Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm Ngọc Linh

Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề: Nhân sâm Panax ginseng C A Meyer dược liệu sử dụng từ hàng ngàn năm Những tác dụng y học Nhân Sâm, dùng y học cổ truyền, chứng minh theo nguyên lý y học đại Nhân Sâm từ thuốc huyền thoại phương Đông xuất rộng rãi phương Tây, với sản phẩm thương mại đa dạng Nhân Sâm ngày thuốc mang lại giá trị kinh tế to lớn Việt Nam tự hào có loài Nhân Sâm đặc hữu Sâm Ngọc Linh (hay gọi Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., biết đến giới với tên gọi Vietnamese ginseng Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược chất Nhân sâm, đánh giá vào loại nhiều so với loài khác chi Panax giới Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh phát muộn (vào năm 1985) cho nên, có nhiều cố gắng để phát triển thuốc quý giá tiềm Sâm Ngọc Linh chưa hoàn toàn đánh thức Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm Ngọc Linh sớm đứng trước nguy tuyệt chủng Với nỗ lực địa phương có Sâm Ngọc Linh phân bố, loài dược liệu tránh bị tuyệt diệt Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành thuốc ngang hàng với loại Nhân sâm có thị trường dược liệu số lượng chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu Trên giới, Nhân Sâm Panax ginseng C A Meyer nhân giống sản xuất dược chất ginsenosid thành công nuôi cấy mô Ginsenosid chiết từ mô sẹo nuôi cấy mô Nhân sâm có dạng với ginsenosid thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý dịch chiết rượu methanol bột ginsenosid từ mô sẹo giống với dịch chiết bột thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên Do có hệ thống nuôi cấy lớn bioreactor dùng để sản xuất ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày rộng lớn, khắc phục hạn chế canh tác Nhân Sâm như: thời gian trồng kéo dài, bị giới hạn khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Sâm Ngọc Linh giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu Việt Nam cần tự nghiên cứu sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học giá trị kinh tế Sâm Ngọc Linh Trong hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô thật đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, muốn nghiên cứu đưa Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng đại, mang lại hiệu kinh tế cao bỏ qua kỹ thuật Thực tế, Sâm Ngọc Linh nhân giống thành công từ mô sẹo Nhưng tiến bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô chưa có nghiên cứu công bố Với mong muốn tìm hiểu loại trồng có giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, thực khóa luận tốt nghiệp: “Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) hướng dẫn thầy Bùi Văn Thế Vinh 1.2 Mục đích đề tài: - Tổng quan Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật ( tế bào đơn, mô, quan…) điều kiện vô trùng  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa hai nguyên tắc: - Dựa vào tính toàn tế bào: Mỗi tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Mỗi tế bào hệ thống mở, tự trì tự sản xuất để tiến hành chức chuyên biệt sản sinh hệ tế bào cần thiết - Dựa vào khả biệt hóa phản biệt hóa tế bào: Biệt hóa biến đổi tế bào từ trạng thái tế bào phôi thể chức Các tế bào dùng môi trường cấy có khả biệt hóa cấu trúc chức Trong điều kiện thích hợp, làm cho tế bào trở lại trạng thái tế bào sinh chúng - tế bào phôi trình gọi trình phản biệt hóa Vì tế bào gần với trạng thái tế bào phôi khả nuôi cấy thành công cao nhiêu  Ý nghĩa: - Nhân nhanh giống trồng - Bảo quản nguồn gen - Tạo bệnh - Sản xuất hoạt chất sinh học - Mang tính công nghiệp  Sơ lược lịch sử phát triển: SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 1665: Robert Hooke quan sát tế bào sống kính hiển vi đưa khái niệm tế bào - 1838: Matthias Schleiden Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào - 1904: Hannig nuôi cấy phôi loài họ cải - 1934: Kogl xác định vai trò IAA - 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng hoá chất điều hoà sinh trưởng phát sinh quan - 1952: Morel Martin thực vi ghép invitro thành công - 1962: Murashige Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật - 1964: Guha Maheshwari lần thành công tạo đơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà rốt - 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) Hapopappus gracilis - 1973: Phát Cytokinin có khả phá ngủ Gerberas - 1978: Marton cộng xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần - 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần sản xuất chất trao đổi thứ cấp quy mô công nghiệp nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp Mitsui 0Petrochemicals - 1988: Klein cộng tái sinh chuyển gen phương pháp bắn gen - 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr 2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 2.1.2.1 Nuôi cấy phôi Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng cần có chất điều hòa sinh trưởng để phát triển Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết tốt Ngoài số chất tự nhiên nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân chất cần nuôi cấy phôi Đối với chất điều hòa sinh trưởng, auxin thường dùng nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho phát triển phôi Nhiệt độ, ánh sáng ảnh hưởng đến phát triển phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp phôi phát triển tự nhiên Nhiệt độ 25 ± 2oC SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH thích hợp cho sinh trưởng nảy mầm phôi Các phôi thứ cấp khó sinh trưởng hoạt động chúng tách rời nuôi điều kiện chiếu sáng 4.000 lux chiếu sáng suốt ngày nuôi  Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu như: - Nhân giống trồng - Thử sức sống phôi hạt - Duy trì phôi yếu cứu phôi lai xa - Sản xuất hạt nhân tạo mà chất tế bào phôi 2.1.2.2 Nuôi cấy mô quan tách rời Trong nuôi cấy mô quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải tình trạng sinh lý tốt phát triển Nhu cầu dinh dưỡng nuôi cấy phận khác khác có số yêu cầu chung nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng chất điều hòa sinh trưởng Muốn trì sinh trưởng phát triển quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm chất hữu chứa nitơ dạng acide amine, đường inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng mô tách rời khả tổng hợp chất  Nuôi cấy mô quan tách rời ứng dụng trong: - Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phận mô - Nhân invitro - Tạo mô sẹo phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng tế bào, đột biến soma,… 2.1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Đặc điểm mô phân sinh chứa tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không bị virus xâm nhập, mô phân sinh mô virus Mô phân sinh thường mô đỉnh chồi cành Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ mầm non, chồi hình thành cành non Trong nuôi cấy cân chất điều hòa sinh trưởng quan trọng Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ bổ sung auxin  Nuôi cấy mô phân sinh sử dụng trong: - Tạo virus - Nhân giống invitro - Tạo đa bội qua xử lý colchicin - Nghiên cứu trình hình thành quan 2.1.2.4 Nuôi cấy bao phấn hạt phấn Ưu điểm nuôi cấy bao phấn đơn giản thao tác kỹ thuật môi trường nuôi cấy, tạo lưỡng bội từ soma thành bao phấn, khó phân biệt với tự lưỡng bội từ đơn bội Hạt phấn nuôi cấy phát triển thành đơn bội hoàn chỉnh điều kiện nuôi cấy invitro đường tạo phôi trực tiếp gián tiếp thông qua tạo mô sẹo tạo quan Phương pháp tạo đơn bội kép phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu chọn lọc cao, đặc biệt kết hợp với phương pháp tạo biến dị di truyền khác lai hữu tính gây đột biến nhân tạo Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen tuổi bao phấn điều kiện mà cho bao phấn sinh trưởng Quá trình sinh trưởng sau phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung muối khoáng vào môi trường Tần số phát sinh đơn bội sinh trưởng nói chung tốt chúng nuôi điều kiện chiếu sáng, hạt phấn số kiểu gen sinh trưởng hai điều kiện có chiếu sáng tối  Nuôi cấy bao phấn hạt phấn dùng cho tạo dòng để: SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH - Nghiên cứu gen lặn chúng không biểu thể dị hợp tử - Chọn dòng đột biến 2.1.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn Tế bào đơn nhận đường nghiền mô, xử lý enzyme Sau chúng nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy lắc tạo điều kiện thuận lợi cho trao đổi khí tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Tế bào đơn lọc nuôi cấy môi trường đặc biệt tăng sinh khối Mỗi loại cây, loại tế bào khác đòi hỏi kỹ thuật nuôi cấy khác Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn phức tạp, chúng bị nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng tách rời khỏi quần thể tế bào  Nuôi cấy tế bào đơn sử dụng cho mục đích: - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển phân hóa tế bào điều kiện khác - Thu nhận chất trao đổi thứ cấp 2.1.2.6 Nuôi cấy protoplast Tế bào trần tế bào tách bỏ thành tế bào phương pháp học hay sử dụng enzyme Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast tái sinh thành tế bào mới, phân chia tái sinh thành hoàn chỉnh Ưu kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào trần tế bào màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đơn vị thể tích môi trường cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trường)  Ứng dụng nuôi cấy protopast: - Tạo lai soma - Chuyển bào quan chuyển gen Quá trình dung hợp protoplast thực hai đối tượng loài hay khác loài - Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào 2.1.3 Môi trường nuôi cấy SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần sau: - Muối khoáng đa lượng - Muối khoáng vi lượng - Vitamin - Nguồn carbon - Chất điều hòa sinh trưởng - Ngoài bổ sung thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,…) agar  Môi trường nuôi cấy chia thành ba loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg - Môi trường giàu dinh dưỡng: MS Cơ sở cho việc xây dựng môi trường nuôi cấy xem xét thành phần cần cho sinh trưởng phát triển Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào mô thực vật thay đổi tùy theo loài phận nuôi cấy Đối với mẫu cấy tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần môi trường thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa mẫu cấy Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng phát triển nuôi cấy Độ pH môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới trình thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì cần điều chỉnh độ pH môi trường thích hợp trước nuôi cấy Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH 2.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 2.1.4.1 Auxin Auxin nhóm chất điều hòa sinh trưởng sử dụng rộng rãi nuôi cấy mô thực vật IAA auxin tự nhiên có mô thực vật, NAA, IBA, 2,4-D auxin nhân tạo, thường auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh Chúng có mặt phận mô phân sinh đỉnh, phận non khác  Sự áp dụng loại nồng độ auxin môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng phát triển cần nghiên cứu - Hàm lượng auxin nội sinh mẫu cấy - Khả tổng hợp auxin tự nhiên mẫu cấy - Sự tác động qua lại auxin ngoại sinh auxin nội sinh - Đặc tính auxin  Vai trò chất thuộc nhóm auxin: - Kích thích phân chia kéo dài tế bào - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ức chế sinh trưởng chồi bên - Kích thích phân hoá mô dẫn - Ảnh hưởng khác rụng lá, quả, đậu quả, phát triển chín quả, hoa mối quan hệ với điều kiện môi trường - Tạo nhân nhanh mô sẹo (callus) - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo phôi soma (2,4-D) 2.1.4.2 Cytokinin Các cytokinin dẫn xuất adenine Các cytokinin sử dụng thường xuyên BAP, Zeatin 2-iP cytokinin tự nhiên, BA kinetin cytokinin nhân tạo Chúng hòa tan NaOH HCl loãng Tỷ lệ auxin/cytokinin quan trọng phát sinh hình thái hệ thống nuôi cấy Đối với phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus rễ cần có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trường hợp ngược lại dẫn đến sinh sản chồi chồi nách Cytokinin có mặt mô phân sinh đỉnh rễ, non  Chức chủ yếu cytokinin: SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH - Kích thích phân chia tế bào - Tạo nhân callus - Kích thích phát sinh chồi nuôi cấy mô - Kích thích phát sinh chồi nách kìm hãm ảnh hưởng ưu chồi đỉnh - Làm tăng diện tích phiến kích thích lớn lên tế bào - Có thể làm tăng mở khí khổng số loài - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế hình thành rễ - Ức chế kéo dài chồi - Ức chế trình già (hoá vàng rụng) lá, kích thích tạo diệp lục 2.1.4.3 Gibberellin Trong số 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 chất sử dụng nhiều thực tiễn GA3 kích thích kéo dài chồi nảy mầm phôi vô tính GA3 có tính hoà tan nước Gibberellin tạo đỉnh rễ, chồi, non, hạt  Gibberellin có chức sau: - Kích thích kéo dài chồi tăng cường phân bào kéo dài tế bào - Phá ngủ hạt giống củ giống - Kiểm soát hoa năm tuổi - Ức chế hình thành rễ bất định - Kích thích sinh tổng hợp α-amylase hạt ngũ cốc nảy mầm - Các chất ức chế tổng hợp kích thích trình tạo củ (thân củ, thân hành củ) - Kích thích nảy mầm phấn hoa sinh trưởng ống phấn - Có thể gây tạo không hạt làm tăng kích thước nho không hạt - Có thể làm chậm hoá già có múi 2.1.4.4 Abscisic acid (ABA) Abscisic acid chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên tạo trực tiếp từ acid mevalonic phân giải carotenoid Chúng tạo lá, quả, mũ rễ, hạt  Các tác dụng ABA là: SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 10 of 126 10 Header Page 36 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Sâm Ngọc Linh xử lý HgCl2 với nồng độ 0.2 % thời gian 20 phút tỷ lệ nhiễm thấp (20%) tỷ lệ nhiễm không cao (80%) Còn xử lý Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian phút tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) tỷ lệ không nhiễm cao (90%) (Bảng 3.1) 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái: Sử dụng mẫu mầm, thân, rễ Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy phối hợp tổ hợp môi trường khác để đánh giá phát sinh hình thái Bảng 3.2: Ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái Sâm Ngọc Linh cấy mô: Bộ Đối phận tượng cấy Hoccmon Kết phát sinh hình thái IBA Sâm Ngọc Linh IAA NAA K 2ip G 0.2 0.2 Chết 0.5 0.5 Chết 0.5 Callus Mầm, 0.2 0.5 Callus thân, rễ 0.5 0.25 Rễ 0.5 1 Phôi soma 0.5 0.5 Phôi chồi 0.5 Rễ Chồi  Kết quả: - Với tổ hợp hoocmon IBA 0.5 + 2ip Sâm Ngọc Linh phát sinh phôi soma - Với tổ hợp hoocmon NAA + G phát sinh phôi chồi - Với tổ hợp hoocmon NAA + 2ip 0.5 phát sinh rễ SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 36 of 126 36 Header Page 37 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.3 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống lá: Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần không cần suốt thời gian tạo mô sẹo Đối với mẫu lá, đa số trường hợp tạo mô sẹo tối thường tốt sáng Tuy nhiên, số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt điều kiện sáng Môi trường tốt cho tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu cuống dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng Mẫu đặt hai điều kiện tối hoàn toàn chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Bảng 3.3: Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống lá: Phần trăm tạo mô sẹo (%) 2,4-D (mg/l) Bộ phận Chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Tối hoàn toàn 20 30 90 80 90 90 3.0 80 80 0.5 100 100 100 100 100 100 100 100 0.5 1.0 2.0 1.0 2.0 Lá Cuống 3.0  Kết quả: Kết bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo mẫu cuống gần tương đương hai điều kiện chiếu sáng tối, lượng mô sẹo điều kiện tối chất lượng mô sẹo có tượng thủy tinh thể, môi trường có 3.0 mg/l 2,4-D SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 37 of 126 37 Header Page 38 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.4 Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo: Mô sẹo cắt theo ba kích thước: KT1, KT2, KT3 Mẫu mô sẹo với kích thước xác định cấy vào môi trường nhân nhanh Mô sẹo sau trình tăng sinh sử dụng cho trình tái sinh chồi rễ bất định Bảng 3.4: Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo: Chỉ tiêu quan sát Trọng lượng tươi ban đầu (mg) Kích thước (cm) Sinh khối sau tuần nuôi cấy Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg) Tỷ lệ chất khô ( %) Tỷ lệ tăng sinh khối khô KT1 KT2 KT3 (0.5*0.5) (0.7*0.7) (1.0*1.0) 147 267 ± 18 576 ± 24 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 8.08 7.19 6.83 5.46 3.22 2.65  Kết quả: Kích thước mẫu cấy yếu tố quan trọng nhân giống invitro Khi khảo sát ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ (KT1) cho hiệu tốt tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, khác biệt nhiều khả tăng sinh KT2 KT3 (Bảng 3.4) Sự tương quan bắt nguồn từ tương quan kích thước mẫu cấy - khả thu nhận dinh dưỡng từ môi trường ảnh hưởng chất thải nội sinh mô sẹo trình nuôi cấy SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 38 of 126 38 Header Page 39 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.5 Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống lá: Những nghiên cứu có đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có kết hợp cytokinin auxin Mẫu cuống sau khử trùng cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IBA, NAA, với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0 3.0 mg/l Mẫu đặt ngửa mặt môi trường cuống đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên) Bảng 3.5: Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống lá: Auxin Nồng độ auxin ( mg/l) 2,4-D IBA NAA Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Cuống Lá 0.5 100 20 1.0 100 90 2.0 100 90 3.0 100 80 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0  Kết quả: Kết thu sau tuần nuôi cấy ghi nhận bảng 3.5 Trong ba loại auxin bổ sung vào môi trường có 2,4-D có khả kích thích cuống tạo mô sẹo Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D, mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao (Đạt 90 % 100 % cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc có màu vàng sáng Ở nồng độ 3.0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 39 of 126 39 Header Page 40 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH mg/l 2,4-D, mô sẹo bắt đầu có tượng thủy tinh thể Do đó, nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo 3.6.6 Ảnh hưởng auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Các mẩu mô sẹo tạo từ giai đoạn khởi tạo cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IBA NAA với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; 3.0 5.0 mg/l điều kiện chiếu sang 16 giờ/ ngày Bảng 3.6: Ảnh hường auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Trọng Auxin 2,4-D IBA NAA Nồng độ Sinh khối sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ tăng lượng tươi Trọng Tỷ lệ sinh lượng khô chất khô khối (mg/l) (%) khô ban đầu Trọng lượng (mg) tươi (mg) 0.5 203 ± 16 584 ± 34 43.3 ± 2.5 7.42 3.18 1.0 212 ± 14 809± 37 66.2 ± 3.0 8.18 4.56 2.0 204 ± 17 711 ± 32 52.4 ± 2.4 7.37 3.73 3.0 205 ± 508 ± 24 36.6 ± 2.2 7.21 2.65 5.0 201 ± 13 493 ± 38 34.6 ± 1.7 7.01 2.50 0.5 197 ± 18 474 ± 23 45.6 ± 2.2 9.62 3.45 1.0 203 ± 19 532 ± 29 48.6 ± 2.7 9.14 3.56 2.0 207 ± 13 631 ± 32 49.5 ± 2.5 7.84 3.63 3.0 203 ± 15 552± 26 41.1 ± 1.9 7.45 3.10 5.0 209 ± 12 531 ± 23 35.3 ± 1.5 6.66 2.53 0.5 218 ± 485 ± 13 41.2 ± 1.1 8.49 2.81 1.0 212 ± 14 548 ± 21 45.0 ± 1.8 8.22 3.33 2.0 206 ± 15 588 ± 18 46.6 ± 1.4 7.92 3.37 3.0 199 ± 602 ± 32 45.7 ± 2.4 7.60 3.38 5.0 205 ± 14 720 ± 48 51.6 ± 3.4 7.20 3.77 (mg/l) SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 40 of 126 40 Header Page 41 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Bảng 3.6 cho thấy sau trình tăng sinh, mô sẹo nuôi cấy môi trường có 0.5 mg/l IBA có tỷ lệ chất khô cao 9.62 % tỷ lệ tăng sinh khối khô cao 4.56 lần lại thu mô sẹo môi trường có 2,4-D nồng độ 1.0 mg/l Có thể kết hợp auxin cytokinin làm tăng khả thu nhận đường chất dinh dưỡng khác từ môi trường mô sẹo kéo theo tăng sinh mô sẹo, đặc biệt tăng tỷ lệ chất khô IBA auxin kích thích thu nhận dinh dưỡng từ môi trường kết hợp với TDZ tốt so với NAA 2,4-D Kết tỷ lệ chất khô mô sẹo nuôi cấy môi trường có IBA cao ba loại auxin sử dụng Tuy IBA cho tỷ lệ mô sẹo có tỷ lệ chất khô cao 2,4-D có tỷ lệ tăng sinh khối khô cao (Gấp 4.56 lần) có tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18 %) Mặt khác, mô sẹo môi trường 2,4-D có hình thái tốt nhất, dạng mô sẹo có khả tái sinh cao 3.6.7 Ảnh hưởng BA NAA đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo: Các mô sẹo thu thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung BA NAA với nồng độ bảng 3.6  Kết quả: Tỷ lệ auxin cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy hình thành chồi trình thường kích thích bổ sung auxin với nồng độ thấp Trong thử nghiệm, sử dụng BA kết hợp với NAA kết nhận thấy tổ hợp NAA BA khác nhau, kết hợp 1.0 mg/l BA 1.0 mg/l NAA cho số chồi đạt cao 6.3 chồi/ mẫu trọng lượng trung bình 0.185 g (Bảng 3.7) SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 41 of 126 41 Header Page 42 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Bảng 3.7: Khả tái sinh chồi từ mô sẹo môi trường MS có bổ sung BA NAA: BA (mg/l) 0.5 1.0 2.0 4.0 NAA (mg/l) Số lượng chồi/ mẫu Trọng lượng chồi (g) 0.5 5.0 0.106 1.0 6.1 0.141 1.5 4.6 0.193 2.0 3.3 0.197 2.5 3.0 0.094 0.5 5.5 0.163 1.0 6.3 0.185 1.5 5.9 0.158 2.0 3.9 0.148 2.5 3.7 0.157 0.5 4.2 0.152 1.0 5.5 0.141 1.5 2.9 0.144 2.0 2.8 0.112 2.5 2.7 0.108 0.5 3.3 0.154 1.0 3.0 0.122 1.5 2.6 0.122 2.0 0.8 0.108 2.5 0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 42 of 126 42 Header Page 43 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.8 Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: Những chồi tốt sau thu nhận tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung 1.0 g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, 0.5 mg/l NAA BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l) Bảng 3.8: Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: BA (mg/l) Trọng lượng tươi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.5 0.61 5.66 3.0 1.0 0.87 6.16 3.3 2.0 0.72 4.11 4.0 4.0 0.71 4.33 3.9  Kết quả: Trong nồng độ BA đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l BA kết hợp với 0.5 mg/l NAA cho kết tăng trưởng chồi chốt với trọng lượng tươi chồi 0.87 g chiều cao chồi 6.16 cm (Bảng 3.8) Vậy môi trường nuôi cấy có bổ sung 1.0 mg/l BA 0.5 mg/l tốt cho trình tăng trưởng chồi 3.6.9 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tăng trưởng chồi: Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 đường với nồng độ đường 10; 20; 30; 40; 50; 60 g/l  Kết quả: Qua kết thử nghiệm cho thấy sucrose carbohydrate hào tan chiếm ưu nồng độ thường dùng nằm khoảng 30 - 120 g/l sucrose Nghiên cứu ảnh hưởng sucrose lên tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực lên sinh trưởng chồi Sự gia tăng nồng độ sucrose môi trường kích thích sinh trưởng chồi Sâm Ngọc Linh mà có tác dụng mạnh đến biến đổi SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 43 of 126 43 Header Page 44 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH khối lượng chúng Nồng độ 50 g/l sucrose cho kết tốt trọng lượng, chiều cao số lượng (Bảng 3.9) Bảng 3.9: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tăng trưởng chồi: Sucrose (g/l) Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 10 0.49 4.4 2.2 20 0.55 5.4 2.5 30 0.68 5.7 2.6 40 1.06 5.8 3.2 50 1.46 6.1 3.5 60 1.28 6.1 3.2 3.6.10 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro: Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 với nồng độ than hoạt tính 1.0; 2.0; 3.0 4.0 g /l Bảng 3.10: Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro: Than hoạt Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.53 3.3 3.6 1.0 0.61 4.6 3.7 2.0 1.01 5.3 3.3 3.0 0.97 6.8 2.7 4.0 0.94 8.5 3.1 tính (g/l)  Kết quả: Than hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, có khả thay đổi thành phần môi trường Than hoạt tính điều chỉnh pH môi SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 44 of 126 44 Header Page 45 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH trường, hấp thụ chất làm cản trở phát triển mô Kết thu cho thấy nồng độ than hoạt tính tăng có thay đổi rõ rệt trọng lượng chiều cao chồi, số lượng thay đổi đáng kể Trọng lượng chồi đạt cao môi trường chứa 2.0 g/l than hoạt tính khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10) Vậy nồng độ 2.0 g/l than hoạt tính phù hợp cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm Ngọc Linh 3.6.11 Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo: Mô sẹo cấy vào môi trường rễ có chứa auxin (NAA, IBA, IAA) nồng độ 1.0; 3.0; 5.0; 7.0 mg/l Bảng 3.11: Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo: Auxin NAA IAA IBA Tỷ lệ khối Nồng độ Tỷ lệ rễ Số lượng ( mg/l) (%) rễ / mẫu 1.0 30 3.0 ± 0.3 5.98 18 3.0 100 8.7 ± 0.1 21.88 13 5.0 70 2.6 ± 0.1 6.23 7.0 50 2.1 ± 0.1 12.21 1.0 3.0 5.0 10 7.0 1.0 70 1.6 ± 0.1 7.83 16 3.0 80 4.0 ± 0.3 5.21 21 5.0 100 4.8 ± 0.3 15.81 18 7.0 60 3.5 ± 0.1 8.06 1.7 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 45 of 126 lượng rễ / mẫu (%) Chiều dài tối đa rễ (mm) 0.2 ± 0.2 45 Header Page 46 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Quá trình khảo sát ảnh hưởng ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA không thích hợp cho trình rễ Sâm Ngọc Linh từ mô sẹo auxin không kích thích mô sẹo rễ bất định NAA IBA ngược lại Nồng độ 3.0 mg/l NAA cho kết tố với tỷ lệ rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn (8.7 rễ/ mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn (21.88 %), chiều dài tối đa rễ 13 mm (Bảng 3.11) IBA nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu 4.8 mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % chiều dài tối đa rễ 18 mm Kết giải thích auxin tổng hợp có hoạt tính cao dạng tự nhiên Vậy hai môi trường kích thích rễ tốt môi trường Ms ½ bổ sung 3.0 mg/l NAA môi trường MS ½ bổ sung mg/l IBA 3.6.12 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ bất định: RỄ bất định sau tạo thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường nhân rễ có bổ sung auxin NAA, IBA nồng độ 1.0; 3.0; 5.0 mg/l  Kết quả: Từ kết bảng 3.12 bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu nhân rễ Mẫu rễ bảng 3.12 có khả nhân rễ tốt hơn, nghiệm thức rễ, tỷ lệ rễ cao 60 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu Mẫu rễ bảng 3.13 có tỷ lệ rễ cao 40 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu, có nghiệm thức rễ mẫu lại cấy môi trường chứa NAA Khi xét đến ảnh hưởng loại auxin, ta thấy NAA phù hợp với trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh Ở nồng độ 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều (9 rễ/ mẫu) mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình 390 ± 20 mg/l, tăng 3.5 lần so với ban đầu) Hơn nữa, có tới 5/6 nghiệm thức bổ sung NAA cho kết rễ so với IBA có 4/6 nghiệm thức Vậy IBA NAA, NAA nồng độ 3.0 mg/l phù hợp cho việc khơi tạo rễ từ mô sẹo NAA nồng độ 5.0 mg/l phù hợp cho trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 46 of 126 46 Header Page 47 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Bảng 3.12: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA: Trọng lượng tươi trung NAA IBA Tỷ lệ rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp - 20 140 ± 10 - 30 290 ± 10 - 60 390 ± 20 - 10 450 ± 50 - 20 330 ± 20 - 30 280 ± 30 bình (mg/l) Bảng 3.13: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA: Trọng lượng tươi trung NAA IBA Tỷ lệ rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp - 40 350 ± 10 - 20 180 ± 30 - 0 - 10 - 0 - 0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 47 of 126 47 bình (mg/l) 270 ± 10 Header Page 48 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Sâm Ngọc Linh công nhận Sâm có hàm lượng saponin cao với số lượng nhiều nhất, so với loài Panax khác giới Do việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn việc bảo tồn nguồn dược liệu quý giá - Quá trình khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ auxin lên khả tạo mô sẹo ban đầu cuống cho thấy nồng độ 3.0 mg/l 2.4-D trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo từ Sâm Ngọc Linh - Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao môi trường ½ MS bổ sung 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA, 50 g/l sucrose - Đối với trình rễ từ mô sẹo, mẫu mô sẹo nuôi cấy môi trường ½ MS có bổ sung 3.0 mg/l NAA cho tỷ lệt rễ cao nhất, số lượng rễ nhiều tỷ lệ trọng lượng tươi rễ/ mẫu cao - Môi trường ½ MS có bổ sung 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ rễ cao rễ phân nhánh nhiều 4.2 Kiến nghị: - Được giới ghi nhận loài Sâm quý bậc nhất, đến Sâm Ngọc Linh chưa biết đến nhiều loài Sâm Hàn Quốc hay Sâm Triều Tiên - Việc nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu loài Sâm giới nhiều tác giả tiến hành nhiều năm, Việt Nam khẳng định tính thực khả tạo nguồn Sâm đường nuôi cấy mô tế bào Nhưng cần nhiều nghiên cứu loài Sâm Ngọc Linh Việt Nam để Việt Nam chủ động nguồn nguyên dược liệu quý, đồng thời đưa thương hiệu Sâm Việt Nam mang tầm quốc tế - Là loài Sâm đặc hữu tìm thấy với số lượng phạm vi phân bố hẹp, nhạy cảm với môi trường sống, nguồn cung cấp hạn chế, thời gian từ SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 48 of 126 48 Header Page 49 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH lúc trồng từ hạt thu củ lên đến 5-6 năm Do đó, nguồn Sâm Ngọc Linh cạn kiệt dần nguy tuyệt chủng cao, nên cần có nhiều biện pháp cấp bách để bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quốc gia SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 49 of 126 49 Header Page 50 of 126 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THU Footer Page 50 of 126 GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 50 ... giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, thực khóa luận tốt nghiệp: Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis... thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật ( tế bào đơn, mô, quan…) điều kiện vô trùng  Nuôi cấy mô tế bào. .. thể tế bào  Nuôi cấy tế bào đơn sử dụng cho mục đích: - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển phân hóa tế bào điều kiện khác - Thu nhận chất trao đổi thứ cấp 2.1.2.6 Nuôi cấy