Nghiên cứu cải tiến công nghệ nuôi cây phôi dừa sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn phòng thí

Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng được qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến ở giai đoạn phòng thí nghiệm đạt tỷ lệ phôi nảy mầm và phát triển thành cây trong phòng thí nghiệm dự kiến tăng

VIỆN NC DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CÂY PHÔI

DỪA SÁP MAKAPUNO (COCOS NUCIFERA L.) GIAI ĐOẠN PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ VƯỜN ƯƠM

Cnđt : TRẦN THỊ NGỌC THẢO

8281

HÀ NỘI – 2010

TÓM TẮT

Bằng phương pháp nuôi cấy phôi hữu tính, cây dừa sáp nuôi cấy phôi có thể cho tỷ lệ trái sáp đặc ruột ≥70% Qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp gồm nhiều giai đoạn, tuy nhiên, với qui trình nuôi cấy phôi dừa trước đây chỉ đạt tỉ lệ thành công 19-20%, thời gian nuôi trồng khoảng 20 tháng Nguyên nhân là do tỷ lệ phôi phát triển thành cây trong ống nghiệm và sự thích nghi của cây con ở vườn ươm còn thấp Đề tài tập trung nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật trong phòng thí nghiệm và vườn ươm như thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng, hàm lượng đường, chế độ bón phân để làm tăng tỷ lệ nảy mầm, giúp phôi tăng trưởng tốt trong ống nghiệm thông qua việc cải thiện chồi,

rễ và làm tăng tỷ lệ sống của cây con ở vườn ươm

Đề tài đã xây dựng được qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến ở giai đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm, đạt tỷ lệ 37%, thời gian nuôi trồng 15-16 tháng và đã tạo ra được 200 cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm

MỞ ĐẦU

Cơ sở pháp lý của đề tài

- Căn cứ vào Quyết định số 6363/QĐ-BCT của Bộ Trưởng Bộ Công Thương

ký ngày 02/12/2008 về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ năm 2009 cho Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu

- Căn cứ vào Hợp đồng Nghiên Cứu Khoa học và Phát Triển Công nghệ số: 193.RD/HĐ-KHCN ký ngày 16/03/2009 giữa Vụ Khoa Học và Công Nghệ,

Bộ Công Thương và Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu về việc thực hiện

nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm

- Căn cứ vào Hợp đồng giao khoán nội bộ số 08/HĐGK-VD ký ngày 07/04/2009 giữa Viện Trưởng Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu với Chủ nhiệm đề tài về việc giao khoán thực hiện nhiệm vụ Nghiên cứu Khoa học và

Phát triển công nghệ Cấp Bộ năm 2009 có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm

Mục tiêu chung của đề tài:

Nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa Sáp bằng phương pháp nuôi cấy phôi ở giai đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươm Dự kiến đạt 30- 35%

Mục tiêu cụ thể:

- Xây dựng được qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến ở giai đoạn phòng thí nghiệm đạt tỷ lệ phôi nảy mầm và phát triển thành cây trong phòng thí nghiệm dự kiến tăng 20-30% so với qui trình hiện có

- Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống của cây dừa sáp nuôi cấy phôi ở giai đoạn vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, xác định nhiệt

độ, độ ẩm ở vườn ươm và lựa chọn tổ hợp phân bón phù hợp cho sự tăng trưởng của cây dừa sáp nuôi cấy phôi

- Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm, đạt tỷ lệ 30-35%

- Đạt 200 cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm

Đối tượng nghiên cứu: phôi dừa Sáp đặc ruột được thu thập từ huyện Cầu kè,

Tỉnh Trà Vinh

Phạm vi: Đề tài được giới hạn ở việc nghiên cứu qui trình công nghệ nuôi cấy

phôi dừa Sáp từ giai đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươm

Nội dung nghiên cứu: nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi

dừa Sáp giai đoạn trong phòng thí nghiệm và vườn ươm

- Nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp (giai đọan phòng thí nghiệm): môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nitơ, chất điều hòa sinh trưởng ) và điều kiện ngoại cảnh (cường độ ánh sáng, phổ màu, cung cấp ôxy, nhiệt độ) để tăng tỷ lệ nảy mầm và sống

- Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của cây non trong giai đoạn chuyển tiếp phòng thí nghiệm ra vườn ươm nhằm nâng cao tỷ lệ sống

- Nghiên cứu nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi giai đoạn đầu thích nghi ở vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

- Nghiên cứu điều kiện nuôi trồng cây dừa sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm (giai đoạn thích nghi): nhiệt độ, độ ẩm

- Nghiên cứu một số tổ hợp phân bón cho cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm (bao gồm: phân bón NPK, các chế phẩm sinh học, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật…)

- Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp cải tiến giai đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm

1.1 Tình hình nuôi cấy phôi dừa ở nước ngoài

Việc nuôi cấy in vitro phôi dừa hợp tử (zygotic) đã được nhiều tác giả

nghiên cứu thành công từ những năm trước đây như De Guzman và Del Rosario (1974), Assy Bar (1986), Rillo và Paloma (1992), Samosir và cộng sự (1999) Các nghiên cứu này nhằm mục đích cứu lấy những phôi hữu tính phát triển bình thường từ những quả dừa đột biến nhưng có giá trị cao như dừa Sáp (makapuno) trong khi nội nhũ (cơm dừa) lại mềm, xốp và không có chức năng (Rillo và Paloma, 1992) để từ đó tạo ra những cây giống cho tỷ lệ trái sáp cao Ngoài ra

phương pháp này còn được áp dụng trong việc chọn lựa in vitro các tính trạng

cây trồng khác nhau và bảo quan gen dừa ở nhiệt độ thấp

Từ nhiều năm nay, Mạng luới gen dừa quốc tế - Viện Quỹ gen thực vật Quốc tế (COGENT-IPGRI) đã tài trợ vốn và thiết lập ngân hàng bảo tồn nguồn gen dừa quốc ở nhiều nơi (ICG) Mạng lưới các điểm bảo tồn này, trong đó có nhiều nơi đã đi vào hoạt động nằm trong 5 khu vực của COGENT là Đông Nam

Á, Nam Á, Nam Thái Bình Dương, Châu Phi, Ấn Độ Dương, Châu Mỹ La Tinh

và vùng Caribe Mạng lưới ngân hàng gen dừa này sẽ là nơi lưu giữ phần lớn nguồn gen dừa của thế giới và bảo vệ chúng cho việc sử dụng trong tương lai của ngành công nghiệp dừa Để hỗ trợ cho việc thành lập các ngân hàng bảo tồn gen dừa, việc thu thập nguồn gen bằng phôi mầm riêng biệt hoặc những miếng nội nhũ nhỏ có chứa phôi và di chuyển chúng như trong trường hợp nuôi

cấy phôi trong ống nghiệm (in vitro) đã trở thành một biện pháp mang tính thực

tế hơn nhiều trong công đoạn vận chuyển gen dừa vừa gọn nhẹ, dễ dàng, vừa an toàn về mặt kiểm dịch thực vật

Cho đến nay, kỹ thuật nuôi cấy phôi dừa tiêu chuẩn quốc tế đã được sử dụng để lập ra bộ sưu tập nguồn gen dừa và sản xuất các cây giống chất lượng cao từ những giống dừa đột biến như dừa Sáp (makapuno) Phương pháp này được gọi là “Kỹ thuật nuôi cấy phôi mầm lai” (Batugal, 2002), được sử dụng để sản xuất cây giống dừa ở những nơi phôi mầm được gửi đến sau các vụ trao đổi quốc tế

Nhiều khía cạnh về mặt sinh lý của cây con phát triển trong quá trình nuôi

cấy in vitro là chưa tối ưu và chính điều này được cho là nguyên nhân làm giảm

tỷ lệ thích nghi với điều kiện khí hậu bên ngoài và sự phát triển của cây con sau khi đưa ra khỏi môi trường nuôi cấy Các đặc điểm sinh lý của cây con có khả năng chịu ảnh hưởng bởi kỹ thuât, là sự phát triển của bộ rễ, khả năng quang hợp và tính mẫn cảm với bệnh

Những nghiên cứu gần đây của Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Quốc

tế Úc (2008) với sự tham gia của một nhóm các nhà khoa học đến từ nhiều quốc gia khác nhau (Úc, Indonesia, Papue Newguinea, Philippines và Việt Nam trong một thời gian hơn 3 năm Một số cải tiến đáng kể của quy trình được sử dụng cho việc vận chuyển gen dừa, tái thiết lập và sản xuất cây giống đột biến chất lượng cao như dừa Sáp Makapuno

Ở Việt Nam, về nuôi cấy phôi dừa đã có các công trình từ 1993 ( Nguyễn Hữu Hổ và cộng sự, 1993; Nguyễn Thị Hiền, 1996) nhưng chỉ thực hiện với các giống dừa địa phương có tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên rất cao, chưa có nghiên cứu nào thực hiện cho các giống dừa quý hiếm

Viện nghiên cứu Dầu và cây có dầu đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa từ năm 1996 và đã nhận được trợ giúp tài chính từ Chính phủ Việt Nam, IPGRI-COGENT, và gần đây thông qua Đại học Queensland (Australia) bởi một dự án ACIAR

Nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo và cộng sự (Viện nghiên cứu Dầu và cây có dầu) đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa trong điều kiện

in vitro từ năm 1999 trên 2 giống dừa là Ta xanh và Lùn vàng Mã Lai

Từ năm 2000 đến 2001, được sự tài trợ của IPGRI-COGENT, Nhóm tác giả trên đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa Sáp (Makapuno), dừa Ẻo trong điều

kiện in vitro

Đến năm 2003-2004, nhóm tác giả trên tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện, nâng cao qui trình nuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm thông qua việc tìm môi trường thích hợp cho nuôi cấy phôi dừa Sáp và dừa Dứa, nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trữ lạnh đến khả năng nảy mầm của phôi dừa Sáp Bên cạnh đó, nhóm tác giả còn nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng, chế độ tưới, chế độ ánh sáng, độ ẩm đến tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi ở vườn ươm Từ đó cho thấy, việc tìm ra điều kiện nuôi trồng của vườn ươm giúp cây dừa cấy phôi

thích nghi với điều kiện ex-vitro là một vấn đề khó khăn nhưng lại rất thiết thực

Song song đó, với sự tài trợ của Trường Đại học Queensland (Australia) thông qua dự án ACIAR thực hiện từ năm 2003-2005, nhóm tác giả này đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA và NAA đến sự tạo rễ của phôi dừa Dứa và Xiêm, nghiên cứu ảnh hưởng của việc cắt dây treo (haustorium) của phôi trong quá trình nuôi cấy để hạn chế tỷ lệ chết của cây dừa nuôi cấy phôi khi chuyển ra vườn ươm

Và thông qua dự án Phát triển sản xuất giống Dừa (giai đoạn 2001-2005) của Bộ Công Nghiệp, nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo và cộng sự đã nghiên cứu nuôi trồng 2 giống dừa quý là Sáp và Dứa, hiện nay đã trồng ra đồng được khoảng 5ha

Tuy nhiên, cho đến nay tỷ lệ thành công vẫn chưa cao Từ phôi mới đưa vào nuôi cấy cho đến khi cây trưởng thành để trồng ra đồng là 19-20%

1.3 Qui trình nuôi cấy phôi dừa hiện có của Viện

Từ năm 2001-2005 viện Nghiên Cứu Dầu và Cây Có Dầu đã bước đầu thực hiện thành công việc nhân giống dừa sáp bằng cách nuôi cấy phôi dừa

trong điều kiện in vitro Dưới đây là quy trình được mô tả lại :

Giai đoạn 1: Chọn trái giống

khoảng 9 tháng tuổi Ở giai đoạn này tỷ lệ trái được sử dụng để lấy phôi bị hao hụt chỉ còn khoảng 80%

Giai đoạn 2 : Tách phôi và khử trùng Cấy phôi và nuôi phôi Phôi dừa sau khi được lấy ra cùng với lớp cơm dừa được khử trùng với javen 100% trong 10-15 phút Rửa phôi bằng nước vô trùng khoảng 4-5 lần Tách phôi

Cấy phôi đã được vô trùng vào các ống nghiệm có chứa 50 ml môi trường chuẩn Y3 (chi tiết xem phụ lục)

Các ống nghiệm chứa phôi được mang đi nuôi cấy ở phòng sáng ở nhiệt

độ 280C ± 20C, ánh sáng là 4.000 lux, thời gian chiếu sáng 9h/ngày

Cấy chuyền phôi hàng tháng (10 lần/10tháng)

Phôi dừa bắt đầu nảy mầm sau khoảng 3-4 tuần, khoảng 10-11 tháng hình thành đầy đủ các bộ phận thân, lá, rễ Trong khoảng thời gian này cần định kỳ cấy chuyền mỗi tháng một lần nhằm thay thế môi trường cũ đã cạn kiệt dinh dưỡng bằng môi trường mới giàu dinh dưỡng hơn, tạo điều kiện cho cây phát triển khỏe mạnh và cân đối

Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm là cây phải đạt kích thước về chiều cao cây ≥ 15cm, đã có 3 lá mở hoàn toàn và đã có

rễ thứ cấp

Kết thúc giai đoạn nuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm, tỷ lệ phôi sống sót và phát triển thành cây là khoảng 40%

Giai đoạn 3: Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm

Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm nên cần có một giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm Các cây dừa con được cấy vào môi trường Y3 có nồng độ đường 4,5% và được đặt vào điều kiện phòng thí nghiệm có nhiệt độ 30oC, độ ẩm 60% và cường độ chiếu sáng 5.000 lux Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm được thực hiện khoảng 1-2 tháng

Giai đoạn 4 : làm cây thích nghi ở vườn ươm Cây dừa trong phòng thí nghiệm được đem ra trồng trong các túi PE 15

có pha cát, xơ dừa, phân chuồng theo tỷ lệ (1:1:1) Nuôi trồng cây dừa trong bịch PE khoảng 4 tháng Cây sống sót từ giai đoạn này đạt 60-70%

Giai đoạn 5: Trồng ở vườn ươm Sau khi trồng thích nghi ở vườn ươm, các cây con được chuyển sang giá thể trồng khác là đất và được trồng trong túi PE 25

Cây sống sót ở giai đoạn này đạt 80-90%

Cây con đạt tiêu chuẩn đưa ra vườn trồng là cây có chiều cao ≥ 40cm, cây

có ít nhất 5 lá xanh, chu vi gốc ≥ 10cm

Sau khi được trồng ở giai đoạn thích nghi cây dừa đã cứng cáp có khả năng chống chịu cao, được đem trồng ra đồng, tăng lượng phân bón lên 1/3 so với khuyến cáo trồng dừa

Tỷ lệ sống giai đoạn này là khoảng 95% -100%

Như vậy, sau quá trình nuôi cấy phôi khoảng 12-13 tháng, tỷ lệ phôi phát triển thành cây xanh tốt ở vườn ươm đạt tiêu chuẩn trồng ra đồng là 19-20%

Nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ thành công thấp là do:

• Tỷ lệ phôi bị chìm hoàn toàn trong môi trường khi mới đưa vào nuôi cấy chiếm 10-15%, các phôi này hầu hết không phát triển được và chết

• Tỷ lệ phôi phát triển bất thường cao chiếm khoảng 10-30% (các phôi phát triển bất thường là các phôi phát triển không có lá hay rễ, hay cây không

và rễ để năng cao tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh có đầy đủ lá

rễ trong ống nghiệm Ngoài ra, đề tài cải thiện tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi ở giai đoạn vườn ươm

Quy trình nuôi cấy phôi dừa sáp năm 2001-2005:

1 Chọn trái giống, cấy phôi

2 Cấy truyền mỗi tháng

5 Trồng giai đoạn 2 ngoài vườn ươm

3 Cây dừa phát triển đầy đủ

lá, rễ trong ống nghiệm

4 Làm cây thích nghi và trồng giai đoạn 1

50ml Y3 với đường 4,5%, 2 tháng

Túi PE 15, cát-bụi dừa-phân chuồng (1:1:1), 3-4 tháng

50 ml Y3 + đường 6% + IBA 2mg/l, ĐK : 26 ± 2 0 C, 4000lux, 9h/ngày.10-11 tháng

6 Trồng ra đồng, phân bón tăng 1/3 so với giai đoạn 1

50ml môi trường Y3 + IBA 2mg/l

10 lần

Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong phòng thí nghiệm có đủ điều kiện

để đưa ra vườn ươm là:

• Cây phát triển xanh tốt

• Cây lá và rễ phát triển cân đối

• Cây đã có 3 lá mở và có rễ phụ Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong vườn ươm đủ tiêu chuẩn để đưa ra vườn trồng khi:

• Cây phát triển xanh tốt, không sâu bệnh

• Cây đạt chiều cao ≥ 40cm

Bộ : Arecales

Họ : Arecaceae

Loài : Cocos nucifera

1.4.2 Đặc điểm hình thái của trái dừa sáp

Dừa sáp (Makapuno) là một giống dừa đột biến từ giống dừa cao Laguna, có nguồn gốc từ Philippines Dừa sáp còn gọi là dừa đặc ruột, dừa kem, thuộc giống dừa cao Dừa sáp về bản chất có đặc điểm sinh học giống như những loại dừa thường khác, chỉ có cơm dừa (nội nhũ) là đặc biệt khác

Dựa vào độ đặc ruột của cơm dừa, dừa Sáp được chia thành 3 nhóm với kiểu đặc ruột là kiểu A, B và C với độ đặc ruột tương ứng tăng dần, với kiểu A là đặc ít, chỉ khoảng 1/3 bán kính trái dừa, và kiểu C là gần như không có nước dừa sáp có lớp cơm màu trắng rất dày (có khi choán hết cả phần ruột) giống như sáp đèn cầy, chính giữa là chất lỏng sệt như nước cơm chắt Không như cơm dừa bình thường, nếu còn non thì mềm và ngọt, nếu già thì cứng cạy Cơm dừa sáp mềm và dẻo như bột quánh lại, béo và có mùi thơm đặc trưng Nước dừa sáp cũng vậy

Thông thường một quày dừa sáp có 12 trái, chỉ có khoảng 3-4 trái có sáp, thậm chí không có trái nào, tùy theo nhiều yếu tố

1.4.3 Giá trị kinh tế của cây dừa sáp

Dừa Sáp Makapuno có giá trị kinh tế cao, phục vụ cho các ngành du lịch, chế biến thực phẩm…, giá thành của một trái dừa sáp cao gấp 20-30 lần một trái dừa thường Hiện nay, dừa sáp được mệnh danh là loại dừa mắc nhất Việt Nam với giá dao động từ 100.000đ đến 120.000đ/trái Đây là loại trái giải khát độc đáo của Huyện Cầu Kè tỉnh Trà Vinh, không đâu có thể sánh được, kể cả

xứ sở nổi tiếng về dừa là Bến Tre Tất cả các phần của cây dừa sáp từ thân, lá, trái, vỏ, xơ, gáo, nước… đều có thể sử dụng phục vụ đời sống con người Do vậy, với giá thành hiện tại của trái dừa sáp cùng với hương vị thơm ngon của trái dừa sáp đã phần nào giúp đỡ cho tiềm năng du lịch tại địa phương phát triển Bên cạnh đó cũng giải quyết được công ăn việc làm, ổn định về đời sống kinh tế cho người nông dân

Hiện nay, Philippines là quốc gia hàng đầu về sản xuất cây dừa Sáp nuôi cấy phôi, với 10 phòng thí nghiệm chuyên sản xuất giống dừa này nhưng vẫn chưa đủ giống cung cấp cho nhu cầu sản xuất và giá cây dừa giống vẫn còn khá cao, chỉ một số công ty tư nhân mới đủ khả năng đầu tư trồng dừa Sáp và phải đặt mua cây giống trước 1-2 năm

Bảng 1.1: Giá cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở các nước khác Năm Quốc gia Giá trái Sáp Giá cây dừa NCP

Philippines (~0,65USD/trái) 30 Peso/trái 500 Peso/cây (~11 USD/cây)

2007

2010 Philippines 60 Peso/trái (~1,35 USD/trái) 900 Peso/cây (~21 USD/cây)

Mặc dù giá cây dừa giống cấy phôi khá cao, người dân khó có khả năng tiếp cận, nhưng tiềm năng lợi nhuận rất lớn, vì cây dừa Sáp nuôi cấy phôi sau 3,5 năm trồng sẽ cho năng suất trái sáp là trên 70% nên chỉ cần sau 1 -2 đợt thu hoạch là có thể thu hồi vốn đầu tư và có thể thu hoạch được 40-50 năm

1.4.4 Phương pháp nhân giống dừa Sáp

Trồng dừa sáp theo phương pháp truyền thống: dùng trái không đặc của cây dừa sáp để ươm làm giống sẽ cho tỷ lệ nảy mầm khoảng 60-70% Tuy nhiên

những cây giống này sẽ cho tỷ lệ trái đặc ruột thấp giống như cây bố mẹ (khoảng 25%)

Phương pháp nuôi cấy phôi in vitro: Những trái sáp đặc ruột không thể tự

nảy mầm do nội nhũ phát triển bất thường (cơm dừa mềm và xốp) và phôi của

trái sáp đặc ruột này chỉ nẩy mầm bằng phương pháp nuôi cấy phôi in vitro, lấy

phôi từ trái đặc ruột đem cấy vào môi trường dinh dưỡng thay thế cho nội nhũ của dừa sáp, phôi dừa sáp nảy mầm và phát triển thành cây dừa giống có tỷ lệ trái đặc ruột cao (≥70%, theo Rillo)

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy phôi dừa in vitro

1.5.1 Mẫu phôi

Chọn mẫu phôi dừa để cấy là yếu tố hết sức quan trọng ảnh hưởng rất lớn trong quá trình nuôi cấy cho đến lúc ra vườn ươm, phát triển thành cây, hoa và trái Do vậy, công tác chọn phôi phải thật nghiêm ngặt Phải chọn phôi dừa sáp

từ những quả dừa sáp không quá non, không quá già, không bị thối nhũn Trái giống đều đặn, không dị dạng và sâu bệnh Trái đủ độ chín, khoảng 10-11 tháng tuổi

1.5.2 Sự hóa nâu:

Dừa là loài thực vật giàu các hợp chất polyphenol (tanin hay các hydroxyphenol) Sau khi phôi bị tổn thương trong quá trình cắt và khử trùng, các hợp chất này bị oxid hóa bởi các oxydase chứa gốc đồng (Cu) như polyphenoloxydase Các hoạt động oxid hóa được tạo thành sẽ cản hoạt động của các enzyme trong mô làm mô và môi trường nuôi cấy bị hóa nâu hay đen trong vòng vài ngày sau đó, mô không thể tăng trưởng và sẽ chết Các polyphenol oxydase có thể tổng hợp mới hay hiện diện sẵn và phóng thích do

sự tác động của vết thương

Có thể hạn chế sự hóa nâu bằng cách:

- Loại bỏ các hợp chế phenol (phenolic) sinh ra

- Thay đổi thế oxid khử

- Bất hoạt hóa các enzyme phenolase

- Giảm hoạt tính phenolase

- Loại đài chất của phenolase

Trong thực tế, phương pháp dễ nhất để cản sự hóa nâu của mô thực vật là loại các hợp chất phenol sinh ra, có thể thực hiện bằng nhiều cách:

Mô cấy được chuyển thường xuyên trong 2-4 tuần lễ đầu Sự cấy chuyền sẽ

dễ thực hiện hơn nếu mô cấy được đặt vào môi trường lỏng (nuôi cấy lắc)

Các phenolic có thể liên kết với các hợp chất được cho vào trong môi trường nuôi cấy như than hoạt tính (0.5-5mg/l) Khi bị liên kết các phenolic sẽ không cản sự tăng trưởng của mô thực vật

1.5.3 Vai trò của các chất dinh dưỡng

Các nguyên tố đa lượng cũng như vi lượng đều có vai trò đối với thực vật (hoạt hóa enzym) Thực vật chỉ cần một lượng nhỏ chất khoáng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển của chúng Tuy nhiên, sự thừa hay thiếu các nguyên tố này cũng đều gây ra những rối loạn biến dưỡng, dẫn tới những triệu chứng bất thường đặc trưng và có thể dễ dàng nhận ra khi theo dõi sự phát triển của chúng

Các khoáng đa lượng:

Nitơ ( N):

Nitơ là nguyên tố cần thiết tạo acid min, các loại protein, acid nucleic, diệp lục tố, vitamin và enzym Là thành phần bắt buộc của protein-chất đặc trưng cho sự sống Các hợp chất nitơ cung cấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu tạo ADP và ATP Nitơ còn là thành phần của nhiều vitamin như : B1, B2, B6, PP,… đóng vai trò là nhóm hoạt động của nhiều hệ enzym oxy hóa khử, trong

đó có sự tạo thành của Adenin

Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitơ ở hai dạng amonium

và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như acid amin Tỷ

lệ nitơ dạng amonium và nitrat thích hợp tùy theo loại cây, bộ phận và trạng thái phát triển của mô Nồng độ NH4+, NO3- thay đổi từ 3-6 mM

cây tổng hợp Auxin tăng lên

Nếu mô cấy hấp thu nitơ vượt quá nhu cầu thì sẽ mềm mỏng Tuy nhiên nếu không cung cấp đủ lượng cấn thiết thì mô cấy sẽ bị cứng do thừa cenllulose và ligin ở thành tế bào

Khi thiếu nitơ thì thân mô cấy kém phát triển, mô có màu xanh nhạt, lá có màu vàng, phiến lá mỏng, ảnh hưởng đến quang hợp

Phospho (P):

Phospho có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng, cần thiết cho sự phân chia tế bào, sự phát triển của rễ Phospho có liên quan đến sự tổng hợp đường, tinh bột vì phospho là thành phần của các hợp chất cao năng tham gia vào các quá trình phân giải hay tổng hợp các chất hữu cơ trong tế bào

Khi thiếu phospho lá cây có màu xanh đậm do sự thay đổi tỷ lệ diệp lục tố a

và b Ở môi trường có pH thấp, nhiều sắt thì dễ bị thiếu phospho vì làm phospho ít linh hoạt Sự thiếu phospho thường đi theo sự thiếu nitơ và có triệu chứng gần tương tự nhau vì phospho liên quan đến sự biến dưỡng nitơ

Nồng độ phospho trong môi trường biến thiên từ 0.15- 4mM, thường dùng 1

mM

Kali (K):

Kali làm tăng quá trình quang hợp và thúc đẩy sự vận chuyển glucid từ phiến

lá vào các cơ quan Kali còn tác động rõ rệt đến trao đổi protid, lipid, đến quá trình hình thành các vitamin

Kali rất dễ xâm nhập vào tế bào, làm tăng tính thẩm thấu của thành tế bào đối với các chất khác, tăng quá trình thủy hóa, giảm độ nhớt, tăng hàm lượng nước liên kết Kali ảnh hưởng đến các quá trình sinh tổng hợp các sắc tố trong

lá, ảnh hưởng tích cực quá trình đẻ nhánh, hình thành bông và chất lượng hạt của các hạt ngũ cốc

Nồng độ Kali trong môi trường biến thiên từ 2-25 mM, trung bình khoảng 10

mM

Canxi (Ca):

Canxi là thành phần muối pectate của tế bào (pectate calcium) có ảnh hưởng trên tính thấm của màng Canxi cần cho sự thâm nhập của NH4+ và NO3- vào rễ Canxi là ion kém linh động nên màng tế bào thực vật hấp thu dễ dàng

CaCl2.2H2O Nồng độ Ca2+ trong môi trường nuôi cấy từ 1-3.5 mM, trung bình

là 2mM

Magie (Mg):

Magie là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng sâu sắc và nhiều mặt đến quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzym, đặc biệt là ATPase liên quan trong biến dưỡng carbohydrat, sự tổng hợp acid nucleic, sự bắt cặp của ATP với các chất phản ứng

Khi thiếu magie lá bị vàng, quang hợp kém dẫn đến năng suất giảm Sử dụng

Lưu huỳnh (S):

Giữ vai trò đệm trong tế bào (trao đổi anion với các tế bào)

Lưu huỳnh là thành phần cấu trúc của cystein, methionin, tạo cầu nối disulfur tạo cấu trúc bậc ba của protein

Lưu huỳnh còn là thành phần của một vài enzym Thiếu lưu huỳnh thì sự sinh tổng hợp protein giảm, cây bị hoàng hóa do không tổng hợp được diệp lục

tố, lá có màu lục nhạt, thỉnh thoảng có một phần lá bị đỏ, thường xuất hiện ở lá non cây chậm lớn, năng suất phẩm chất giảm Lưu huỳnh thường được sử dụng

mô do làm tăng quá trình tổng hợp các cao phân tử ưa nước như protein, nucleic acid

Khi thiếu kẽm thì cường độ tổng hợp tryptophan từ indol và serine bị kiềm hãm nên rễ không tạo được hoặc kém phát triển, lá bị bạc màu, sắc tố bị hủy hoại, lá kém phát triển, hình dạng lá không bình thường, lóng ngắn,…Thường

Sắt (Fe):

Những môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3….Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt dưới dạng chelat kết hợp với Disodium Ethylen diamin tetra-acetat

ngoài môi trường theo nhu cầu của mô thực vật

Đồng (Cu):

Là thành phần cấu trúc của nhiều enzym xúc tác các phản ứng oxi hóa khử, can thiệp vào các phản ứng oxi hóa cần oxi phân tử

Thiếu đồng lá kém phát triển, có màu xanh đậm Nếu thiếu nhiều dẫn đến

Mangan (Mn):

Ảnh hưởng của Mn đối với cây trồng khá giống sắt, ngoại trừ bệnh vàng lá không xuất hiện ở lá non như trong trường hợp của sắt Có một vài dấu hiệu cho

thấy có sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa các lượng khác nhau sắt và mangan và cần phải phòng ngừa trước để để chắc chắn rằng sự cân đối giữa mangan và sắt là không đổi trong giới hạn phát triển tốt nhất của cây trồng

Bor (B) Bor liên quan trong sự tổng hợp các acid nucleic, các phản ứng hormon và các chức năng của màng, trong sự cận chuyển carbohydrat, và trong sự dùng calcium cho sự thành lập vách

Thiếu Bor, sự phân chia tế bào bị cản, sự hoại mô đen xảy ra ở lá non (chủ yếu ở gốc lá) và rễ phù to, cây có thể mất ưu tính ngọn

Molypden (Mo)

Mo là thành phần của nitrat reductase

Thiếu Mo, có sự hoàng hóa và hoại mô ở các lá già

Nguồn Carbon:

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên

các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường trong môi trường Đường được sử dụng như nguồn carbon cung cấp năng lượng chủ yếu trong nuôi cấy phôi

Hai dạng đường thường được sử dụng nhất là saccharose và glucose nhưng

− Sử dụng đường saccharose kinh tế hơn đặc biệt là khi ứng dụng vào sản xuất vì giá thành đường saccharose thấp hơn

− Đường saccharose là một disaccharit được cấu tạo từ 2 đường đơn là D-glucose và β-D-fructose Trong quá trình hấp vô trùng môi trường

đơn như trên và mô thực vật có thể hấp thu được cả hai loại đường đơn này, đối với một số mô đặc biệt thì sự hấp thu đường fructose hiệu quả hơn glucose, ngay cả đường saccharose mô thực vật vẫn có thể hấp thu được nhờ các enzyme và các chất chuyên chở đặc biệt qua màng

Trong thí nghiệm nuôi cấy phôi dừa, không sử dụng đường vàng vì trong đường vàng có nhiều tạp chất, có thể là những yếu tố không kiểm soát được trong quá trình làm thí nghiệm

Ngoài ra, đường còn tác động như chất tạo ra áp suất thẩm thấu Tùy từng giai đoạn phát triển phôi khác nhau, nhu cầu về đường và áp suất thẩm thấu khác nhau (từ 0.1 đến 12%)

Các Vitamin:

Các vitamin thường được pha hỗn hợp trong dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 hoặc 1000 lần dung dịch làm việc Các dung dịch vitamin rất dễ hỏng

do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0oC

Vai trò từng loại vitamin:

- Thyamin hydrocloric (B1): dạng tinh bột kết tinh trắng, hút ẩm, rất không bền vững Chứa lưu huỳnh, được tổng hợp trong lá hay chồi non Các mô nuôi cấy không tổng hợp được vitamin B1 do vậy cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy Vitamin B1 thiết yếu trong sự biến dưỡng tế bào

- Vitamin PP được tìm thấy trong NAD hay NADP, các coenzym thiết yếu trong sự vận chuyển điện tử

- Prydoxine HCl (B6) :dưới dạng phosphoryl hóa, là nhóm hoạt động của transaminase

- Myo-inositol : là một đồng phân của inositol, chất liên quan trong sự truyền dấu hiệu hormon và liên kết với auxin Nó thường được dùng với nồng độ khá cao nên thường đặt ngoài nhóm vitamin

- Ca-D pantothenate: chất bột trắng, tan trong nước, là dạng phổ biến nhất của vitamin B3

- Biotin cần trong vài sự carboxyl hóa

Chất điều hoà tăng trưởng thực vật

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (hormone thực vật) là những hợp chất hữu cơ do tế bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển tới một nơi khác Ở đó, với nồng độ rất thấp gây ra một phản ứng sinh lý

- Ở nồng độ thấp làm biến đổi các hoạt động sinh lý (kích thích, điều hoà hay cản) các quá trình sinh lý của thực vật

- Ở nồng độ cao chúng trở thành chất độc cho thực vật (đặc biệt là với con người)

- Chất điều hoà sinh trưởng nội sinh ít bền và dễ kiểm soát hơn so với các chất điều hoà ngoại sinh Do vậy trong thực tế các chất điều hoà tổng hợp được sử dụng rất phổ biến

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật được phân làm 5 nhóm chính là: Auxin, Cytokinin, Gibberilin, Acid Abscisic và Ethylen Mỗi chất có những tác dụng sinh lý khác nhau trên quá trình sinh trưởng của thực vật tự nhiên và thực vật

trong nhân giống in-vitro

Auxin:

Auxin là hormon đầu tiên trong cây được phát hiện vào năm 1934, là một hợp chất tương đối đơn giản: indol 3 acetic acid (IAA) Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non (tức nơi có sự phân chia tế bào nhanh) từ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng Sau đó auxin được di chuyển đến rễ và tích tụ trong rễ

Auxin chủ yếu của thực vật là indole-3-acetic acid (IAA), ngoài ra còn có các dẫn xuất của nhân indole như indole-3-butyric (IBA), α-naphtalen acetic acid (NAA), 2,4 dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D)

Tác dụng sinh lý của Auxin:

- Sự kéo dài và phân chia tế bào: do auxin có tác dụng kích thích mạnh lên sự kéo dài chiều ngang của tế bào, làm cho tế bào phình to lên Sự kéo dài của các tế bào gây lên sự tăng trưởng của cơ quan và toàn cây

- Kích thích sự tăng trưởng chồi non

Ngày nay, người ta đã phát hiện ra rễ trên 60 loại gibberellin trong cây và kỳ diệu là GA1,GA2, GA3, GA60 , trong đó GA3 có hoạt tính hóa học mạnh nhất GA3 được sản xuất bằng con đường lên men và chiết xuất sản phẩm từ dịch nuôi cây nấm

Gibberellin được tổng hợp chủ yếu trong lá non, một số cơ quan non đang sinh trưởng như phôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non sự vận chuyển nó trong cây theo hệ thống mạch dẫn và không phân cực như auxin GA trong cây cũng có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với hợp chất khác

Vai trò của GA3 :

- Hiệu quả rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng về chiều cao của thân, chiều cao của cành, của rễ, sự kéo dài của lóng cây hòa thảo Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của GA lên sự

dãn theo chiều dọc của tế bào, GA kiểm soát hướng đặt các vi sợi cenllulose mới được tổng hợp trong các tế bào

- Sự kéo dài lóng và tăng trưởng lá : kích thích kéo dài lóng là đặc điểm nổi bật của GA Hoạt động này vừa do sự phân chia tế bào thân GA kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì GA liều cao ( hay phối hợp với cytokinin) kích thích sự tăng trưởng lá (diện tích có thể gấp đôi bình thường)

- Sự phát triển chồi cây và nảy mầm của hạt

- GA làm chậm hiện tượng ngủ của chồi do ngày ngắn cảm ứng (mùa thu), và

gỡ sự ngủ của các chồi cây gỗ

- Trong phần lớn các trường hợp, GA có hoạt động bổ sung cho auxin Thông thường, GA làm tăng hàm lượng auxin trong các mô mà nó kích thích Tuy nhiên, hai chất này có hoạt động độc lập

Cytokinin:

Cytokinin là hormon thứ ba được phát hiện năm 1963 khi nuôi cấy mô thực vật, người ta phát hiện ra một nhóm chất hoạt hóa sự phân chia tế bào mà thiếu chúng thì sự nuôi cây mô không thành công, đó là 6-furfurilaminopurin, tức kinetin Kinetin chỉ hoạt động khi có auxin hiện diện, không có auxin sự phân chia tế bào do cytokinin không xảy ra Ngược lại, không có cytokinin thì auxin tạo thành các tế bào khổng lồ (không có sự phân vách) Kinetin không có trong thiên nhiên Cytokinin tự nhiên chủ yếu là zeatin Các cytokinin tổng hợp được

sử dụng khá rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào là kinetin và benzyl adenine (BA)

Cơ quan tổng hợp cytokinin là hệ thống rễ, từ rễ cytokinin được vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều auxin nhưng không có tính phân cực rõ rệt như auxin Ngoài rễ ra, một số cơ quan non đang sinh trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ bổ sung thêm cho nguồn cytokinin của rễ

Vai trò của cytokinin:

- Hoạt động trong sự tăng trưởng tế bào : Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào là phần nhân và phân bào Cytokinin giúp sự gia tăng kích thích

tế bào và sinh tổng hợp protein Trong thân và rễ cytokinin cản sự kéo dài tế bào, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào ( sự tăng trưởng củ) Cytokinin cũng kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành (auxin không

có tác dụng này)

- Hoạt động trong sự tạo cơ quan: tùy theo tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) trong môi trường nuôi cấy

ƒ Auxin/cytokinin cao kích thích sự tạo rễ

ƒ Auxin/cytokinin thấp kích thích sự tạo chồi

- Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng nhưng đồng thời cũng

có sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi),

sự cân bằng hai loại hormon này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển

- Hoạt động của cytokinin trong sự trưởng thành của diệp lạp : trong tối cây mầm bị hoàng hóa, nếu lá hoàng hóa được xử lý cytokinin trước sự chiếu sáng, diệp lục tố và các enzym quang hợp sẽ được tổng hợp mạnh hơn khi lá được chiếu sáng (sự kích thích không xảy ra trong tối)

Ethylene

Là một loại hormone ở thể khí (CH2=CH2), có nguồn gốc từ các vùng có nồng độ auxin cao Nó hoạt hoá sự chín đồng thời kích thích sự phát triển về phía bên của các tế bào kéo dài

Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình cây in vitro, nó tác

động đến các quá trình quang hợp và hô hấp của cây Ánh sáng còn góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất định của các phôi

Khi thiếu ánh sáng cây sẽ bị hoàng hoá do lá thiếu diệp lục tố vì quang hợp không xảy ra dẫn đến hậu quả là cây sẽ giảm trọng lượng, việc phân hoá mô và tạo rễ sẽ giảm

Mặt khác, khi cường độ ánh sáng yếu thì cường độ quang hợp cũng kém hơn

Khi ánh sáng quá nhiều, cường độ ánh sáng tăng cao sẽ làm tăng sự thoát hơi nước, làm cho môi trường nuôi cấy khô do thiếu nước ảnh hưởng tới sự phát triển của mô cấy

Ánh sáng trong phòng cấy mô có cường độ thay đổi trong khoảng 5.000lux thời gian chiếu sáng từ 8-10 giờ /ngày

3000-Khi chuẩn bị đưa cây ra vườn ươm thì cường độ ánh sáng tăng lên khoảng từ 3.000- 5.000 lux

Phản ứng của cây đối với quang hợp và phát sinh hình thái khi ánh sáng có bước sóng 400 và 680nm do diệp lục tố a và b có hai cực đại hấp thu, một ở vùng xanh lam (400-460nm), một ở vùng đỏ (620-680nm) và hầu như không hấp thu ánh sáng ở giữa hai cực đại này (tức trong vùng lục và vàng)

Chất lượng ánh sáng quyết định đến khả năng phát sinh hình thái của cây in

vitro Chất liệu bình nuôi cấy cho phép sự vận chuyển ánh sáng qua bình Ví

dụ: chất liệu là thủy tinh, nhựa, polycarbonate, cho phép cản ánh sáng có bước

sóng 390, 300, 290nm Như vậy, ánh sáng mà cây in vitro thu nhận được phụ

thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất liệu bình nuôi cấy

Độ ẩm

Độ ẩm trong nuôi cấy in vitro cần độ ẩm tương đối khoảng 95% do độ ẩm

ảnh hưởng tới hình thái, cấu trúc và sinh lý của mô cấy Độ ẩm giúp tạo áp suất thuỷ tĩnh, giảm bớt nhiệt độ dao động trong bình cấy, giúp vận chuyển các chất trong cơ thể thực vât…

Khi độ ẩm trong bình cấy mô quá cao sẽ gây ra sự bão hoà hơi nước trong bình cấy mô làm cho lớp cutin mỏng, hiện tượng thuỷ tinh thể xảy ra dẫn đến sự giảm năng suất khi đưa cây ra môi trường ngoài

Độ pH

Độ pH phù hợp trong nuôi cấy phôi dừa sáp trong khoảng từ 5,8-6 Trong môi trường nuôi cấy nếu pH chưa phù hợp thì nó có xu hướng dịch chuyển về

pH phù hợp để mô có thể phát triển được

1.6 Giai đoạn thích nghi:

Để thích nghi cây dừa nuôi cấy phôi, cây con cần có tỷ lệ thích hợp giữa

chồi và rễ Nếu cây con đã được tạo rễ in vitro, khi trồng vào hỗn hợp đất (chứa

trong túi PE) cần được duy trì trong các điều kiện che sáng một phần và độ ẩm tương đối cao trong vài ngày Cây thích nghi nhờ sự giảm dần độ ẩm tương đối

trong khí quyển Điều này được thực hiện đơn giản bằng cách trùm cây con với với túi PE trong suốt trong vài ngày sau đó mở dần túi PE ra

Cây con ra rễ in vitro có thể làm cho cứng cáp hơn bằng cách để cây con

trong ống nghệm thêm 1-2 tuần trước khi cho ra hỗn hợp đất

Xử lý cây con mới được chuyển ra đất với các chất chống nấm giúp làm tăng đáng kể sự sống còn của các cây con

Sự tự dưỡng của cây con:

Quang hợp và sự tạo lớp sáp cutin trên lá có ảnh hưởng trên sự sống còn của

cây con từ sự nuôi cấy in vitro

Cây con tăng tưởng in vitro trên môi trường giàu carbihydrate nói chung chỉ

sản xuất một phần rất ít nhu cầu carbohydrate từ sự cố định CO2 trong quang hợp

Khi các cây con này được chuyển vào điều kiện in vivo, chúng phải trở nên hoàn

toàn tự dưỡng, quang hợp gia tăng Tuy nhiên trong thời gian đầu (trong vòng

hợp Hô hấp tối của các cây này cũng cao hơn hô hấp tối của các cây con cùng tuổi, cho thấy rằng các cây con mới được chuyển dùng nhiều năng lượng để thích ứng với môi trường mới Do đó sự sống còn của các cây con mới được chuyển ra

vườn ươm lệ thuộc mạnh vào nguồn tinh bột được tích lũy trong sự nuôi cây in

vitro

Sự cân bằng nước của cây con:

Các cây con từ sự nuôi cây in vitro có lớp sáp cutin trên bề mặt lá mỏng hơn

nhiều so với các cây tương tự được trồng trong nhà kính hay ngoài đồng Sự giảm

lớp sáp cutin này làm cây con in vitro mất nước nhanh hơn cây bình thường và do

đó gây bất lợi cho cây in vitro khi mới chuyển ra vườn ươm Độ ẩm cao trong các

bình nuôi cây được xem là nguyên nhân chính làm giảm lớp sáp cutin Ánh sáng thấp cũng góp phần trong sự giảm này Một lý do khác của sự mất nước là hoạt động không hiệu quả của các khí khẩu

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Vật liệu nghiên cứu:

Phôi dừa nuôi cấy:

Phôi quả dừa sáp (Makapuno) được thu thập từ huyện Cầu Kè tỉnh Trà Vinh

Môi trường nuôi cấy:

Môi trường Y3 (Eeuswen, 1976), (chi tiết xem phụ lục)

trong thời gian từ 20-25 phút

Khử trùng mẫu cấy

- Dừa sáp sau khi được mang về được lột bỏ lớp vỏ bên ngoài, bổ đôi quả dừa

- Phôi được tách ra bằng dụng cụ lấy phôi

- Phôi dừa sau khi được lấy ra cùng với lớp cơm dừa mang đi rửa sạch, ngâm trong xà phòng loãng khoảng 3-5 phút, rửa sạch lại dưới vòi nước chảy

Các bước khử trùng phôi dừa sáp trong tủ cấy vô trùng :

- Ngâm phôi dừa sáp trong cồn 960 trong vòng 1-2 phút

- Ngâm trong javen 100% trong 10-15 phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng khoảng 4-5 lần

- Dùng dao cấy tách lấy phôi ra khỏi lớp cơm dừa

- Ngâm phôi đã được tách vào javen 10% trong vòng 1-2 phút

- Tiếp tục rửa lại phôi 3 lần bằng nước cất vô trùng

- Phôi đã sẵn sàng cho các thí nghiệm nuôi cấy

2.2.1 Nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp giai đoạn

phòng thí nghiệm: nguồn carbon, nitơ, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật để tăng tỷ lệ nảy mầm và sống của phôi dừa Sáp

Mục đích thí nghiệm: Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy phôi để làm tăng tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm, giúp phôi phát triển nhanh, cải thiện hệ thống chồi và rễ

2.2.1.1- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitơ (N) trong môi trường nuôi cấy:

Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn ra môi trường có hàm lượng N phù hợp cho sự phát triển của phôi dừa Sáp, giúp phôi phát triển tốt trong ống nghiệm

Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với số lượng 10 phôi/nghiệm thức

Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitơ (N) trong môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp

ST

T

tiếp theo về sự ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến phôi nuôi cấy

2.2.1.2- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến sự nảy mầm và tăng trưởng của phôi dừa Sáp:

Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn ra môi trường có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp cho phôi dừa Sáp, giúp phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm, phôi phát triển nhanh, chồi và rễ khỏe

Thí nghiệm một yếu tố gồm 4 nghiệm thức được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với 10 phôi/nghiệm thức

Bảng 2.2: Công thức thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến sự nảy mầm và tăng trưởng của phôi

dừa Sáp ST

T

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nảy mầm, tỉ lệ sống, chiều cao cây, chiều dài rễ, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy Thí nghiệm được theo dõi trong 3 tháng

2.2.1.3- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường (nguồn Carbon) trong môi trường nuôi cấy giai đoạn cây dừa con đã có lá: 3 nghiệm thức

Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy (lần cấy truyền thứ 4) thích hợp giúp cây dừa con vẫn tăng trưởng tốt trong ống nghiệm nhưng giúp cây dễ thích nghi ở giai đoạn vườn ươm, tăng tỷ lệ sống của cây ở vườn ươm

Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiêm thức được bố trí theo khối đầy đủ

hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với 10 cây/nghiệm thức

Bảng 2.3: Công thức thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm

lượng đường (Carbon) trong môi trường nuôi cấy

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy Thí nghiệm được theo dõi trong 5 tháng

2.2.2 Nghiên cứu các điều kiện ngoại cảnh để nuôi cấy phôi dừa trong phòng thí nghiệm: cường độ ánh sáng, phổ màu, cung cấp ôxy, nhiệt độ 2.2.2.1- Nghiên cứu ảnh hưởng của việc nuôi cấy lắc (cung cấp ôxy)

và nhiệt độ đến tỉ lệ nảy mầm của phôi dừa (giai đoạn phôi mới được đưa vào ống nghiệm):

Mục đích thí nghiệm: Trong quá trình nuôi cấy phôi, đặc biệt là giai đoạn phôi mới được cấy vào ống nghiệm, chúng tôi nhận thấy một số phôi bị chìm hoàn toàn trong môi trường lỏng, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15%, điều này làm hạn chế tỷ lệ nảy mầm và tăng trưởng của phôi

Thí nghiệm được thực hiện nhằm lựa chọn điều kiện nuôi cấy (môi trường lỏng lắc hay môi trường lỏng tĩnh kết hợp với nhiệt độ 25oC ± 2oC

và 30oC ± 2oC) giúp cải thiện tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây của phôi dừa Sáp đặc biệt là đối với những phôi bị chìm hoàn toàn trong môi trường nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy lỏng tĩnh: Sau khi được tách ra khỏi nội nhũ, các phôi được cấy vào các bình tam giác 250ml có chứa 50ml môi trường lỏng Y3

- Yếu tố A gồm 2 nghiệm thức:

• A1: Môi trường lỏng tĩnh

• A2: Môi trường lỏng lắc

- Yếu tố B gồm 2 nghiệm thức:

• B1: Nhiệt độ 250C ± 20C

• B2: Nhiệt độ 300C ± 20C

• B3: Nhiệt độ 350C ± 20C

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống, tỷ lệ nảy mầm

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy Thí nghiệm được theo dõi trong 2 tháng

2.2.2.2- Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và phổ màu đến sự sinh trưởng của phôi dừa giai đoạn đã có lá

Các cây dừa con đã có lá, chiều cao chồi 5cm được nuôi cấy trong môi trường Y3 cải tiến (kết quả của thí nghiệm 1) Các ống nghiệm được đặt trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau

Thí nghiệm 2 yếu tố gồm cường độ ánh sáng và phổ màu ánh sáng đỏ và ánh sáng xanh do đèn huỳnh quang tạo ra được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với 10 cây/nghiệm thức

Yếu tố A gồm 3 nghiệm thức về phổ màu ánh sáng do đèn huỳnh quang tạo ra:

Chỉ tiêu theo dõi:

- Chiều cao cây, chiều dài rễ, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá…

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy

2.2.3 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho giai đoạn chuyển

tiếp phòng thí nghiệm vườn ươm nhằm nâng cao tỷ lệ sống

Hiện nay, chi phí điện cho máy điều hòa nhiệt độ và đèn chiếu sáng cho phòng nuôi cấy phôi chiếm một tỷ lệ khá cao trong cơ cấu giá thành của cây giống Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng tự nhiên thì những ống nghiệm này rất dễ bị nhiễm Mặc khác, khi loại bỏ hoàn toàn đường trong môi trường nuôi cấy thì cây mọc chậm lại Bên cạnh đó, các phôi được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có hàm lượng đường cao, cây chưa có khả năng quang hợp với hiệu suất cao nên sự thích nghi của cây

ở vườn ươm còn yếu, giảm tỷ lệ sống của cây con ở vườn ươm

Thí nghiệm này nhằm so sánh lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp ở giai đoạn cây chuẩn bị chuyển ra vườn ươm (lần cấy truyền cuối, lần 6) giúp cây vẫn tăng trưởng tốt và thích nghi dần với điều kiện tự nhiên khi chuyển

ra vườn ươm

Các cây dừa con trong ống nghiệm có kích thước 15cm, đã có 2 lá, nuôi trong môi trường Y3 cải tiến (kết quả của thí nghiệm 1) được đặt vào các điều kiện khác nhau

Thí nghiệm gồm 2 yếu tố được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 10 cây/nghiệm thức

- Yếu tố A gồm 2 nghiệm thức:

• A1: Ánh sáng đèn phòng nuôi cấy phôi

• A2: Ánh sáng tự nhiên của vườn ươm được che nắng 1 phần Dùng lưới xanh đen che thành 2 lớp cách nhau 0,5m Khoảng cách giữa lưới và nơi đặt cây con là 2m

- Yếu tố B gồm 3 nghiệm thức:

• B1: Môi trường có đường 20g/l

• B2: Môi trường không có đường + tinh bột 20g/l

• B3: Môi trường không có đường Ánh sáng tự nhiên khác ánh sáng đèn ở điểm là cường độ ánh sáng thay đổi liên tục trong ngày từ 500 đến 7.000 lux và nhiệt độ ngày

và đêm cũng liên tục thay đổi từ 24-36oC

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ nhiễm, chiều cao cây, chiều dài rễ, số lá, chiều dài lá…

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy

2.2.4 Nghiên cứu nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi giai

đoạn thích nghi ở vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo

- Nghiệm thức 1: Alpine 80WDG (hoạt chất Fosetyl-Aluminum 80%) 2g/l

- Nghiệm thức 2: Daconil 75WP (hoạt chất Chlorothalonil 75%) 1,5g/l

- Nghiệm thức 3: Dithane M45 (hoạt chất Mancozeb) 5g/l

- Nghiệm thức 4: Carban (hoạt chất Carbendazim 80%) 2g/l Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, thí nghiệm được lặp lại 4 lần với 10 cây/nghiệm thức

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ nhiễm, tỷ lệ sống không nhiễm

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy

2.2.5 Nghiên cứu cải tiến điều kiện nuôi trồng cây dừa sáp nuôi cấy

phôi ở vườn ươm (giai đoạn thích nghi): nhiệt độ, độ ẩm

Thí nghiệm được thực hiện nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa nuôi

cấy phôi giai đoạn đầu thích nghi ở vườn ươm, giảm thiểu tỉ lệ chết do sự thoát hơi nước nhanh của lá trong điều kiện nhiệt độ cao và ánh sáng cao của nhà lưới (được che bằng lưới đen giảm nắng có cường độ ánh sáng thay đổi trong ngày từ 500 lux đến 7.000 lux)

Để tạo độ ẩm cho nhà lưới, sau khi được che một phần ánh sáng bằng lưới giảm sáng xanh đen, nhà lưới được thiết kế với hệ thống tưới phun sương

Thí nghiệm 1 yếu tố gồm 3 nhóm điều kiện được bố trí theo khối đầy đủ, hoàn toàn ngẫu nhiên, thí nghiệm được lặp lại 4 lần, 10 cây/nghiệm thức:

- Điều kiện 1 (ĐK 1): nhiệt độ 35oC ± 2oC, ẩm độ 60%

- Điều kiện 2 (ĐK 2): nhiệt độ 35oC ± 2oC, ẩm độ 80-90%

- Điều kiện 3 (ĐK 3): nhiệt độ 30oC ± 2oC, ẩm độ 80-90%

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ sống, chiều cao cây, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá, đường kính gốc,…

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi trồng

2.2.6 Nghiên cứu một số tổ hợp phân bón cho cây dừa Sáp nuôi cấy

phôi ở vườn ươm (bao gồm: phân bón NPK, các chế phẩm sinh học, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật…)

Khác với cây dừa được ươm từ quả có nguồn dinh dưỡng cân đối của nước dừa và cơm dừa nuôi phôi phát triển thành cây, cây dừa nuôi cấy phôi khi đưa ra vườn ươm cần bổ sung dinh dưỡng cho cây phát triển thông qua việc bón phân giúp cây hấp thu dinh dưỡng qua lá (phân bón lá) hoặc qua rễ (bón gốc)

Thí nghiệm nghiên cứu một số tổ hợp phân bón cho cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi, giúp cây tăng trưởng nhanh, khỏe

Các cây dừa được trồng trên giá thể gồm đất mặt, phân chuồng, bụi dừa, tro trấu (tỷ lệ 2:1:1:1) được bón phân với các tổ hợp phân bón như sau:

• Tổ hợp 1 (TH1): phân bón lá (Growmore) NPK 30-10-10 liều lượng 2g/lít, phun 7 ngày/lần

• Tổ hợp 2 (TH2): phân bón lá (Growmore) NPK 30-10-10 liều lượng 2g/lít kết hợp với phân bón lá vi lượng, vitamin B1 và kích thích tăng rễ NAA (HVP Vitamin B1 PL-HK) liều lượng 1 ml/lít, 7 ngày/lần

• Tổ hợp 3 (TH3): Phân bón lá (Growmore) NPK 30-10-10 liều lượng 2g/lít 7 ngày/lần Bổ sung phân vi sinh Tricho (công ty Mai Xuân) liều lượng 1g/1kg phân chuồng/gốc 1 lần trong suốt thời gian thí nghiệm

• Tổ hợp 4 (TH4): Phân bón lá (Growmore) NPK 30-10-10 liều lượng 2g/lít, 7 ngày/lần kết hợp với bón gốc 16-16-8-13S (Phân bón Bình Điền) liều lượng 5g/gốc, 2 tuần/lần

- (Vitamin B1) 2500ppm, (Polyhydroxydioic acid) 1,5%

- (Aminotriethanoic acid) 3,5%, (Alpha-Naphthalene acetic acid) 800ppm

Chế phẩm Tricho (Mai Xuân)

- Vi khuẩn Bacillus sp.: 108CFU/g 16-16-8-13S (Phân bón Bình Điền)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Chiều cao cây, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá, đường kính gốc,…

- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi trồng

2.2.7 Phương pháp thu thập và thống kê số liệu

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần tại 3 thời điểm khác nhau cách nhau một tuần

Thời gian nảy mầm: được tính từ khi bắt đầu cấy phôi vào môi trường cho

đến khi xuất hiện chồi và rễ sơ cấp thấy được bằng mắt thường

Đo đường kính lá và đường kính thân: dùng thước thẳng để đo đường

kính lá và thước cặp để đo đường kính thân Chiều cao cây được đo từ gốc đến ngọn lá, chiều dài lá được đo từ mép cuống lá đến ngọn lá, chiều rộng lá được đo ở phần chiều rộng to nhất của

lá

Xác định trọng lượng tươi:

Xác định trọng lượng tươi bằng phương pháp cân với cân phân tích có sai số 0,1mg của hãng Satorius (Đức)

Mẫu cấy được cân khi mới bắt đầu cấy vào môi trường và sau mỗi lần cấy truyền (mỗi tháng)

Đo cường độ ánh sáng bằng lux kế Texto-545 fc (Đức)

Thống kê số liệu:

Các số liệu thu thập được phân tích bằng phần mềm Excel và phần mềm MSTAT-C để đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN

3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp giai đoạn phòng thí nghiệm: nguồn carbon, nitơ, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

để tăng tỷ lệ nảy mầm và sống của phôi dừa Sáp

3.1.1- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitơ (N) trong môi trường nuôi cấy:

Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn ra môi trường có hàm lượng N phù hợp cho sự phát triển của phôi dừa Sáp, giúp phôi phát triển tốt trong ống nghiệm

Bảng 3.1.1.1: Tỷ lệ nảy mầm của phôi dừa Sáp nuôi cấy trên môi trường Y3 có thay đổi hàm lượng nitơ

Kết quả ghi nhận sau khi nuôi cấy 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần

Tỷ lệ nảy mầm (%) Nghiệm

thức

Công thức môi trường Sau 4

tuần

Sau 8 tuần

Sau 12 tuần

Sau 16 tuần

nuôi cấy có ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của phôi Tuy nhiên trong một thời gian ngắn (4 tuần) thì chưa thấy sự khác biệt rõ giữa các nghiệm thức

Khi so sánh tỷ lệ nảy mầm trung bình của 3 nghiệm thức sau 8 tuần nuôi cấy, các nghiệm thức có bổ sung N cho tỷ lệ nảy mầm cao hơn nghiệm thức

sử dụng môi trường Y3 căn bản (Môi trường Y3 căn là môi trường đối chứng, được sử dụng trong qui trình nuôi cấy phôi dừa hiện có của Viện) Nghiệm thức N2 (môi trường Y3 có bổ sung hàm lượng N tổng thêm 1/2) cho kết quả cao nhất, tỷ lệ nảy mầm đạt 72,18% sau 8 tuần nuôi cấy, khác biệt với nghiệm thức N0 nhưng không khác biệt với nghiệm thức N1 Còn nghiệm thức N1 (môi trường Y3 có bổ sung hàm lượng N tổng thêm 1/3), tuy tỷ lệ nảy mầm thu được là 68,35% có cao hơn nghiệm thức đối chứng N0 (60,32%) nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê

Tỷ lệ nảy mầm đạt cao nhất sau 12 tuần nuôi cấy Khi so sánh tỷ lệ nảy mầm trung bình của 3 nghiệm thức sau 12 tuần nuôi cấy, sự khác biệt giữa các nghiệm thức là rất có ý nghĩa Đặc biệt là nghiệm thức N2 (môi trường Y3

có bổ sung hàm lượng N tổng thêm 1/2) cho kết quả cao nhất, tỷ lệ nảy mầm đạt 85.38% sau 12 tuần nuôi cấy

Kết quả này cho thấy được sự ảnh hưởng của N lên khả năng nảy mầm của phôi dừa Sáp, điều này cho thấy vai trò của N khi được cung cấp vào môi trường nuôi cấy, làm phôi tăng khả năng tổng hợp auxin, làm tăng tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây của phôi

Ảnh hưởng của hàm lượng N trong môi trường nuôi cấy lên tỷ lệ nảy mầm của phôi dừa Sáp theo thời gian

0 20 40 60 80 100

Bảng 3.1.1.2: Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ (N) trong môi trường

nuôi cấy phôi dừa sáp

Kết quả ghi nhận sau 12 tuần nuôi cấy

NT Chiều

cao cây (cm)

Chiều dài rễ (cm)

Số rễ chính Số rễ phụ Số lá Dài lá (cm) Rộng lá

(cm)

ĐK gốc (cm)

Trọng lượng tươi (g)

N0 8,78b 4,87b 1,10b 17,00b 1,29 6,40 1,80 0,87b 1,356b N1 10,86b 4,43b 1,30b 12,20b 1,38 7,25 1,84 0,99b 1,428b N2 15,57a 7,27a 2,20a 24,48a 1,40 9,44 1,97 1,23a 3,764a

và chiều rộng lá thì không có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức

Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường Y3 có bổ sung thêm N dùng trong nuôi cấy phôi dừa là vô cùng hiệu quả, giúp làm tăng tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây của phôi, làm gia tăng trọng lượng tươi của cây thông qua việc tăng chiều cao cây, số rễ chính, số rễ phụ và đường kính gốc