 T91.1 T91.2 T91.3 T92.1 T92.2 T92.3

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số các mẫu trà hoa vàng

Mẫu sau khi được thu thập sẽ được lưu trữ ở -80oC trong phòng thí nghiệm và được sử dụng để tiến hành tách chiết ADN tổng số

Bảng 3.1 Mẫu vật nghiên cứu

1 Hải đường vàng Camellia tienii Ninh

TCT88.1 TCT88.2 TCT88.3

2 Trà vàng hakoda Camellia hakoda Ninh, Tr

TCH89.1 TCH89.2 TCH89.3

3 Trà vàng lá dày Camellia crassiphylla Ninh et

Hakoda

TCC90.1 TCC90.2 TCC90.3

4 Trà vàng tam đảo Camellia tamdaoensis Hakoda et

Ninh

TCT91.1 TCT91.2 TCT91.3

5 Trà vàng petelo Camellia petelotii (Merr.) Sealy

TCP92.1 TCP92.2 TCP92.3

Phương pháp tách chiết được trình bày như trên sử dụng KIT tách chiết

“Plant/Fungi DNA Isolation KIT” – Norgen, Canada Sau khi tiến hành tách chiết, ADN tổng số được điện di trên gel Agarose 1% để kiểm tra và thu được kết quả như hình sau:

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số các mẫu Trà hoa vàng

1.66 1.93 1.81

1.88 1.68 2.05

1.69 1.53 1.78

1.51 1.73 2.01

Tiến hành pha loãng 10 lần ADN tổng số thu được và đo nồng độ cũng như

độ tinh sạch cho kết quả như bảng 3.2 Kết quả thu được cho thấy ADN tổng số thu được với hàm lượng tương đối lớn, độ tinh sạch khá cao, phù hợp để sử dụng cho phản ứng PCR ở bước sau

3.2 Kết quả PCR các đoạn mã vạch ADN

Từ 15 mẫu ADN tổng số đã tách được ( 5 loài x 3 mẫu/1 loài), sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng đoạn để tiến hành PCR nhân bản các đoạn ADN Mẫu ADN tổng số được pha loãng 10 lần Chu trình nhiệt và trình tự các cặp mồi sử dụng như

đã miêu tả ở mục 2.2.2 Kết quả PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel Agarose 1% và được chụp lại bằng máy chụp ảnh gel, thu được như sau:

a) PCR đoạn gen matK