Xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài Trà hoa vàng ở vườn Quốc gia Tam Đảo

I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN HONG MINH TRANG XC NH MT S ON M VCH ADN CHO MT S LOI TR HOA VNG VN QUC GIA TAM O Chuyờn ngnh: Sinh hc thc nghim Mó s: 60420114 TểM TT LUN VN THC S KHOA HC H Ni - 2016 Cụng trỡnh c hon thnh ti: Vin Cụng ngh sinh hc Lõm nghip - Trng i hc Lõm nghip Vit Nam Ngi hng dn khoa hc: PGS.TS H Vn Huõn PGS.TS Nguyn Trung Thnh Phn bin 1: PGS.TS Nguyn Th Hng Võn Phn bin 2: TS Nguyn Tng Võn Lun c bo v trc Hi ng chm lun thc s hp ti: Phũng 133 nh T1 Trng i hc Khoa hc T nhiờn, HQGHN Vo 09 gi 30 ngy 22 thỏng 11 nm 2016 Cú th tỡm lun ti: - Trung tõm Th vin i hc Quc Gia H Ni I M U Tr hoa vng thuc chi Tr Camellia (h Theaceae, b Ericales) cú hoa mu vng, c phỏt hin ln u tiờn Vit Nam vo nhng nm u th k XX Cho n cỏc nh khoa hc ó phỏt hin khong trờn 30 loi Tr hoa vng, ú cú 28 loi c tỡm thy Trung Quc v 24 loi tỡm thy Vit Nam Cỏc loi tr hoa vng cú giỏ tr ln v mt dc liu, c bit n vi tỏc dng kim ch sinh trng u, ngn nga ung th, gim lng cholesterol v lipoprotein mỏu cú cỏc nguyờn t vi lng nh Germanium (Ge), Selenium (Se), Mangan (Mn) Ngoi tr hoa vng cũn cú giỏ tr thm m cao, c trng lm cõy cnh cú hoa ln mu vng c trng Vit Nam, Tr hoa vng c phỏt hin ch yu mt s a phng nh VQG Tam o (Vnh Phỳc), VQG Cỳc Phng (Ninh Bỡnh), Phc Lc (Lõm ng), ú VQG Tam o phỏt hin loi vi mt s loi c hu ca Vit Nam nh Camellia tamdaoensis, Camellia crassiphylla, Camellia petelotii õy l ngun gen vụ cựng quý him cho h thc vt Tam o núi riờng v Vit Nam núi chung, cn c bo v v phõn loi a bin phỏp thớch hp cho vic bo tn ngun gen, a dng sinh hc Tuy nhiờn, hin Tr hoa vng Tam o ang b e da nghiờm trng vic khai thỏc quỏ mc t phớa ngi dõn, ng thi vic bo tn v nghiờn cu cũn cha c chỳ ý nhiu Cho n nay, vic phõn loi thc vt núi chung v cỏc loi thuc chi Tr núi riờng ch yu da vo cỏc c im hỡnh thỏi, cu to gii phu bờn Vic phõn loi ny mt s trng hp gp nhiu khú khn mt s loi Tr hoa vng cú c im hỡnh thỏi tng i ging Vi s phỏt trin ca sinh hc phõn t v cụng ngh gen, mt phng phỏp phõn loi da trờn k thut phõn tớch ADN ó c nghiờn cu v phỏt trin s dng cỏc on mó vch ADN c trng cho loi (DNA barcode) Phng phỏp ny tr thnh cụng c c lc cho cỏc nh khoa hc vic phỏt hin loi mi, phõn loi, ỏnh giỏ a dng di truyn v quan h di truyn cỏc loi Mi on mó vch ADN cú c trng riờng v cú kh nng phõn bit sinh vt cỏc mc khỏc (chi, loi, di loi) Mt s on mó vch ADN c s dng ph bin thc vt cú th k n nh matK, rbcL, trnH-psbA, rpoB, rpoC1, psbI-psbK, atpF-atpH, trnL-trnF Vi mc xõy dng c s d liu phõn t cho cỏc loi Tr hoa vng VQG Tam o, c th l loi Hi ng vng (Camellia tienii Ninh), Tr vng Hakoda (Camellia hakoda Ninh, Tr.), Tr vng lỏ dy (Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda), Tr vng Tam o (Camellia tamdaoesis Hakoda et Ninh), Tr vng Petelo (Camellia petelotii (Merr.) Sealy), xut mó vch thớch hp c trng cho cỏc loi tr ny thụng qua vic xỏc nh v phõn tớch trỡnh t ca mt s on mó vch, tỏc gi tin hnh ti Xỏc nh mt s on mó vch ADN cho mt s loi Tr hoa vng Vn Quc gia Tam o vi i tng phõn tớch l nm vựng trỡnh t rbcL, matK, ycf1b, trnH psbA v ITS2 Kt qu thu c s úng gúp vo Ngõn hng gen Quc t giỏm nh cỏc loi Tr hoa vng, xỏc nh mi quan h di truyn gia cỏc loi Tr hoa vng vi v vi cỏc loi chi tr Camellia, nõng cao hiu qu bo tn v phỏt trin cỏc loi Tr hoa vng quý him khụng ch Vit Nam m cũn trờn ton th gii II VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 VT LIU NGHIấN CU 2.1.1 i tng nghiờn cu Nm loi tr hoa vng nghiờn cu ny gm cú: Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda (Tr vng lỏ dy), Camellia hakodae Ninh (Tr vng hakoda), Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Tr vng petelo), Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh (Tr vng tam o), Camellia tienii Ninh, Tr (Hi ng vng) vi s lng mu l mu/loi Nm on mó vch nghiờn cu: matK, rbcL, trnH-psbA, ycf1b v ITS2 2.1.2 Ni dung nghiờn cu Nghiờn cu gm cú nm ni dung chớnh: Tỏch chit AND tng s cỏc mu lỏ tr hoa vng, nhõn bn cỏc on mó vch ADN bng k thut PCR, phõn tớch v xỏc nh trỡnh t cỏc on mó vch ADN thu c, xỏc nh mi quan h di truyn gia cỏc loi tr hoa vng nghiờn cu v vi cỏc loi khỏc chi tr Camellia da trờn cỏc trỡnh t thu c v xỏc nh on mó vch c trng cho cỏc loi tr hoa vng VQG Tam o 2.2 PHNG PHP NGHIấN CU 2.2.1 Húa cht, thit b v dng c Húa cht s dng bao gm b KIT tỏch chit ADN thc vt Plant/Fungi DNA Isolation KIT - Norgen, Canada; húa cht PCR: Master mix 2X, nc PCR, mi nhõn gen; b KIT tinh sch sn phm PCR PCR Purification KIT Norgen, Canada; húa cht in di: Agarose; m TAE; Redsafe solution Dng c v thit b thớ nghim bao gm gng tay, khu trang, pipette cỏc loi, ci chy s Mỏy múc s dng gm cú mỏy PCR, cõn phõn tớch, mỏy ly tõm, mỏy o nano drop, t lnh -80o, b in di, mỏy chp nh bn gel Mi c s dng nhõn cỏc on trỡnh t c thit k da trờn cỏc ti liu ó c cụng b Bng 2.1 Trỡnh t cỏc cp mi s dng Tm Vựng Tờn Trỡnh t mi gen mi (oC) mTHV 560.7 F TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT-3 matK 5mTHV CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA- 60.5 R rP1 F 5- ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC -3 57.2 rbcL rP1 R - GTAAAATCAAGTCCACCRCG - 52.8 61.1 trnH- trnPF1 5- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC - psbA psbPR1 5- GTTATGCATGAACGTAATGCTC - 52.3 5- TCTCGACGAAAATCAGATTGTTGTGAA ycf1b F 56.9 ycf1b ycf1b 5- ATACATGTCAAAGTGATGGAAAA- 50.6 R Is2P1 F 5- ATGCGATACTTGGTGTGAAT - 51.9 ITS2 Is2P1 5- TCCTCCGCTTATTGATATGC - 52.1 R 2.2.2 Phng phỏp nghiờn cu Thu mu la chn mu lỏ bỏnh t khụng b sõu bnh nm mc, ly mu/loi x loi t cỏc cỏ th c lp Sau thu, mu c bo qun tỳi nilon cú cha ht silica gel hỳt m, ghi y thụng tin mu v c gi -80oC tỏch chit ADN phc v nghiờn cu Phng phỏp tỏch chit ADN tng s t cỏc mu lỏ ca loi Hi ng vng (Camellia tienii Ninh), Tr vng Hakoda (Camellia hakoda Ninh, Tr.), Tr vng lỏ dy (Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda), Tr vng Tam o (Camellia tamdaoesis Hakoda et Ninh), Tr vng Petelo (Camellia petelotii (Merr.) Sealy) theo hng dn ca Kit (Plant/Fungi DNA Isolation Kit) Xỏc nh nng v tinh sch ca dung dch ADN tng s bng mỏy o nano drop Nhõn bn on gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS2 v ycf1b t cỏc mu ADN tng s tỏch chit c bng k thut PCR trờn mỏy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems (M), mi phn ng PCR c thc hin tng th tớch 20 l, bao gm: H2O deion (7 àl), 2x PCR Master mix Solution (10 àl), 10 pmol/ àl mi xuụi (1,0 àl), 10 pmol/ àl mi ngc (1,0 àl) v 50 ng/àl ADN khuụn (1 àl) Chng trỡnh phn ng PCR: 94oC phỳt; (94oC: 30 giõy, 55oC : 30 giõy, 72oC : phỳt) lp li 40 chu k; 72oC phỳt; bo qun sn phm PCR 4oC Nhit gn mi cỏc phn ng khỏc ph thuc v cp mi s dng Mi phn ng PCR lp li ln trờn mi mu thớ nghim Kt qu PCR c kim tra bng in di trờn gel agarose 1,0 %, quan sỏt kt qu di ốn cc tớm (UV) v chp nh bng h thng Dolphin - Doc Image system ca hóng Wealtec (M) Sn phm PCR c tinh sch theo hng dn ca kit tinh sch sn phm PCR (PCR Purification Kit) ca Norgen, Canada Sau tinh sch sn phm PCR c gi cho phũng thớ nghim 1st Base Malaysia gii trỡnh t Trỡnh t nucleotide ca on ADN c xỏc nh ti bng mỏy gii trỡnh t, s dng b Kit BigDyeđ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Trỡnh t nucleotide ca on ADN c phõn tớch bng cỏc phn mm chuyờn dng nh DNAClub, Bioedit, Mega6, Trỡnh t nucleotide ca cỏc on mó vch ADN sau phõn tớch c ng ký ngõn hng c s d liu ADN ca Vit Nam (www.dnabank.vn) Trỡnh t ADN sau c gii trỡnh t s c so sỏnh v sp xp thng hng s dng thut toỏn MUSCLE [100] Kt qu sp xp thng hng s c s dng sau ú tớnh khong cỏch di truyn, s dng phn mm MEGA6 trờn c s phng phỏp tớnh Kimura 2parameter, xõy dng cõy phõn loi theo phng phỏp Maximum Likelihood MEGA6 Cõy phõn loi xõy dng theo mụ hỡnh Kimura 2-parameter, giỏ tr bootstrap 1000, tt c cỏc v trớ bao gm cỏc gap v d liu trng u c s dng phõn tớch III KT QU - THO LUN 3.1 Kt qu tỏch chit ADN tng s cỏc mu tr hoa vng Bng 3.1 Mu vt nghiờn cu STT Tờn loi Tờn khoa hc Kớ hiu mu TCT88.1 Hi ng vng Camellia tienii Ninh TCT88.2 TCT88.3 TCH89.1 Tr vng hakoda Camellia hakoda Ninh, Tr TCH89.2 Tr vng lỏ dy Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda Tr vng tam o Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh Tr vng petelo Camellia petelotii (Merr.) Sealy T88.1 T88.2 T88.3 T89.1 T89.2 T89.3 T90.1 T90.2 T90.3 T91.1 T91.2 T91.3 TCH89.3 TCC90.1 TCC90.2 TCC90.3 TCT91.1 TCT91.2 TCT91.3 TCP92.1 TCP92.2 TCP92.3 T92.1 T92.2 T92.3 Hinh 3.1 Kt qu in di sn phm tỏch chit ADN tng s cỏc mu Tr hoa vng Kt qu in di ADN tng s cỏc mu tr hoa vng cho thy cỏc bng ADN tng s tng i sc nột, sỏng rừ chng t ADN tng s thu c khỏ nguyờn vn, ớt t góy, ng thi kt qu o nano drop cho thy ADN thu c vi hm lng tng i ln, tinh sch cao, phự hp s dng cho phn ng PCR bc sau Bng 1.2 Nng v tinh sch ca cỏc mu ADN tng s (pha loóng 10 ln) Mu T88 T89 T90 T91 T92 371 417 365 451 256 Nng ADN 432 423 396 318 284 (ng/àl) 295 315 402 331 312 1.77 1.66 1.88 1.69 1.51 OD260nm/OD280nm 1.82 1.93 1.68 1.53 1.73 1.99 1.81 2.05 1.78 2.01 3.2 Kt qu PCR cỏc on mó vch ADN Kt qu PCR cỏc on mó vch ADN c kim tra bng phng phỏp in di trờn gel agarose 1%, cho thy cỏc bng ADN lờn rừ nột, kớch thc ng u gia cỏc mu, khụng cú bng ph chng t mi c dựng nhõn bn cỏc on mó vch c thit k c hiu i chng dng lờn bng rừ nột, cú kớch thc bng vi cỏc bng c nhõn bn, i chng õm khụng lờn bng chng t húa cht v cỏc iu kin tin hnh phn ng PCR l hon ton bỡnh thng So sỏnh vi kớch thc cỏc bng marker cho thy on gen matK cú kớch thc khong 950bp, on rbcL cú kớch thc khong 600bp, on trnH-psbA l 500bp, on ITS2 khong 400bp v on ycf1b l 750bp Cỏc sn phm PCR ny cú th gii trỡnh t trc tip thu c trỡnh t cỏc on Mó vch ADN cho cỏc loi tr hoa vng VQG Tam o 3.3 Gii trỡnh t v phõn tớch trỡnh t cỏc on mó vch ADN 3.3.1 Kt qu gii trỡnh t Kt qu gii trỡnh t nucleotide cỏc on mó vch cho thy vi mi loi tr hoa vng c lm mu vi ln thớ nghim c lp, kt qu nhn c v phõn tớch bng phn mm tin sinh cho thy cỏc on tng ng ca mu cựng mt loi tr cú trỡnh t tng ng vi 100% Kt qu c th hin c th bng 3.3 Bng 3.3 ỏnh giỏ trinh t cỏc on mó vch thu c Cỏc on mó vch ADN trnHmatK rbcL ycf1b ITS2 psbA S lng cỏ th 15 15 15 15 15 T l PCR thnh cụng 100 100 100 100 100 (%) T l gii trỡnh t 100 100 100 100 100 thnh cụng (%) 945 502 750 397 di trỡnh t 599 951 510 762 399 di so sỏnh 951 599 510 762 408 S v trớ thay th 1 S v trớ bo th 950 598 508 760 404 S nucleotide thờm/mt 14 12 26 i S v trớ mang thụng tin 0 3.3.1.1 Kt qu phõn tớch trỡnh t on matK So sỏnh trỡnh t on mó vch ADN matK ba loi Hi ng vng (mT88), Tr vng Hakoda (mT89), Tr vng Tam o (mT91) cho thy khụng cú s khỏc bit gia ba loi ny T l tng ng ca loi tr hoa vng núi trờn so vi trỡnh t matK loi tr xanh Camellia sinensis cụng b trờn ngõn hng gen NCBI l 100% Cựng vi ú, t l tng ng ca loi Tr vng lỏ dy (mT90) l 99,89%, loi Tr vng Petelo (mT92) l 99,37% Cỏc loi ny theo cỏch phõn loi da trờn s khỏc bit trỡnh t matK cú h hng gn vi mt s loi tr nh Camellia sinensis var Sinensis, Camellia leptophylla, Camellia crapnelliana, xa hn vi cỏc loi tr Camellia impressinervis, Camellia yunnanensis, Camellia japonica, Camellia oleifera Hinh 3.2 Cõy phõn loi sinh hc xõy dng da trờn trỡnh t on matK 3.3.1.2 Kt qu phõn tớch trỡnh t on rbcL So sỏnh trỡnh t rbcL ca c nm loi vi v so vi trỡnh t trờn Ngõn hng gen quc t NCBI loi Camellia oleifera cho thy khụng cú s khỏc bit ln (ch sai khỏc nucleotide loi Hi ng vng Camellia tienii so vi cỏc loi cũn li) loi tr hoa vng cũn li cú trỡnh t rbcL ging ht v ging vi trỡnh t loi Camellia oleifera trờn NCBI Mc tng ng cao trờn 99% ca trỡnh t rbcL cỏc loi tr cho thy on trỡnh t ny rt bo th khụng ch trờn i tng tr hoa vng m cũn cỏc loi tr khỏc thuc chi Camellia núi chung Tuy nhiờn mc ớch s dng khụng yờu cu phõn loi n mc loi, trỡnh t matK v rbcL thu c l s la chn phự hp giỏm nh tng i d nhõn bn v gii trỡnh t 3.3.1.3 Kt qu phõn tớch trỡnh t on trnH-psbA Kt qu phõn tớch so sỏnh cho thy on trnH-psbA gia cỏc loi Tr hoa vng cú s sai khỏc tng i ln di cỏc on trnH-psbA cỏc loi Camellia tienii, Camellia hakodae, Camellia crassiphylla, Camellia tamdaoensis v Camellia petelotii ln lt l 502, 509, 504, 504 v 510bp, ú Camellia crassiphylla v Camellia tamdaoensis l hai loi cú trỡnh t trnH-psbA khỏc bit nht so vi cỏc loi khỏc v so vi loi Camellia oleifera trờn ngõn hng gen NCBI S sai khỏc tng i ln gia cỏc loi cựng chi Camellia núi chung v cỏc loi Tr hoa vng nghiờn cu núi riờng cho thy on trỡnh t trnH-psbA l du chun tim nng cho vic phõn bit cỏc loi tr hoa vng s dng mó vch ADN Cõy phõn loi sinh hc xõy dng c cho thy hai loi Camellia tienii Ninh, Tr v Camellia hakodae Ninh cú mi quan h gn vi nhau, ng thi cỏc loi Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda, Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh v Camellia petelotii (Merr.) Sealy cú v trớ gn hn bc phõn loi C loi tr ny u cú mi quan h gn hn c vi loi Tr vng Camellia tonkinensis, tip theo sau ú l cỏc loi Camellia yunnanensis, Camellia sinensis var Sinensis, Camellia leptophylla Hinh 3.3 Cõy phõn loi sinh hc xõy dng da trờn trỡnh t on gen rbcL 10 Hinh 3.4 Cõy phõn loi sinh hc xõy dng da trờn trỡnh t on trnH-psbA 11 3.3.1.4 Kt qu gii trỡnh t on ycf1b Gii trỡnh t on ycf1b cỏc loi Tr hoa vng thu c on di 762bp cỏc loi Camellia tienii, Camellia hakodae; 756bp cỏc loi Camellia crassiphylla, Camellia tamdaoensis v 750bp loi Camellia petelotii So vi hai on matK v rbcL, trỡnh t ycf1b ó cho thy mc khỏc bit rừ rt hn, th hin tim nng giỏm nh tt hn nu c kt hp vi mt vi trỡnh t mó vch khỏc Cõy phõn loi sinh hc da trờn trỡnh t on ycf1b cho thy ba loi Camellia crassiphylla, Camellia tamdaoensis v Camellia petelotii cú mi quan h gn gi vi hn so sỏnh vi hai loi cũn li Camellia tienii v Camellia hakodae Cỏc loi ny cng cú mi quan h gn hn c vi hai loi Camellia pitardii v Camellia crapnelliana 3.3.1.5 Kt qu gii trỡnh t on ITS2 Kt qu so sỏnh cho thy so vi cỏc on trỡnh t lc lp nghiờn cu, on ITS2 cú mc sai khỏc gia cỏc loi Tr hoa vng ln nht õy cng l on trỡnh t cú s v trớ mang thụng tin nhiu nht s on trỡnh t (2 v trớ) Tuy nhiờn tng ng 100% gia loi Hi ng vng T88 Camellia tienii, Tr vng hakoda T89 Camellia hakodae, Tr vng petelo T92 Camellia petelotii cho thy cú mc sai khỏc cao gia nhiu loi, song cú nhng loi ging v trỡnh t on ITS2, vy on ITS2 khụng thớch hp lm du chun c hiu cho cỏc loi Tr hoa vng VQG Tam o Mi quan h gia cỏc loi Tr hoa vng nghiờn cu da trờn trỡnh t ITS2 c th hin trờn cõy phõn loi sinh hc Trong ú, ba loi Camellia tienii Ninh, Tr., Camellia hakodae Ninh v Camellia petelotii cú mi quan h rt gn vi v tỏch bit vi nhỏnh cha hai loi Camellia crassiphylla v Camellia tamdaoensis Theo ú, cỏc loi tr nghiờn cu cng cú mi quan h gn vi cỏc loi Camellia impressinervis, Camellia yunnanensis, Camellia parvimuricata var Hupehensis, Camellia euphlebia v Camellia piquetiana 12 Hinh 3.5 Cõy phõn loi sinh hc xõy dng da trờn trỡnh t on ycf1b 13 ... số mẫu trà hoa vàng, nhân đoạn mã vạch ADN kỹ thuật PCR, phân tích xác định trình tự đoạn mã vạch ADN thu được, xác định mối quan hệ di truyền loài trà hoa vàng nghiên cứu với loài khác chi trà. .. thông qua việc xác định phân tích trình tự số đoạn mã vạch, tác giả tiến hành đề tài Xác định số đoạn mã vạch ADN cho số loài Trà hoa vàng Vƣờn Quốc gia Tam Đảo với đối tượng phân tích năm vùng... tự đoạn Mã vạch ADN cho loài trà hoa vàng VQG Tam Đảo 3.3 Giải trình tự phân tích trình tự đoạn mã vạch ADN 3.3.1 Kết giải trình tự Kết giải trình tự nucleotide đoạn mã vạch cho thấy với loài trà