Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme protease năng suất 500 kg sản phẩmngày

LỜI NÓI ĐẦUEnzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa choquá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóngvai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩ

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 6

CHƯƠNG 1 LẬP LUẬN KINH TẾ 8

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 8

1.2 Vị trí xây dựng 8

1.2.1 Đặc điểm tự nhiên 9

1.2.2 Giao thông vận tải 9

1.2.3 Nguồn nguyên liệu 10

1.2.4 Điện – Nước – Xử lý nước thải 10

1.2.5 Nhân lực 11

1.2.6 Tiêu thụ 11

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

2.1 Giới thiệu về enzyme protease 12

2.1.1 Định nghĩa enzyme protease 12

2.1.2 Phân loại nhóm enzyme protease 12

2.1.3 Tình hình nghiên cứu enzyme protease 14

2.1.4 Ứng dụng của enzyme protease 16

2.1.5 Nguồn thu nhận enzyme protease 17

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis 22

2.2.1 Lịch sử phát triển 22

2.2.2 Đặc điểm phân loại 22

2.2.3 Đặc điểm hình thái 22

2.2.5 Đặc điểm sinh hóa 23

2.2.6 Hệ enzyme của Bacillus subtilis 24

2.2.7 Nghiên cứu và ứng dụng enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis 25

2.2.8 Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis 27

2.2.9 Sinh tổng hợp protease của Bacillus subtilis 30

2.3 Thu nhận và tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis .34

2.3.1 Chế phẩm enzyme thô 34

2.3.2 Chế phẩm enzyme kỹ thuật 34

2.3.3 Chế phẩm enzyme tinh khiết 34

2.3.4 Một số phương pháp tinh sạch enzyme protease kỹ thuật 34

CHƯƠNG3 LỰA CHỌN VÀ THUYẾT MINH QUY TRÌNH CÔNG

NGHỆ 37

3.1 Lựa chọn quy trình công nghệ 37

3.2 Thuyết minh quy trình công nghệ 39

3.2.1 Nguyên liệu 40

3.2.2 Pha chế dịch môi trường 44

3.2.3 Tiệt trùng và làm nguội 44

3.2.4 Nhân giống sản xuất 45

3.2.5 Cấy giống 45

3.2.6 Lên men 45

3.2.7 Ly tâm 46

3.2.8 Cô đặc 47

3.2.9 Kết tủa enzyme 47

3.2.10 Ly tâm 47

3.2.11 Hoàn tan tủa 47

3.2.12 Tuyển nổi 48

3.2.13 Phối trộn chất ổn định 48

3.2.14 Sấy chân không 48

3.2.15 Nghiền bột 50

3.2.16 Đóng gói 51

CHƯƠNG 4: TÍNH TOÁN CÂN BẰNG VẬT CHẤT 52

4.1 Kế hoạch sản xuất của nhà máy 52

4.2 Các số liệu ban đầu: 52

4.3 Hao hụt qua các công đoạn 52

4.3.1 Hao hụt khối lượng do vận chuyển qua các công đoạn 52

4.4 Sự thay đổi độ ẩm qua từng công đoạn 54

4.5 Cân bằng vật chất 54

4.5.1 Quy ước 54

4.5.2 Cân và bao gói sản phẩm 54

4.5.3 Nghiền bột 55

4.5.4 Sấy chân không 56

4.5.5 Phối trộn 57

4.5.6.Công đoạn tuyển nổi loại muối 59

4.5.7 Hòa tan tủa 59

4.5.8 Ly tâm thu tủa 59

4.5.9 Công đoạn kết tủa enzyme 59

4.5.10 Qúa trính cô đặc 60

4.5.11 Ly tâm thu enzyme thô (ly tâm 1) 63

4.5.12 Lên men 63

4.5.13 Làm nguội 65

4.5.14 Tiệt trùng 65

4.5.15 Pha chế môi trường lên men 65

4.5.16 Chuẩn bị môi trường nhân giống 68

4.6 Tổng kết 71

CHƯƠNG 5: TÍNH VÀ CHỌN THIẾT BỊ 73

5.1 Bảng liệt kê các thiết bị có trong dây chuyền sản xuất enzyme protease 73

5.2 Một số công thức thường sử dụng trong phần này 74

5.2.1 Công thức tính số thiết bị cần chọn làm việc liên tục 74

5.2.2 Công thức tính số thiết bị làm việc gián đoạn 74

5.2.3 Công thức tính bunke 74

5.3 Tính và chọn các thiết bị chính trong phân xưởng sản xuất 76

5.3.1 Tính và chọn thiết bị phân ly từ tính 76

5.3.2 Tính và chọn thiết bị nghiền bột 77

5.3.3.Tính và chọn thiết bị dịnh lượng bột vỏ trấu 78

5.3.4 Tính và chọn thiết bị xử lý rỉ đường bằng acid 79

5.3.4.Tính và chọn thiết bị ly tâm rỉ đường 79

5.3.5 Tính và chọn thiết bị tiệt trùng làm nguội 80

5.3.5 Tính và chọn thiết bị nhân giống 81

5.3.6 Tính và chọn thiết bị lên men 84

5.3.7 Tính và chọn thiết bị ly tâm 1 85

5.3.8 Tính và chọn thiết bị cô đặc 86

5.3.9 Tính và chọn thiết bị kết tủa enzyme 87

5.3.10 Tính và chọn thiết bị ly tâm tách enzyme kết tủa 88

5.3.11 Tính và chọn thiết bị tuyển nổi 89

5.3.12 Tính và chọn thiết bị phối trộn 90

5.3.13 Tính và chọn thiết bị sấy chân không 91

5.3.14 Tính và chọn thiết bị nghiền bột 92

5.3.15 Tính và chọn thiết bị bao gói 93

5.3.16 Tính và chọn thiết bị định lượng 94

5.3.17 Tính và chọn thùng chứa 95

5.3.18 Tình và chọn bunke 96

5.3.19 Tính và chọn thùng chứa nước cho quá trình nhân giống và pha môi trường lên men 100

5.3.20 Tính và chọn thiết bị vận chuyển 101

5.4 Bảng tổng kết thiết bị 107

5.4.1 Thiết bị chính trong quy trình sản xuất 107

5.4.2 Thùng chứa, bunke, thùng chứa nước 108

5.4.3 Bảng tổng kết các thiết bị vận chuyển 109

LỜI NÓI ĐẦU

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa choquá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóngvai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong

y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo

vệ môi trường

Nghiên cứu, sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme đượcphát triển mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến này Công nghệ sản xuấtenzyme đã đem lại những lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước, ViệtNam là một trong nhiều nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụngenzyme, Tuy nhiên, nền công nghiệp của nước ta chưa thực sựphát triển

Ngành công nghệ enzyme có mối liên hệ chặc chẻ với cácngành nghề khác, do vậy để thúc đẩy sự phát triển của các ngànhkhác, thì ngành công nghệ enzyme nói riêng và các ngành khácthuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học phải đi trước một bước, việc sảnxuất và đưa vào sử dụng các sản phẩm sinh học trong nước thaythế dần nguồn hàng ngoại nhập sẽ cải thiện đáng kể khả năngcạnh tranh của hàng hóa trong nước trước xu thế hội nhập toàncầu như hiện nay

Lý do tôi chọn đề tài sản xuất enzyme protease cho khóaluận tốt nghiệp của mình cũng xuất phát từ những quan điểm trên,việc hiểu rõ về các quá trình trong việc xây dựng nhà máy trênmặt lý thuyết sẽ giúp chúng ta có thể nắm bắt nhanh công nghệvào sản xuất khi tham gia vào xây dựng nhà máy thực tế.!

CHƯƠNG 1 LẬP LUẬN KINH TẾ 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Nhằm đón đầu các nguồn đầu tư từ Quốc tế vào khu vựcmiền trung – Tây Nguyên, và nhằm mục đích thực hiện chiến lượcđưa khu vực kinh tế Miền trung – Tây Nguyên thành khu vực kinh

tế trọng điểm Quốc gia, việc lựa chọn vị trí và hình thành các khucông nghiệp gắn liền với các thuận lợi về mặt địa lý, nguồn nguyênliệu, nguồn nhân lực tại địa phương là một chiến lược hiệu quả đểtriển khai các mục tiêu như đã đề cập

Và thực tế trong vòng 10 năm qua khu vực Miền trung – TâyNguyên đã hình thành nhiều khu công nghiệp lớn, giúp giải quyếthàng ngàn công việc cho nhân dân, góp phần to lớn trong việcphát triển kinh tế tại địa phương Thực tế cho thấy sự phát triểnvượt bậc của thành phố Đà Nẵng như ngày hôm nay chính là nhờnhững cố gắn trong việc đón đầu những nguồn đầu tư từ các Dự ánQuốc tế vào Đà Nẵng

Trên đà của sự thành công đó, Đà Nẵng tiếp tục đề ra các kếhoạch phát triển mới cho tương lai với trọng tâm lấy sự phát triểncủa ngành Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thông tin làm mũinhọn để tăng tốc sự phát triển của nền kinh tế không chỉ của ĐàNẵng mà cho toàn bộ khu vực Miền Trung – Tây Nguyên

Từ khi xuất hiện các khu công nghiệp về thực phẩm, dượcphẩm, thủy hải sản… trên địa bàn Đà Nẵng và các khu vực liên kếtvới Đà Nẵng, nhận thấy một nhu cầu rất lớn về nguồn enzyme chocác quá trình sản xuất của các nhà máy, xí nghiệp, trong đó đáng

kể nhất là nhu cầu về enzyme Protease trong ngành chế biến thựcphẩm, dược phẩm và chế biến thủy sản Cùng với những thuận lợi

sẽ đề cập chi tiết ở các mục tiếp theo Tôi quyết định đề xuất xâydựng nhà máy sản xuất enzyme protease kỹ thuật từ vi khuẩn

Bacillus subtilis, theo phương pháp lên men chìm năng suất 1000

kg sản phẩm/ca, đặt tại khu công nghiệp Hòa Cầm

1.2 Vị trí xây dựng

Việc chọn Đà Nẵng làm địa điểm xây dựng nhà máy có nhiềuthuận lợi đối với quá trình sản xuất của nhà máy, trong đó các yếu

tố tác động tích cực đến quá trình xây dựng nhà máy bao gồm:đặc điểm tự nhiên, giao thông vận tải, nguồn nguyên liệu, các vấn

đề điện nước, xử lý nước thải và đặc biệt là vấn đề tiêu thụ vànguồn nhân lực của Đà Nẵng

Khu công nghiệp Hoà Cầm có vị trí địa lý nằm về phía TâyNam Thành phố Đà Nẵng, giáp đường Quốc lộ 14B thuộc trục hànhlang kinh tế Đông Tây Là khu công nghiệp có vị trí thuận lợi nhấttrong 5 khu công nghiệp tại Đà Nẵng

1.2.1 Đặc điểm tự nhiên

Khí hậu Đà Nẵng chia ra làm hai mùa, mùa nắng từ tháng 1đến tháng 8, mùa mưa từ tháng 9 đến tháng 12, nhiệt độ trungbình khoảng 280C, độ ẩm tương đối trung bình 28%, hướng gió chủyếu là Đông Nam Với điều kiện tự nhiên, khí hậu như vậy việc xâydựng nhà máy sản xuất enzyme protease nói tên là hoàn toàn có

cơ sở Hơn thế nữa điều kiện đất đai, khi hậu của các vùng lân cận,

Đà Nẵng thuận lợi cho việc trồng các loại cây giàu tinh bột như:lúa, ngô, khoai, sắn…

Khu công nghiệp Hòa Cầm nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới,chia hai mùa rõ rệt: mùa mưa và mùa khô Mùa mưa thường kéodài từ tháng 8 đến tháng 12, mùa khô kéo dài từ tháng 1 đếntháng 7

Nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng 25,9°C; cao nhất cáctháng 6,7,8, trung bình 28 - 30°C; thấp nhất vào các tháng 12,1,2,trung bình 18 - 23°C; bão thường đổ bộ trực tiếp vào thành phốcác tháng 9, 10 hàng năm

Độ ẩm không khí trung bình là 83,4%; cao nhất vào cáctháng 10,11, trung bình 85,67 - 87,67%; thấp nhất vào các tháng6,7, trung bình từ 76,67 - 77,33%

Lượng mưa trung bình hàng năm 2504,57 mm; lượng mưacao nhất vào các tháng 10,11, trung bình từ 550 - 1000 mm/tháng;thấp nhất vào các tháng 1,2,3,4, trung bình từ 23 – 40 mm/tháng

Số giờ nắng bình quân trong năm là 2156,2 giờ, nhiều nhấtvào các tháng 5,6, trung bình từ 234 - 277 giờ/tháng; ít nhất là vàocác tháng 11,12, trung bình từ 69 - 165 giờ/tháng [1]

1.2.2 Giao thông vận tải

Đà Nẵng nằm ở Trung độ của nước Việt Nam, trên trục giaothông Bắc - Nam về đường bộ, đường sắt, đường biển và đườnghàng không, trung tâm thành phố cách Thủ đô Hà Nội 764km vềphía Bắc, cách thành phố Hồ Chí Minh 964 km về phía Nam

Ngoài ra, Đà Nẵng là đầu mối giao thông nối với vùng Châu Á

- Thái Bình Dương và Thế giới, là một trong những cửa ngõ quantrọng ra biển của Tây Nguyên và các nước Lào, Campuchia, TháiLan, Myanma đến các nước vùng Đông Bắc Á thông qua Hành langkinh tế Đông Tây với điểm kết thúc là Cảng biển Tiên Sa Các trungtâm kinh doanh - thương mại quan trọng của các nước trong vùngĐông Nam Á và Thái Bình Dương đều nằm trong phạm vi bán kính2.000 km từ thành phố Đà Nẵng

Cự ly từ Khu công nghiệp đến các công trình hạ tầng quantrọng của Thành phố Đà Nẵng như sau:

Hình 1.1 Vị trí khu công nghiệp Hòa Cầm trên bản đồ thành

phố Đà Nẵng

1.2.3 Nguồn nguyên liệu

Dù không được xếp vào khu vực có nền nông nghiệp pháttriển là điều kiện để sản xuất các sản phẩm về enzyme, nhưng ĐàNẵng lại là khu vực giáp với nhiều vùng nông nghiệp phát triểnnhư Quảng Nam, Huế

Đặc biệt Đà Nẵng là nơi tập trung rất nhiều nhà máy chế biếnthực phẩm từ nguồn nguyên liệu nông nghiệp như các nhà máysữa bắp, các nhà máy bia, cồn… Bên cạnh đó sự tập trung củanhiều cơ sở chế biến các sản phẩm thủy sản cũng có ý nghĩa thuậnlợi đối với dây chuyền sản xuất enzyme protease

1.2.4 Điện – Nước – Xử lý nước thải

Nhà máy dự định sẽ đặc tại khu công nghiệp Hòa Cầm với cơ

sở hạ tần đã hoàn thiện Nguồn cung cấp điện và nước sạch chosản xuất sẽ được lấy từ hệ thống cung cấp của khu công nghiệpkết hợp với quá trình xử lý khi tiếp nhận tại nhà máy

Toàn bộ nước thải của nhà máy sẽ được thu gom và xử lý sơ

bộ đáp ứng yêu cầu về tiêu chuẩn đầu ra theo quy định của Khucông nghiệp Hòa Cầm trước khi thải ra khu xử lý nước thải tậptrung của khu công nghiệp Hòa Cầm Tại trạm xử lý nước thải củaKCN có công suất 4000 m3/ca Nước thải sẽ được xử lý đạt tiêu

chuẩn TCVN 5945 – 2005 trước khi cho thải ra hệ thống thoát nướcchung của khu vực [1].

Như vậy vấn đề Điện - Nước – Xử lý nước thải rất thuận lợikhi xây dựng nhà máy tại khu công nghiệp Hòa Cầm

1.2.5 Nhân lực

Về nguồn nhân lực: Đà Nẵng là nơi tập trung của các cơ sởđào tạo, các trường đại học và các viện trung tâm có liên quan đếnngành Công nghệ sinh học, với yếu tố là nguồn nhân lực trẻ, năngđộng, dồi dào và có kiến thức sâu trong lĩnh vực enzyme, đó chính

là sự thuận lợi đáp ứng cho sự vận hành sản xuất của nhà máy

1.2.6 Tiêu thụ

Vấn đề tiêu thụ là một trong hai vấn đề quan trọng nhất khiquyết định xây dựng nhà máy, nguồn nguyên liệu bền vững và đầu

ra thuận lợi sẽ giúp nhà máy làm việc hiệu quả với năng suất thiết

kế, đảm bảo việc làm cho người lao động và doanh thu của nhàmáy

Nhà máy sản xuất enzyme protease được xây dựng tại cụmcác Khu công nghiệp tại Đà Nẵng, với nhiều nhà máy sản xuất vàchế biến thực phẩm, các xí nghiệp thủy hải sản, các nhà máy dệt,

… cho thấy tìm năng tiêu thụ sản phẩm là rất lớn

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về enzyme protease

2.1.1 Định nghĩa enzyme protease

Protease là enzyme xúc tác thủy phân các liên kết peptide CO-NH-)n trong phân tử protein tạo thành các peptide ngắn và cuốicùng tạo ra acid amin và NH3

(-Hình 2.1: Cấu trúc không gian và trung tâm hoạt động

của enzyme protease

Protease là một nhóm enzyme được ứng dụng trong nhiềulĩnh vực như: Nông nghiệp, công nghệ Thực phẩm, trong y học,trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường Trong những năm gầnđây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trê toàn thếgiới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủyphân (trên 75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớnnhất sử dụng trong công nghiệp (trên 60%)

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chứcnăng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rấtrộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm vàvirus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê )

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật cónhững đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một

hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau vềcấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dướidạng tinh thể đồng nhất [2]

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nênprotease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩmthuỷ phân triệt để và đa dạng [2].

2.1.2 Phân loại nhóm enzyme protease.

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3

(E.C.3.4)

Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease

Hệ enzyme protease được phân chia thành hai nhóm

enzyme: endopeptidase và exopeptidase.

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidaseđược phân chia thành hai phân nhóm:

Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu

nhóm nitơ amin (-NH2) tự do của chuỗi polypeptide và giải phóng

ra một amino acid một dipeptide hoặc một tripeptide

Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu

carbon của mạch polypepide và giải phóng ra một amino acidhoặc một dipeptide

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được

chia thành bốn phân nhóm:

Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm (-OH) của

gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quantrọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồmhai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin baogồm các enzyme động vật như: chymotrypsin, trypsin, elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisincarslberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt độngmạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đốirộng

Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm (-SH) trong

trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinasethực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật vàproteinase ký sinh trùng Các cysteine proteinase thường hoạtđộng ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc

nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhưpepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase cóchứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạtđộng mạnh ở pH trung tính

Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase

được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậtcao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pHtrung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA [7]

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơnthành ba nhóm:

Protease acid: hoạt động ở pH từ 2 đến 4, có nhiều ở tế bàođộng vât, nấm men, nhưng ít thấy ở vi khuẩn

Protease trung tính: hoạt động ở pH từ 7 đến 8, như papain từ

đu đủ, bromelaine từ dứa

Protease kiềm: hoạt động ở pH từ 9 đến 11

2.1.3 Tình hình nghiên cứu enzyme protease

2.1.3.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease trên thế giới

Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiêncứu sớm hơn cả Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy,

đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm Năm 1861Brucke cũng đã tách được pepxin từ dịch dạ dày chó ở dạng tươngđối tinh khiết Ngoài các enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đãquan sát đầu tiên về các protease trong máu

Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn Năm 1879Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật.Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân

tử của nhiều protease như: papain, tripxin, kimotripxin,subtilizin…

Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứunhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã pháthiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong hơn 10năm nay số công trình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lênđáng kể nhiều hơn các protease của động và thực vật Những kếtquả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô sảnxuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế

Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt proteaseđộng vật, thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu Thờigian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu

về protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vựcnày protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu củaenzyme toàn thế giới Hiện nay, số lượng các enzyme được sảnxuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất là châu

Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sảnxuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD Trong đó khoảng

600 tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồmkhoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc Những nước

có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giớilà: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức,

Áo Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu,

sản xuất và ứng dụng protease từ vi sinh vật Chính vì thế nhịp độsản xuất protease ở quy mô công nghiệp tại các nước pháttriển hàng năm tăng vào khoảng 5%- 10% Ngày nay người ta cóthể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tancho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần Vì vậy mà việc ứngdụng protease ngày càng gia tăng [3].

2.1.3.2 Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước

Hiểu được vai trò và tiềm năng của ngành công nghệ enzymemang lại, trong số đó là bộ ba enzyme quan trọng: hệ enzymeamylase, hệ enzyme protease và enzyme cellulose, trong nước tanhững năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu với nhữngứng dụng thực tiễn đối với nền kinh tế trong nước, đó là nhữngnghiên cứu cải thiện chất lượng thức ăn chăn nuôi, các nghiên cứuứng dụng enzyme trong lĩnh vực thực phẩm, y học… Có thể kể đếnmột số công trình tiêu biểu của các nhà khoa học trong nước nhưsau:

Trần Quốc Hiền, Lê Căn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sauthu hoạch, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học

Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu và thu nhận chế phẩm protease từ ruột các Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006 Nghiên cứu này khảo sát quá trình

trích ly và tinh sạch enzyme protease từ ruột cá Basa Dịch chiếtprotease kiềm thu được có hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT(chất khô nội tạng) trong điều kiện chết: Tỷ lệ mẫu/dung môi1:1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút [4]

Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Tồn,Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH tự nhiên, ĐH

Quốc gia TP Hồ Chí Minh, đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm các Serine protease từ Trùn Quế” (2007), Bước đầu khảo sát

hệ enzyme protease từ trùn quế (Perionyx excavalus) cho thấyphần lớn các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinhsạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độtrong khoảng 30% - 80% bão hòa Nhiệt độ và pH tối ưu cho

enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 550C và pH trongkhoảng kiềm từ 10 đến 12 [5]

Nguyễn Châu Sang, Nguyễn Thị Hà, Trường Đại Học Cần Thơ

đã nghiên cứu “Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của protease chịu kiềm từ Bacillus sp.sv1” Các tác giả đã tinh sạch

bằng phương pháp tủa ammonium sulfate bão hòa ở nồng độ 60%,kết hợp sắc ký trao đổi ion dương SP-streamline và sắc ký trao đổiion âm Unosphere Q với đệm phosphate pH 7,8 Bằng kỹ thuậtSDS-PAGE và điện di nhuộm hoạt tính với cơ chất casein, proteaseđược xác định là một đơn phân có khối lượng phân tử khoảng 19,2kDa Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lênhoạt tính cho thấy protease này hoạt động ở pH tối ưu 9,0 và nhiệt

độ tối ưu 450C, và sự có mặt của 2,5mM ion Ca2+ làm tăng hoạttính protease gấp 2 lần [6]

2.1.4 Ứng dụng của enzyme protease

Enzyme protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiệnnay trong một số ngành sản xuất như:

Trong công nghiệp sữa:

Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làmđông tụ sữa của chúng Protease từ một số vi sinh vật như

A.candidus, P.roquerti, B.mesentericus… được dùng trong sản xuất

phomat

Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy…

Protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễnbột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

Trong công nghiệp chế biến thịt:

Protease được dùng để làm mềm thịt nhờ sự phân hủy mộtphần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thíchhợp và có vị ngon hơn

Trong chế biến thủy sản:

Khi sản xuất nước mắm (và một số loại mắm) thường thờigian chế biến kéo dài, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thuộcvào phương pháp gài nén và nguyên liệu cá Nên hiện nay quytrình sản xuất nước mắm ngày càng hoàn thiện trong đó sử dụng

chế phẩm enzyme thực vât (bromelain và papain) và vi sinh vật đểrút ngắn thời gian sản xuất và cải thiện hương vị của nước mắm.

Trong sản xuất bia:

Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc gia tăng

độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A.oryzae

được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện

xử lý bia tốt hơn

Trong công nghiệp thuộc da:

Protease được sử dụng để làm mềm da nhờ sự thủy phân mộtphần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làmcho da bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làmcho da có độ mềm dẻo nhất định Hiện việc đưa các protease từ vi

khuẩn (B mensentericus, B subtilis), nấm mốc (A oryzae, A flavous) và xạ khuẩn (S fradiae, S.griseus, S rimosus…) vào công

nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vịtrí quan trọng

Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác như:

Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, tăng vịtrong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng

Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với enzymeamylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có

độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

Điều chế môi trường dinh dưỡng tron sản xuất vaccine, khángsinh…

Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt các chấtbẩn protein, sản xuất mỹ phẩm….[21]

2.1.5 Nguồn thu nhận enzyme protease

2.1.5.1 Nguồn thu từ thực vật

Thực vật có nguồn enzyme protease đã được loài người hiểubiết và ứng dụng rất lâu Cho đến nay, người ta đã thu nhậnenzyme protease từ thực vật để ứng dụng vào các ngành sản xuất

khác nhau, các enzyme thu nhận từ thực vật với số lượng lớn baogồm: bromelin, papain, ficin.

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứanhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ

họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái) Bromelin cóvai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều, Bromelin làenzyme thủy phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinhvật Một trong những lợi ích của nó được chú ý đến là một chất

giúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động ở môi trường acid trong dạ dày

và cả môi trường kiềm ở rụôt non Bromelin có thể thay thế cho cảnhững enzyme tiêu hóa khác như pepsin,và trypsin Bromelin cótác dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh viêmthấp khớp, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelin như mộtchất làm giảm đau, kháng viêm và kháng sưng

Được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, papain thuộc nhómenzyme thủy phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiềunhất về tính chất và cơ chế hoạt động, Papain là một sulfhydrylprotease, đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ông [7]

Ficin (ficain) là một protease được tìm thấy trong nhựa của cây thuộc họ Ficus (sung vả), thuộc họ Moraceae, bộ Urticales.

Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứanhóm sulfhydryl ( -SH ) Trình tự các amino acid ở gần trung tâmphản ứng gần giống với papain và bromelin [7]

Pepsin là một enzyme quan trọng của tuyến tiêu hóa độngvật, thuộc nhóm enzyme thủy phân, pepsin có khả năng phân cắc

Hình 2.3: Dứa và đu đủ, nguồn

protease thực vật

các liên kết peptide của protein Pepsin tác động lên hầu hết cácprotein tự nhiên và có khả năng phân cắt tới 30% liên kết peptide

có trong phân tử protein tạo thành chủ yếu các peptide chứa từ 5 –

8 amino acid

Renin được định nghĩa là enzyme đông tụ sữa, được tìm thấy

ở dịch tiêu hóa của ngăn thứ tư dạ dày bê Nó được khám phá bởiHeinz, năm 1951 Renin là một protease acid, là thành phần chủyếu của rennet chiết rút từ ngăn thứ tư của dạ dày bê dưới 5 thángtuổi, càng gần 5 tháng tuổi, thành phần rennin trong rennet cànggiảm đi Nó là enzyme chuyên gây đông tụ sữa nên người ta còngọi tên là enzyme đông tụ sữa điển hình [7]

2.1.5.3 Nguồn thu từ vi sinh vật

Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Cácenzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trườngnuôi cấy Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô côngnghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp,trong nông nghiệp và trong y học Các loài vi sinh vật có khả năngtổng hợp mạnh protease được trình bày ở bảng sau [7]:

Bảng 2.1: Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

ColagenaseColagenase

Protease trung tính, protease kiềm

Protease-kim loại, protease serin,

có na loại protease acid, proteasetrung tính, protease kiềm.Protease acid (aspergilopepti-daseA)

Protease trung tínhProtease kiềmHai protease: protease kiềm vàprotease trung tính.

Protease acidProtease kiềmProtease acid có tác dụng làmđông sữa đã dùng ở Nhật để thaycho rennin

Sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp chủ yếu dựa vào

vi sinh vật Như vậy, vi sinh vật đóng vai trò quyết định đến hìnhthái sản xuất enzyme hiện nay

A Streptococcus Faecalis; B Bacillus pumilus

C Aspergillus oryzae; D Bacillus subtilis

Hình 2.4: Một số nguồn thu enzyme protease từ vi sinh

vật

Các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease là Bacillussubtilis, Bacillus mensentericus, Bacillus thermorpoteoliticus vàmột số giống thuộc chi Clostridium Trong đó B.subtilis S5 có khảnăng tổng hợp Protease mạnh nhất Các vi khuẩn thường tổng hợpprotease ở vùng pH trung tính và kiềm [23]

So với động vật và thực vật, vi sinh vật có rất nhiều ưu điểm,Những ưu điểm đó được tóm tắc như sau:

Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh

Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy

mô công nghiệp:

Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinhtổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào

khí hậu bên ngoài Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thựcvật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được

Nguồn nguyên liệu dùn sản xuất enzyme theo quy mô côngnghiệp rẻ tiền và

dễ kiếm:

Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng Nhờ đó, ta có thểlàm giảm giá thành sản phẩm và có thể sản xuất ở mọi nơi trênthế giới

Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loạienzyme khác nhau

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.2.1 Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên Metallo proteinase của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium” Năm 1872,

Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông

và đặt tên là Bacillus subtilis.

Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa

bởi tổ chức y học Nazi của Đức Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu

để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Năm

1949 - 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết

của Bacillus subtilis Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu,

sử dụng rộng rãi trên thế giới Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy”

ra đời Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được

xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêuhóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…

Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng

rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi,công nghiệp, xử lý môi trường [8]

2.2.2 Đặc điểm phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis

thuộc:

- Bộ : Eubacteriales

- Họ : Bacillaceae

- Giống : Bacillus

- Loài : Bacillus subtilis

2.2.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím

Gram (+), có kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,5 - 3µm, đơn lẻ hoặcthành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông,sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào,kích thước từ 0,8 - 1,8µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm

do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở

100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất,chất sát trùng Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm Đã

có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 - 300 năm.

Hình 2.5: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính

hiển vi

2.2.5 Đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn Bacillus subtilis có một số đặc điểm sinh hóa như

sau:

Vi khuẩn Bacillus subtilis lên men không sinh khí với các loại

đường như: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose vàarabinose

Khi thử nghiệm các phản ứng sinh hóa, vi khuẩn Bacillus subtilis cho phản ứng indol âm tính, phản ứng MR-VP dương tính,

nitrate dương tính, sinh khí NH3 và không sinh H2S, cho phản ứngcatalase dương tính, amylase dương tính, casein dương tính,citrate dương tính, có khả năng di động và là vi khuẩn hiếu khí.

Bảng 2.2: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis

(Theo Holf 1992, trích Lý Kim Hữu 2005)

2.2.6 Hệ enzyme của Bacillus subtilis

2.2.6.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis

Trong tế bào Bacillus subtilis nói riêng và vi sinh vật nói

chung đều có những enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa Cácenzyme này được sinh tổng hợp và nằm trong sinh khối tế bào.Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng

tế bào Đó là những enzyme nội bào

Vậy, enzyme nội bào (endoenzyme) là những enzyme được visinh vật tổng hợp trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham giavào quá trình phân giải (dị hóa) các hợp chất hữu cơ có phân tửlượng thấp hay sinh tổng hợp các vật chất trong tế bào của chúng

Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis: các enzyme thủy

phân như protease nội bào (thường là peptidase và một sốprotease), pennicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; cácenzyme tổng hợp như aspagagin-syntetase; các enzyme tham giacác quá trình oxy hóa - khử như dehydrogenase, oxydase,

cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vậtchất có trong tế bào [8]

2.2.6.2 Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis

Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần

thiết cho quá trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiệnmôi trường: amylase (α-amylase), -glucanase, xylanase,protease…[8]

Bảng 2.3: Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng

Phản ứng thủy phân

α-amylase

70 - 80 5,6 - 6,2 Thủy phân liên kết

α-1,4-glucoside trong tinh bột vànhững polysaccharide khác tạo

35 - 55 6,0 - 7,0 Thủy phân liên kết

-1,6-glucoside của -glucan tạo ranhững chất có phân tử lượngthấp

Xylanase 25 5,0 Thủy phân liên kết xylan - một

thành phần của hemicellulose.Protease 40 6,2 - 7,4 Thủy phân liên kết peptide và

protein và các polypeptide, tạo

ra các peptide có phân tửlượng thấp hơn và các aminoacid

2.2.7 Nghiên cứu và ứng dụng enzyme ngoại bào của

Bacillus subtilis

2.2.7.1 Trong công nghệ chế biến thủy sản

Đã có những nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng enzyme

protease của Bacillus subtilis trong chế biến thủy sản như: sản

xuất bột đạm thủy phân từ cơ thịt cá mối Kết quả nghiên cứu cho

thấy enzyme protease của Bacillus subtilis có thể thủy phân mạnh

mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong

sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung protease của Bacillus subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và

thủy phân ở 50oC, pH tự nhiên của cơ thịt cá thì hỗn hợp thủy phân

có các chỉ tiêu cảm quan và hóa học tốt nhất Ðể ức chế quá trìnhgây thối của vi sinh vật trong quá trình thủy phân có thể bổ sungvào hỗn hợp thủy phân muối ăn với nồng độ 3% hoặc sorbitol vớinồng độ 4% hay ethanol với nồng độ 8%

Sản xuất nước mắm ngắn ngày cũng được nghiên cứu và ứngdụng vào sản xuất bằng các chế phẩm protease thu nhận từ vikhuẩn Để tăng quá trình thủy phân rút ngắn thời gian chế biếnnước mắm người ta đã tiến hành tạo nhiệt độ thích hợp choprotease hoạt động là khoảng 50oC và giảm độ mặn ban đầu củakhối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease với cábằng cách xay nhuyễn cá… Khi cho muối vào chượp cá thì nhiệt độthủy phân là 43 - 45oC và sẽ làm giảm hoạt độ của protease thủyphân cá Ở điều kiện thích hợp, việc bổ sung protease giúp rútngắn thời gian sản xuất nước mắm từ 6 - 9 tháng xuống còn 30 -

40 ngày Nước mắm ngắn ngày có hàm lượng đạm khá cao, tuynhiên về hương vị, độ ngon thì kém nước mắm dài ngày Người takhắc phục nhược điểm này bằng cách pha trộn nước mắm ngắnngày với nước mắm dài ngày hoặc bổ sung thêm hương vị vàonước mắm ngắn ngày Ngoài nhiệt độ thích hợp, độ xay nhuyễn cá

và bổ sung muối phù hợp cũng làm giảm đáng kể thời gian lênmen sản xuất nước mắm và đảm bảo chất lượng nước mắm thànhphẩm [8]

2.2.7.2 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da

Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâmướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da Thông thường các phươngpháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide,làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải củanhà máy này thải ra sông Việc sử dụng enzyme để thay thế cáchóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da vàlàm giảm ô nhiễm môi trường Enzyme protease có khả năng làmmềm da nhờ thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là

collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Kết quả đã loại bỏkhỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định,tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da Trước đây, đểlàm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêuhóa của động vật Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi

khuẩn (Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis), nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus) và xạ khuẩn vào công

nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vịtrí quan trọng

2.2.7.3 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa

Protease là một trong những thành phần không thể thiếutrong tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong giađình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánhrăng Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất làtrong bột giặt Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửathường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vếtbẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra Mộttiêu chuẩn quan trọng khác của các protease dùng trong chất tẩyrửa là hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng nhưphải thích hợp với các tác nhân oxy hóa và các chất kiềm hãm cótrong thành phần của chất tẩy rửa Tham số đóng vai trò chìa khóacho việc bổ sung protease nào vào chất tẩy rửa là pI của chúng.Một protease phù hợp khi pI của nó trùng với pH của dung dịchchất tẩy rửa Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những yêu cầu khắtkhe trên

Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản

xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 được thu nhận từ Bacillus subtilis Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ Bacillus licheniformis Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào

chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất

từ các chủng Bacillus và chủ yếu là từ Bacillus subtilis Trên thế

giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngànhcông nghiệp tẩy rửa Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và

Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95%lượng enzyme protease [8].

2.2.7.4 Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường

Việc ứng dụng các enzyme ngoại bào của vi sinh vật nói

chung và vi khuẩn Bacillus subtilis nói riêng đã và đang được

nghiên cứu với nhiều triển vọng và có những ứng dụng nhất địnhtrong việc xử lý ô nhiễm môi trường Phương pháp xử lý bằngenzyme là trung gian giữa hai phương pháp truyền thống, nó baogồm các quy trình hoá học trên cơ sở hoạt động của các chất xúctác có bản chất sinh học Enzyme có thể hoạt động trên các chất ônhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng bằng cách kết tủa hoặcchuyển chúng thành dạng khác Ngoài ra chúng có thể làm thayđổi các đặc tính của chất thải đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặcchuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn

Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, đểsản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinhdưỡng cho cá hoặc vật nuôi Protease thủy phân các protein khôngtan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên cácchất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên

bề mặt Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc

độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơchất và tạo ra những phần nhỏ

Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một mặt

để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải nàykhông còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, mặt khác để

xử lý Các phế thải protein tồn đọng trong các dạng chảy thànhdạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối

Lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể đượccoi như là nguồn protein cao trong tạo nên cấu trúc keratin cứngđược phá huỷ hoàn toàn Lông có thể được hoà tan sau khi xử lývới NaOH, làm tan bằng cơ học và bằng các enzyme thuỷ phân,

như protease kiềm từ Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có dạng

bột, màu xám với hàm lượng protein cao có thể được sử dụng làmthức ăn [9]

2.2.7.5 Trong nuôi trồng thủy hải sản

Trong nuôi trồng thủy sản Bacillus subtilis và một số loài

khác đã được ứng dụng với vai trò cải thiện sức khỏe, tăng cườngcác phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường Khả năng sinh cácenzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển

quá mức của vi sinh vật gây bệnh (Vibrio) giữ cho môi trường luôn

ở trạng thái cân bằng là đặc tính nỗi trội của nhóm vi khuẩn này[10]

2.2.8 Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis

2.2.7.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trườngcho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Trong nuôi cấy

bề mặt người ta sử dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trườngđặc (môi trường bán rắn)

Môi trường lỏng

Ở môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môitrường tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) vàpha khí (không khí) Ở đây, vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng

từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trìnhtổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối

và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằmtrong sinh khối vi sinh vật

Nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme trên môi trường lỏngtheo phương pháp nuôi cấy bề mặt thường được tiến hành trongcác khay có chiều cao khoảng 12 cm – 15 cm, chiều rộng và chiềudài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuậntiện trong thao tác

Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trườnglỏng Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, vi sinh vật sẽ không

có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khaynuôi cấy Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chấtdinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao

Trong nhiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trongkhay nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5 đến 7 cm là hợp lý [7]

Môi trường đặc

Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy vi sinhvật thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc Đểtăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường,người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môitrường

Trong trường hợp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môitrường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp

ra enzyme nội bào và ngoại bào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩmthấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằmtrong sinh khối vi sinh vật

Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơingăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà cònphát triển trên bề mặt của hạt môi trường, nằm hẳn trong lòng môitrường Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao vừa phải có độ ẩmthích hợp Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại, nếu độ

ẩm quá thấp sẽ không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Thôngthường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55% - 65% là hợp lý

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấy vi sinhvật thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20 đến 25% trấu đểlàm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho không khí dễ dàngxâm nhập vào lòng môi trường [7]

2.2.7.2 Phương pháp nuôi cấy chìm

Kỹ thuật nuôi cấy

Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sửdụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lênmen (fermentor) Trong các thiết bị lên men, người ta thường lắpđặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệthống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng Trong đó hệthống điều hòa không khí và hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rấtlớn Tỷ lệ cấy giống vào môi trường lỏng 2-2,5%, trong một sốtrường hợp nếu có giống tốt ta chỉ cần cho lượng giống 0,5 – 0,6%

là đủ [23]

Tác dụng của hệ thống thổi khí

Người ta thường cung cấp không khí vào bể lên men bằngmáy nén khí (compressor) Không khí sau khi ra khỏi máy nén khíđược làm nguội, làm sạch và tiệt trùng Không khí được phân phốivào thiết bị lên men bằng những ống dẫn khí có nhiều lỗ nhỏ Khikhông khí vào trong bể lên men, chúng có những tác động trựctiếp sau:

Làm xáo trộn môi trường Nhờ dòng khí vận chuyển trong môitrường lỏng, các chất dinh dưỡng, tế bào vi sinh vật sẽ phân phốiđều khắp môi trường và chúng luôn luôn ở trạng thái động Nhờ ởtrạng thái động như vậy, khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào

vi sinh vật sẽ rất cao Khả năng tiếp xúc này càng cao bao nhiêu,khả năng sinh tổng hợp enzyme sẽ cao bấy nhiêu

Nhờ có máy nén khí hoạt động, không khí được cung cấpthường xuyên, oxy sẽ tan trong môi trường và vi sinh vật sẽ pháttriển mạnh hơn (đối với vi sinh vật hiếu khí) Như vậy, đây là quátrình thúc đẩy vi sinh vật sinh sản và phát triển

Dòng khí được cung cấp liên tục và thải ra liên tục sẽ kéotheo những chất khí được tạo ra trong quá trình phát triển của visinh vật Những chất khí được tạo ra trong quá trình trao đổi chấtnày thường gây ức chế quá trình trao đổi chất, sinh sản và pháttriển của vi sinh vật Nhờ có dòng khí thổi vào môi trường sẽ hạnchế ảnh hưởng xấu của các chất khí được tạo ra từ quá trình traođổi chất [7]

Tác động của hệ thống khuấy trộn

Hệ thống khuấy trộn được thiết kế và lắp đặt trong các thiết

bị lên men không chỉ trong lên men hiếu khí mà cả trong lên menyếm khí Khuấy trộn là quá trình cơ học có ý nghĩa rất lớn trongthiết bị lên men thu nhận chế phẩm enzyme Các tác động đóđược tóm tắt như sau:

Cánh khuấy làm xáo trộn môi trường nuôi cấy, làm các thànhphấn môi trường và các tế bào vi sinh vật không lắng xuống, tăngkhả năng tiếp xúc của các thành phần môi trường và vi sinh vật từ

đó làm tăng khả năng trao đổi chất của vi sinh vật, lượng enzymethu được sẽ tăng lên

Trong lên men hiếu khí có thổi không khí, cánh khuấy hoạtđộng sẽ làm tăng khả năng hòa tan của oxy có trong không khí khiđược thổi vào môi trường Khi đó, các bọt khí, một mặt bị vỡ nhỏ

ra, tăng thiết diện tiếp xúc với dung dịch, một mặt dòng thoát khíkhỏi dung dịch sẽ tồn tại lâu hơn trong môi trường nước Thời giantồn tại của các bọt khí lâu sẽ làm tăng khả năng tan của oxy Visinh vật chỉ có thể đồng hóa oxy hòa tan chứ không có khả năngđồng hóa oxy ở dạng tự do

Cánh khuấy là tăng nhanh quá trình sinh sản vô tính do tácđộng cơ học [10]

2.2.7.3 Ưu nhược điểm của các phương pháp nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Ưu điểm

Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là dễ thực hiện

và khi bị nhiễm bởi vi sinh vật lạ thường xảy ra hiện tượng nhiễmcục bộ, ta rất dễ dàng xử lý

Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn so với dịch nuôi cấy chìmsau khi đã tách tế bào vi sinh vật

Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạttính enzyme, chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏhoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và tinh sạchenzyme

Tốn ít năng lượng (điện, hơi nước, công nhân) thiết bị, dụng

cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện ở quy mô gia đình, trangtrại cũng như quy mô lớn

Nhược điểm

Phương pháp nuôi cấy bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khíhóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ởcác mẻ không đồng đều [7],[11]

Phương pháp nuôi cấy chìm

Ưu điểm

Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến cókhả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần

môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiếthơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh, vô trùng.

Nhược điểm

Tuy nhiên do thu được canh trường có nồng độ enzyme thấpnên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao Tốn điện năngcho khuấy trộn, nếu không đảm bảo vô trùng sẽ nhiễm hàng loạt,gây tổn thất lớn [7], [11]

2.2.9 Sinh tổng hợp protease của Bacillus subtilis

2.2.9.1 Điều kiện nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí,

tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độtối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 - 7,4 [2]

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi

trường dinh dưỡng cơ bản:

Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩnlạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính

3 - 5 mm, sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu

Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩnphát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lạinhư vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều

Trên môi trường giá đậu - peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi,nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3

- 4cm sau 72 giờ nuôi cấy

Thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếpđến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trongthành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinhtrưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme

Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiệntượng cảm ứng Chất cảm ứng tổng hợp enzyme protease chothêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng củaenzyme cần tổng hợp (protein)

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra cácchất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác [11]

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng

hợp enzyme Protease Ví dụ: Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng

sinh tổng hợp Protease ở môi trường tinh bột >8% [11]

2.2.9.2 Các yếu tố ảnh hưởng

Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợpprotease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhaunhư: độ ẩm, nhiệt độ, độ pH, độ thông khí và thành phần môitrường…

Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát

triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng như tínhchất của enzyme được tổng hợp, mỗi loài có nhiệt độ thích hợpkhác nhau Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzymeđều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ

cao hơn nhiệt độ thích hợp Nhiệt độ tối ưu của Bacillus subtilis

sinh tổng hợp enzyme protease là 37oC [8]

Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi

cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổnghợp enzyme của vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu nhưkhông thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Ngượclại, trong phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường ảnh hưởngrất lớn đến đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh

vật Điều này thể hiện rất rõ ở các loài thuộc chi Bacillus pH môi

trường có thể thay đổi sau khi khử trùng hoặc trong quá trình pháttriển của vi sinh vật pH tối ưu cho sự phát triển và sinh tổng hợp

enzyme protease của Bacillus subtilis là 7,0 - 8,0 [8].

Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần môi trường vàcác sản phẩm trong

quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường có thểchuyển dần về phía acid hoặc kiềm Tuy nhiên, người ta nhận thấymột số vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy có khả năng tự điều chỉnh

pH môi trường Điều đó được giải thích là do chúng có khả năngtạo ra các enzyme chuyển hóa các acid hữu cơ được tạo ra dophân giải các carbohydrate thành các sản phẩm trung hòa Bởi vậychúng đã duy trì được pH thích hợp trong suốt quá trình phát triển

của chúng Chính vì thế khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus

trong đó có Bacillus subtilis để sinh tổng hợp enzyme người ta ít

khi bổ sung các chất trung hòa vì pH thay đổi không đáng kể (trích

Đỗ Thị Giang, 1988)

Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứuảnh hưởng của pH

ban đầu và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme

protease của Bacillus subtilis trong môi trường nuôi cấy thì kết quả cho thấy rằng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao nhất

khi nuôi cấy ở nhiệt độ 350C và pH ban đầu thích hợp nhất là 6,hoạt tính đạt được trong điều kiện nuôi cấy này là 0,560 HP/ml.Trong khi đó khi nuôi cấy với pH ban đầu là 10 ở các mức nhiệt độ

25oC, 55oC, 60oC chủng này hầu như không sinh enzyme

Ảnh hưởng của độ thông khí: nhiệt độ thông khí trong môi

trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease Tuynhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo loài vi sinh vật Trongmột số trường hợp:

Thiếu oxy, tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vậtnhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease Sự hiếu khí mạnhlại kìm hãm sinh tổng hợp protease

Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các

vi sinh vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự,1976)

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động của

protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease Thôngthường hoạt tính của protease có thể giữ được trong khoảng từ 60

- 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian Hoạt độngcủa protease chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy loài vi

khuẩn Protease của Bacillus subtilis sinh tổng hợp hoạt động tốt

nhất trong khoảng thời gian 46 - 68 giờ

Ảnh hưởng của nguồn carbon: nguồn carbon thường dùng để

nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và

cả polysaccharide (tinh bột), đặc tính tác dụng của nguồn carbonphụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của

vi sinh vật Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong môi trườngnuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng Ở

vi khuẩn Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá

mạnh khi nguồn carbon là tinh bột với nồng độ khoảng 8% Nếugiảm nồng độ tinh bột xuống còn 2% thì sẽ làm giảm một phầnhoạt tính trong quá trình phân giải protein của dịch môi nuôi cấy

Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứuảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của

Bacillus subtilis, các tác giả đã bổ sung các nguồn carbon khác

nhau như tinh bột hòa tan, maltose, lactose, saccharose vàdextrose với nồng độ 0,5% vào môi trường cơ bản thịt-peptone,đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng và tiến hành nuôi cấy thuenzyme thô, xác định hoạt tính enzyme Họ nhận thấy rằng tinh

bột hòa tan là nguồn carbon kích thích Bacillus subtilis sinh tổng

hợp protease tốt nhất, hoạt tính của enzyme thô (0,156 HP/ml) lớnhơn so với mẫu đối chứng (0,096 HP/ml) là 1,6 lần Điều này có lẽ

là do trong môi trường có tinh bột đã kích thích chủng này sinhamylase Chính amylase này (thực chất là nguồn protein) là chấtcảm ứng sinh protease… Ngược lại, với kết quả này, khi khảo sátảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của một

chủng Bacillus sp thì S.Mehrotra và cộng sự (1998) đã công bố

rằng tinh bột không có vai trò kích thích Trong khi đó, lactose,saccharose, dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của chủngnày (hoạt tính chỉ đạt được 0,016 HP/ml) Đối với dextrose, nhiềucông bố cho rằng dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của

Bacillus sp., những công trình khác lại cho là kích thích S.Mehrotra

và cộng sự (1998) cũng đã công bố rằng lactose, saccharose,

maltose có tác dụng kìm hãm khả năng sinh protease của Bacillus

sp

Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây lại dùng nguồn carbonkhác Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008), khi nghiên cứu về nguồn

carbon của chủng Bacillus subtilis 61 với những nguồn carbon khác

nhau như: trisodium citrate, casein, glucose và acid citric thì chỉ cótrisodium citrate và casein thì khả năng tổng hợp protease củachủng này cao hơn đáng kể so với các nguồn carbon còn lại Điều

đó cho thấy trisodium citrate và casein là những nguồn carbonthích hợp để tổng hợp protease Trong đó, trisodium citrate cho

kết quả cao nhất (0,034 UI/ml) Kết quả này cũng giống như kếtquả nghiên cứu của Meire và Wellingta (2004) trisodium citrate lànguồn carbon tốt cho việc tổng hợp protease.

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: các chất có thể dùng làm

nguồn nitrogen trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là cácchất hữu cơ hoặc các muối vô cơ Nhiều vi sinh vật còn có thể sửdụng nitrogen của HNO3

Nguồn nitrogen hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quátrình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứngcủa quá trình này Các nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bộtkhác nhau, nước chiết cám, nấm men tự phân, pepton và protein.Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng amino acid tương đốithấp

Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làmtăng đáng kể quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị BíchPhượng, 2006) Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứuảnh hưởng của nguồn nitrogen lên khả năng sinh tổng hợp

protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã dùng các nguồn

nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl cao nấmmen, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton vớicác nguồn nitrogen vô cơ khác Kết quả là sự phối hợp giữa nguồnnitrogen hữu cơ pepton và KNO3 đạt giá trị hoạt tính cao nhất là0,038 UI/ml so với các nguồn khác [8]

Theo kết quả nghiên cứu của Th.S Đỗ Thị Bích Thủy vàPGS.TS Trần Thị Xô năm 2004 “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh

hưởng lên khả năng sinh protease của B.subtilis” đã cho thấy

nguồn cacbon và nito có tác dụng kích thích cao nhất là tinh bột

và casein Thành phần nuôi cấy Bacillus subtilis ở quy mô phòngthí nghiệm bao gồm: pepton 1%, cao thịt 0,3%, muối 0,5%, tinhbột hòa tan 1,75%, cao nấm 0,1% pH ban đầu bằng 6,5, nhiệt độnuôi cấy thích hợp với môi trường tối ưu để Bacillus subtilis sinhprotease mạnh nhất là 370C [8]

2.3 Thu nhận và tách chiết enzyme protease của

1200C Chế phẩm enzyme thô này có thể bảo quản được 2 năm

Chế phẩm enzyme thô chứa nhiều loại enzyme khác nhau, vàlẫn tạp chất của môi trường nuôi cấy, chưa được tinh sạch Thườngđược sử dụng trong xử lý nước thải, rác thải

2.3.2 Chế phẩm enzyme kỹ thuật

Là chế phẩm enzyme đã được tinh chế sơ bộ trong đó cóchứa một hỗn hợp vài enzyme chủ yếu, các enzyme tạp đã đượcloại bỏ Thường được dùng trong thực phẩm và công nghệ tẩy rửa

2.3.3 Chế phẩm enzyme tinh khiết

Là chế phẩm chỉ chứa một loại enzyme duy nhất, được sửdụng trong y học, và nghiên cứu

2.3.4 Một số phương pháp tinh sạch enzyme protease

kỹ thuật

2.3.4.1 Phương pháp biến tính enzyme

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làmbiến tính các protein tạp Người ta đưa nhiệt độ của dung dịchenzyme lên 50-700C và pH < 5 Ở điều kiện này những enzymekhông bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ bị biến tính Sau

đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ cácthành phần không phải enzyme mà ta mong muốn

Phương pháp này ít được sử dụng vì nó chỉ thích hợp với cácenzyme chịu được acid và bền nhiệt Ngoài ra, phương pháp này

có thể được chỉnh ở pH > 11 với nguyên tắc tương tự khi muốntách enzyme chịu được môi trường bazơ [21]

2.3.4.2 Phương pháp kết tủa enzyme

Enzyme có thể được kết tủa bằng dung môi hữu cơ hoặcmuối, hoặc kết tủa tại điểm đẳng điện (pHi)

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Đối với enzyme có bản chất là protein cũng như các proteinkhác để có thể thu được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớpnước liên kết xung quanh phần tử này bằng cách bổ sung vào dịchprotein, enzyme các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lựcvới nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein

đó, giúp cho protein kết tủa xuống Ngoài ra khả năng kết tủa củadung môi hữu cơ còn được giải thích nhờ vào việc làm giảm hằng

số điện môi của dung dịch chưa enzyme, vì vậy cũng làm giảm lựctĩnh điện giữa các protein mang điện tích cùng dấu nên chúng kếtdính lại với nhau

Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa enzymeacetone và ethanol Henicker và Gortner đã từng dùng acetone đểkết tủa bromelin từ thân và trái dứa Bromelin trong dung dịchnước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kết tủađạt hiệu quả trong điều kiện lạnh ở 0-40C và aceton tinh khiết ở

200C Ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợpbromelin-ethanol cũng phải giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh Sau khithu được kết tủa, tủa bromelin phải được rửa bawngfg aceton vàlàm khô thật nhanh để bromelin không bị biến tính [21]

Kết tủa phân đoạn bằng muối

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ

sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các enzyme ở một nồng

độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hòa) được dùng để loại

bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme Các muối có thểdùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4….người ta nhận thấy muối(NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm ảnh hưởng mà còn làm ổnđịnh hầu hết các loại enzyme, loại muối này rẻ và phổ biến Độhòa tan của nó là rất lớn 767g/l ở 250C

Thường dùng hai dạng muối đó là dạng bột và bão hòa:

Khi dùng bột: người ta cho một ít bột vào dịch chứa enzyme.Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của