Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác và nhân giống bò

Nghiờn cứu tạo phôi in-vitro từ tế bào trứng thu trên bò sống bằng phương pháp siêu âm đã đưa ra được quy trỡnh thu tế bào trứng với tần xuất 2 lần/ tuần và ỏp xuất chõn khụng 120 mmHg ở

VIỆN CHĂN NUÔI

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN

PHỤC VỤ CÔNG TÁC VÀ NHÂN GIỐNG BÒ

CNĐT : NGUYỄN THỊ THOA

8245

HÀ NỘI – 2010

Công nghệ Cấy truyền phôi bò đã được nghiên cứu ứng dụng ở Việt Nam từ những năm 1978, nhưng từ đó đến nay hầu như chưa có một cải tiến đáng kể nào về kỹ thuật sản xuất phôi in-vivo, phôi in-vitro ở bò sữa Với kết quả nghiên cứu trước đây, số lượng phôi in-vivo trung bình thu được từ bò cho phôi dao động từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần thu phôi, mặt khác khoảng cách thu phôi lặp lại sau 60-90 ngày, như vậy một năm chỉ tiến hành thu phôi 4-5 lần/bò và sồ phụi bỡnh quõn/bũ/năm chỉ đạt 15 phụi Nghiên cứu cải tiến rút ngắn khoảng cách giữa các lần thu phôi từ 60-90 ngày xuống 28-35 ngày/bũ/lần đã tăng

số phụi thu được từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần lờn 5,5-5,7 phôi/bò/lần và tăng số phôi thu được

30- 45 phụi/bũ/năm Nghiờn cứu tạo phụi bũ in-vitro từ tế bào trứng thu ở lũ mổ trước

đõy với mục đớch nghiờn cứu để hoàn thiện phương phỏp chỉ cú ý nghĩa trong nghiờn cứu khoa học và không có ý nghĩa về giống trong sản xuất Nghiờn cứu tạo phôi in-vitro

từ tế bào trứng thu trên bò sống bằng phương pháp siêu âm đã đưa ra được quy trỡnh thu

tế bào trứng với tần xuất 2 lần/ tuần và ỏp xuất chõn khụng 120 mmHg ở bũ sữa 3-6 tuổi

cú thể thu được 7-8 tế bào trứng/bũ/lần và tạo được nguồn phụi in-vitro từ nhứng bũ sữa

cú giá trị giống và tiềm năng di truyền cao

ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được nghiên cứu từ năm 1984 tại Viện Khoa học Việt Nam Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 120C/phút) sau khi khử nước một phần ở nhiệt độ phòng với phôi bò đã thành công (Bùi Xuân Nguyên và cs 1984) Năm 2003, Lưu Công Khánh và cộng sự đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò bằng glycerol Năm 2005 Nguyễn Thị Thoa và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp đông lạnh phôi Vitrivication (tạo thuỷ tinh thể) bước đầu đã thành công nhưng tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh còn thấp chỉ đạt 73,24%

Trong nghiên cứu này đã đưa ra được quy trình đông lạnh thuỷ tinh thể (vitrification) cải tiến đã tăng tỷ lệ sống của phôi đông lạnh sau giải đông từ 73,24% lên 80% Chúng tôi đưa ra các quy trình cải tiến với mục tiêu cung cấp chính xác về cỏc bước tiến hành trong quy trình cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên cú thể ứng dụng

để sản xuất phụi in-vitro, phôi in-vitro, đông lạnh phôi trờn bũ sữa tại Việt Nam

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2007-2010

THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

Tên đề tài: “ Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo

và nhân giống bò”

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thoa

Điện thoại: 0913321521

Địa chỉ: Nhà số 1, Ngách 148, Phố Hoàng Ngân- Trung Hoà- Cầu Giấy- Hà Nội

Cơ quan : Viện Chăn nuôi

Cơ quan phối hợp:

1 Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học Việt Nam

2 Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi- Viện Chăn nuôi

3 Trung tâm Nghiên cứu Bò và Đồng cỏ Ba Vì; Hà Tây

4 Trung tâm, Trạm trại tỉnh Thanh Hoá, Hải Dương

Thời gian thực hiện:

Từ năm 2007-2010

5 Kinh phí: 2.500.000.000 đồng

PHẦN I : MỞ ĐẦU

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Chăn nuôi ở nước ta có vai trò quan trọng đối với nông nghiệp và phát triển kinh tế quốc dân, giá trị ngành chăn nuôi hàng năm chiếm tỷ lệ 30% tổng giá trị trong nông nghiệp Trong những năm vừa qua chăn nuôi đang góp phần quan trọng đối với chuyển đổi cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp, tăng thu nhập cải thiện đời sống cho nông dân Tốc độ phát triển chăn nuôi và sản phẩm chăn nuôi hàng năm tăng bình quân từ 6-8% đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước ngày càng cao về sản phẩm chăn nuôi Tổng sản lượng thịt sản xuất năm 2009 của nước ta đạt trên 3,7 triệu tấn thịt hơi và có tốc độ tăng trưởng bình quân năm đạt trên 6%/năm đưa bình quân sản lượng thịt trên đầu người lên trên 43kg/người/năm

Phát triển chăn nuôi bò thịt, bò sữa và gia súc ăn cỏ được Bộ Nông nghiệp

và Nhà nước cũng như các địa phương quan tâm đầu tư và có chính sách khuyến khích phát triển từ những năm cuối của thế kỷ trước và đầu thế kỷ XXI Quyết định số 167 của Thủ tướng Chính phủ về một số biện pháp và chính sách phát triển bò sữa Việt Nam giai đoạn 2001-2010, ngày 20 tháng 10 năm 2001 là một trong những minh chứng cho sự quan tâm đó Trong thời gian từ 2001 đến nay, thực hiện Chương trình phát triển bò sữa theo Quyết Định 167 của Thủ tướng Chính phủ, chăn nuôi bò sữa Việt nam đã thu được nhiều kết quả tốt đẹp, phát triển một cách bền vững đáp ứng nhu cầu tiêu dùng sữa ngày càng cao của xã hội Tổng đàn bò sữa và sản lượng sữa của cả nước tăng từ 40.000 con và 64.000 tấn năm 2001 lên 140.000 con và 290.000 tấn năm 2010 Chăn nuôi bò sữa đã thực sự mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội cao đối với nông nghiệp của Việt Nam trong thời gian 2001-2010

Để có được số lượng và chất lượng bò sữa HF Việt Nam như hiện nay là kết quả áp dụng khoa học kỹ thuật và công nghệ sinh học trong lại tạo và nhân giống bò sữa Việt Nam của các nhà khoa học trong suốt thời gian hơn 50 năm

Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo và công nghệ phôi trong đó có kỹ thuật đông lạnh tinh, phôi là một trong những kỹ thuật sinh sản quan trọng nhất đã và đang được

áp dụng trong cải tiến và nhân giống bò sữa HF Việt Nam

Đối với bò thịt mặc dù đã có nhiều tiến bộ kỹ thuật áp dụng trong công tác lai tạo và nhân giống, nhưng chăn nuôi bò thịt tại Việt Nam vẫn chưa đáp ứng kịp nhu cầu tiêu thụ thịt bò của thị trường nôi địa về số lượng và chất lượng

Hầu hết các nhà hàng, khách sạn và siêu thị cao cấp vẫn phải nhập thịt bò từ Mỹ, Australia, New Zealand Theo số liệu thống kê năm 2009 sản lượng thịt trâu, bò hơi chỉ đạt 330 ngàn tấn thịt trâu bò/năm; tương đương mức tiêu thụ trung bình trên đầu người chưa đến 1,5 kg/thịt/năm là rất thấp so với mức tiêu thụ 9-10 kg/năm tại các nước trong khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản

Để phát triển chăn nuôi bò thịt, thành một ngành sản xuất hàng hoá, dự án Cải tiến và nâng cao chất lượng giống bò thịt Việt Nam 2006-2010 và Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 theo Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 16 tháng 1 năm 2008 đã đặt mục tiêu tăng cường

cơ cấu giống bò lai, bò thịt chất lượng cao nhằm đạt tổng sản lượng thịt bò 310 ngàn tấn vào năm 2015 và 425 ngàn tấn năm 2020 Để đạt được mục tiêu trên của bò thịt và bò sữa, việc cải tiến các công nghệ sinh học sinh sản, như cải tiến công nghệ tạo phôi trong ống nghiệm (TTON-in vitro fertilisation) từ tế bào trứng thu trên bò sống bằng kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật gây rụng trứng nhiều (hay gây siêu bài noãn) để tạo phôi in vivo, và một số kỹ thuật liên quan chúng ta có thể khai thác được tối đa tiềm năng sinh sản của bò cái cao sản góp phần tăng

nhanh số lượng, chất lượng của đàn bò hạt nhân đây là biện pháp kỹ thuật then chốt cần được quan tâm đầu tư nghiên cứu

Căn cứ vào mục tiêu và yêu cầu cấp bách về thịt sữa cho tiêu dùng trong nước trong những năm vừa qua, Bộ Nông nghiệp và PTNT đã phê duyệt và cho

phép chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò”

II MỤC TIÊU

Đề tài này được xây dựng theo hướng sử dụng tổ hợp công nghệ sinh học sinh sản tiên tiến phục vụ cho việc tạo và nhân giống bò như:Công nghệ phôi, công nghệ đông lạnh tế bào sinh sản, để nâng cao năng xuất sinh sản và chất lượng giống bò một cách nhanh chóng và hiệu quả

Mục tiêu chính của đề tài là : Cải tiến và ứng dụng thành công các công nghệ sinh sản hiện đại (công nghệ sản xuất phôi invivo, phôi invitrro, công nghệ đông lạnh tinh, đông lạnh phôi…) để nâng cao năng suất sinh sản và chất lượng giống bò bò thịt, bò sữa

PHẦN II TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ CẦN NGHIấN CỨU

I CƠ SỞ KHOA HỌC CễNG NGHỆ CẤY TRUYỀN PHễI Bề

1.1 Kớch thớch noón bao phỏt triển đồng loạt bằng sự tỏc động hormone

Nhiều tỏc giả cho thấy rằng tiềm năng sinh sản của bũ lớn hơn rất nhiều so với khả năng sinh sản thực của chỳng Theo Erickson (1966) cho biết buồng trứng của bũ cú trờn 70.000 noón bao nguyờn thuỷ cú thể phỏt triển thành tế bào trứng để thụ tinh và tạo phụi Nghiờn cứu trờn bũ cú chu kỳ động dục đều Danell(1987) cho biết trung bỡnh số tế bào trứng là 12636 và ở bò không hoạt

động có số tế bào trứng là 10132, sự khác nhau này không rõ ràng (P>0,05) Nghiên cứu về tế bào và mô học buồng trứng bò, Hafbigo (1947) đã công bố rằng

bê 3 tháng tuổi có 21000 và ở bò già có 2500 tế bào trứng

Ở bũ, mỗi chu kỳ chỉ rụng 1 trứng, nếu thụ tinh chỉ được một bờ, trong một đời bũ cỏi chỉ sinh được 7-8 bờ như vậy trong thực tế số noón bào được sử dụng hữu ớch là rất ớt, đối với một đời con cỏi cao sản thật là lóng phớ

Nhiều nghiờn cứu cho thấy trong một chu kì ở bò thường có 2 đến 3 đợt sóng nang phát triển cá biệt có tới 4 đợt Sóng nang là sự phát triển của một số noãn bao ở cùng một thời gian Nghiên cứu theo dõi về sự phát triển của nang trứng trờn buồng trứng ở bũ sống bằng phưong pháp siêu âm được nhiều tác giả công bố Đợt một bắt đầu diễn ra sau khi rụng trứng vào ngày thứ 3-9 của chu kì,

đợt hai vào ngày 11-17, đợt ba là ngày 18-0 Mỗi đợt sóng nang có thể huy động tới 15 nang kích thước từ 5-7 mm phát triển, sau này có một nang phát triển mạnh hơn gọi là nang trội (nang khống chế) Kích thước của nang khống chế ở

đợt 1, 2, 3 có thể đạt 12-15 mm và các đỉnh kích thước nang tương ứng quan sát thấy vào các ngày 6, 13, 21 (Dalin 1987, Monget 1993) Đặc điểm trong các đợt

phát triển nang là sự phát triển có tính tự điều khiển và cạnh tranh giữa các nang Mỗi đợt có 1-2 nang trội, vài nang lớn phát triển và sự phát triển của các nang còn lại bị kìm hãm Tuy vậy trong khi thể vàng còn tồn tại, nang khống chế và nang lớn sẽ bị thoái hoá, chỉ có đợt cuối cùng khi thể vàng không còn thì nang khống chế mới phát triển tới chín và rụng Đây là lí do giải thích tại sao mỗi chu kì động dục của bò chỉ có một trứng chín và rụng (cá biệt có 2 trứng) Do đặc

điểm này các đợt phát triển nang còn được gọi là các sóng nang phát triển Trong mỗi đợt sóng như vậy sự tồn tại của các nang không phải nang khống chế dao

động từ 5-6 ngày (Ireland 1987, Fortune và cs 1988) Riêng nang khống chế có thể phát triển nhanh sau ngày 18 của chu kì, tốc độ phát triển của nang khống chế vào thời điểm này có thể đạt 1,6mm một ngày (Fortune và cs.1988, Savio và

cs 1988)

Trờn cơ sở nghiờn cứu về về quy luật phát triển của nang trờn buồng trứng

và những hiểu biết hormone điều khiển sinh sản, nhiều cỏc nhà khoa học đã tạo cho trứng rụng đồng loạt trong một chu kì và tạo được nhiều phôi có chất lượng vào điểm được xác định bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiều Kỹ thuật gõy rụng trứng nhiều đó thu được nhiều kết quả khả quan Gây rụng trứng nhiều (GRTN) lần đầu tiờn được nghiên cứu trên chuột của Engle (1927); trên bò và cừu của Col và Miller (1933); Parker và Hammond (1940) và Casida và cs (1944) Các phương pháp GRTN trong giai đoạn này bước đầu nghiờn cứu chủ yếu trên cơ sở

về mối tương quan tuyến yên-buồng trứng và sự phát hiện hocmon ECG và estrogen ở phụ nữ có thai và ngựa chửa (Smith và Engle: 1927; Zondek và Aschheim: 1927) Kết quả GRTN ở giai đoạn này còn rất hạn chế và vì vậy tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi chỉ đạt từ 2-10%

Nghiên cứu xây dựng các phương pháp GRTN một cách hệ thống và trên cơ sở hiểu biết đầy đủ về cơ chế điều khiển sự phát triển nang và rụng trứng bắt

đầu thực hiện từ những năm 1970 Trong giai đoạn này, sự phát triển công nghệ phôi ở quy mô lớn đối với các đối tượng chăn nuôi quan trọng như cừu, bò; các phương tiện nghiên cứu hiện đại và chính xác như miễn dịch phóng xạ, siêu

âm cũng đã được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học sinh sản Những

đóng góp quan trọng liên quan đến việc xây dựng các phương pháp GRTN trong giai đoạn này đã được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu quy luật phát triển nang, rụng trứng và vai trò thể vàng trong hoạt động chu kỳ tính buồng trứng Nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy sự rụng trứng chỉ xảy ra ở các nang đã phát triển tới độ chín cần thiết, bao gồm sự tăng tối đa kích thước nang và xoang chứa dịch nang, và sự chín noãn được thể hiện qua các hiện tượng tan màng nhân, phân lập cầu cực 1, và phân bố thể nhiễm sắc ở giai đoạn metaphase II (M II) (Thibault

1985, Blerk Van và bell, 1986)

Điều kiện cần thiết để các quá trình chín và rụng trứng xẩy ra là sự tăng cường phân tiết LH của tuyến yên trong máu ngoại vi Sự chín và rụng trứng chỉ xảy ra sau khi xuất hiện đỉnh LH Quan sát ở bò cho thấy trong chu kỳ bình thường, sự tan màng nhân xuất hiện khoảng 5 giờ sau đỉnh LH, sự hình thành nhiễm sắc thể M II xẩy ra khoảng 17-22 giờ sau đỉnh LH, và rụng trứng xảy ra

22 giờ sau đỉnh LH (Dieleman 1993) Vào thời điểm sắp rụng trứng, sự tăng các thể tiếp nhận LH được quan sát thấy trong các nang khống chế sẽ dẫn tới tăng tổng hợp Progesterone và PGF Các hocmon này có tác động gây sự vỡ nang thông qua sự kích thích hoạt động co các cơ trơn nằm ở lớp màng ngoài buồng trứng (Akamura và cs 1972; Virutamanen 1972, Chaning và cs 1980) hoặc tăng

sự tổng hợp các enzym gây tan màng nang như plasmin, hyaluronidaza (Beer 1975; Espey 1974) Những nghiên cứu này góp phần đưa ra các chỉ dẫn về vai trò

và phương thức sử dụng LH hoặc hCG trong gây rụng trứng nhiều Ngoài ra, đã

có rất nhiều tác giả nghiên cứu về các phương pháp và sử dụng các loại hocmôn khác nhau để GRTN ở bò cho phôi

trên bò cho kết quả rất tốt Bò được tiêm PMSG vào giữa chu kì động dục với

tổng sối 24 bò được tiến hành gây rụng trứng nhiều có 18 bò động dục trong

2 và 4 Bằng phương pháp phẫu thuật để đánh giá kết quả cho thấy rằng cả 24 bò

đều có phản ứng mạnh và có số trứng rụng bình quân là 13,2±19, trong đó có 20

bò có noãn bao không rụng bình quân là 3,3 Thí nghiệm khác trên 35 bò với liều

2000 UI, PMSG tác dụng vào ngày thứ 16 của chu kì động dục, kết quả chỉ có 24

bò phát hiện có phản ứng với PMSG bằng phương pháp khám lâm sàng qua trực tràng Khi mổ khám có 7 bò trong số 29 bò không rụng trứng và có u nang buồng trứng Trên 17 bò bình quân trứng rụng là 8,0±1,5 có 4 bò vẫn còn noãn bao không rụng Một nghiên cứu nữa được tiến hành trên 10 bò với sự kết hợp cả

rụng đã thu được 97 phôi (đạt tỉ lệ 69% trứng rụng), trong đó có 88% phôi thụ tinh Từ những kết quả thu được tác giả có nhận xét rằng kết hợp PMSG với

trên bò Boland và cs 1978; Chupin và Procureur, 1982; Newcomb và cs 11976) cho thấy việc sử dụng eCG để GRTN ở bò thường kèm theo các hạn chế có thể

ảnh hưởng âm tính lên kết quả thụ tinh và sự phát triển phôi như thời điểm xuất hiện động dục không chính xác, động dục kéo dài Trong các trường hợp này tỷ

lệ bò có phản ứng rụng trứng cao (89% cú phản ứng), nhưng chỉ có hơn 44% bò

có trên 5phôi/1 lần, và chỉ có 25% số phôi đạt tiêu chuẩn tốt Trong thực tiễn khả năng gây rụng trứng nhiều lặp lại trên cùng một cá thể cho phôi

Hasler và cs (1983) đã làm thí nghiệm so sánh kết quả gây rụng trứng nhiều bằng eCG lặp lại nhiều lần trến bò sữa Holstein cho thấy số trứng rụng không giảm (10 thể vàng), nhưng tỷ lệ thu phôi và tỷ lệ trứng thụ tinh có thể giảm từ 30-40% ở những lần GRTN lặp lại Savage và Maletoft (1984) đã sử dụng Estradiol –17 β hoặc GnRH với FSH-P Với số bò là 54 được gây rụng trứng nhiều từ ngày 10-12 của chu kì động dục với liều 28 FSH-P, mỗi ngày tiêm hai lần với liều giảm dần, trong 4 ngày liên tục Sau khi tiêm 48h mỗi bò

là 0,35±2,7, số trứng được thụ tinh là 6,3±5,4 trên tất cả bò thí nghiệm

bò cái tơ với liều 2500UI PMSG tiêm vào ngày thứ 9-12 của chu kì động dục Sau khi tiêm PMSG 48h, mỗi bò được tiêm 1mg Fenprostalene và đã có 27 bò đã

động dục sau khi tiêm Fenprotalen từ 2-5 ngày Trung bình số trứng rụng là 11,5 (từ 1-25 trong đó có 17 bò có số trứng rụng lớn hơn 10) Trong số trứng phôi thu

được có 72% trứng đã thụ tinh và 74% trong số đó phát triển bình thường

tiến hành Thí nghiệm được chia thành 5 ô kí hiệu từ A tới E và Norgestomet đã

được cấy vào các thời gian khác nhau của chu kì động dục: ngày 0-3 (A); ngày 4-8 (B); ngày 8-11(C); Ngày 16-20 (D); Còn FSH (37mg) tiêm vào ngày thứ 7 sau khi cấy Norgestomet với liều giảm dần trong 4 ngày, mỗi ngày 2 lần Norgestomet được lấy ra sau khi cấy được 9 ngày Nhóm đối chứng (F) cũng

được tiêm cho tất cả bò thí nghiệm và đối chứng sau khi tiêm FSH 48h và 60h Trung bình số trứng rụng và phôi đảm bảo chất lượng cho tất cả bò thí nghiệm là 10,3±1.8 và 6,5±1,9 Còn các lô đối chứng là 8,8±1,4 và 5,4±1,0 tương ứng Không có sự khác nhau đáng kể trong các lô thí nghiệm từ A tới E Các tác giả

đã rút ra kết luận rằng dùng Norgestomet kết hợp với FSH để gây rụng trứng nhiều cho bò cần quan tâm ngày của chu kì động dục của bò và đây là một phương pháp tốt và có hiệu quả Bằng phương phương pháp này chúng ta không mất nhiều thời gian phát hiện động dục và tạo động dục đồng pha đối với bò cho phôi trong kỹ thuật cấy truyền phôi bò

Năm 1986, tác giả Kostov và cs đã tiến hành gây rụng trứng nhiều ở bò

tiêm 96h và có 17,6% số bò không động dục Số bò có thể vàng từ 2-4; 5-10;

11-15 và trên 11-15 tương ứng là 3; 6; 2 và 4 con Sau khi gây rụng trứng nhiều bằng FSH và Estradiol Dieleman và cs (1987) báo cáo kết quả gây rụng trứng nhiều ở

bao tương ứng là 15,7±2.5 và 15,4±1,6 cho mỗi bò thí nghiệm Kết quả ở bò thí nghiệm cao gấp 2 lần so với bò đối chứng về số lượng trứng rụng và độ tin cậy (P<0,05)

Kim và cộng sự (1987) đã công bố kết quả của việc sử dụng PMSG và anti–PMSG Thí nghiệm đã tiến hành trên 80 bò và chia làm 3 lô: lô A : PMSG

và anti–PMSG; lô B: PMSG +monoanti–PMSG và lô C: FSH tiêm 4 ngày mỗi ngày 2 lần Bình quân số thể vàng trên bò là:12,4; 11,9 và 4,4, bìmh quân noãn bao không rụng là 1,2; 2,2 và 0,4 tương ứng cho các lô A; B; C Số phôi tương ứng cho các loại A, B và C là 8,2 (66,1%);7,3(61,3%) và 3,9(88,6%) Trong đó tỷ

lệ phôi có khả năng cấy trên các phôi thu được là 5,9(71,9% ; 5,11(69,8%0; và 3,6 (92,3%) tương ứng cho các lô A; B; C Kết qủ tương tự cũng được Kostov thông báo (1986) về gây rụng trứng nhiều ở bò dùng PMSG và anti-PMSG

Bergfelt và cs (1994) đã thông báo như sau: bò tơ Simental từ 17 đến 22 tháng sau khi gây rụng trứng nhiều đã động dục 100%, số trứng rụng và phôi

tương ứng là 16,4±1,89 và 10,1±1,79, trong đó số phôi cấy được bình quân cho

mỗi bò là 5,3±1,09

Theo Crister và cs (1988) sử dụng FSH và eCG để GRTN tuy không dẫn tới sự khác nhau về số trứng rụng (10 thể vàng) nhưng có thể ảnh hưởng dương tính lên chất lượng phôi Tỷ lệ phôi có thể cấy được ở lô bò được xử lý FSH cao hơn so với lô bò được xử lý eCG (58% so với 42% Tuy vậy, Alcivar và cs (1983) trong thí nghiệm so sánh sử dụng FSHp (26mg, kiều giảm dần) và Pergonal (1500IU) tiêm vào ngày 9-11 của chu kỳ, đã thông báo những kết quả ngược lại :

số thể vàng và số phôi thu được ở lô bò được xử lý FSH (11 thể vàng, 9 phôi) cao hơn so với lô dùng Pergonal (10 thể vàng, 7,5 phôi), song số phôi cấy được không khác nhau giữa 2 lô (5 phôi cấy được) Theo Aoygi và cs (1987) sự biến

đổi nồng độ hocmon Progesterone và estradiol trong máu ngoại vi của bò được gây rụng trứng nhiều bằng FSH và eCG không khác nhau rõ rệt

Theo Yadav và cs (1985), Ellington và cs (1987) việc sử dụng Progesterone và PGF trong gây rụng trứng nhiều để khống chế thời điểm, thời gian và mức độ động dục có thể đem lại những cải tiến về số trứng rụng và chất lượng phôi Trong trường hợp bò cho phôi có hoạt động sinh sản kém, kết quả gây rụng trứng nhiều thấp, thì việc sử dụng PGF (50mg) tiêm nhiều lần (3 lần, cách nhau 6 giờ thay vì tiêm 2 lần cách nhau 12 giờ) có thể tăng đáng kể tỷ lệ

động dục (96% so với 86 %), tỷ lệ phôi thụ tinh (62% so với 51%), số phôi tốt thu được (5,4 so với 3,8) (Donaldson 1986)

Estradiol cũng có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả gây rụng trứng nhiều

Bổ xung 20mg estradiol-17β vào ngày thứ 1-2 sau khi xử lý eCG, làm tăng số

nang phát triển và tăng số trứng thụ tinh Kết quả sử dụng estradiol-17β bổ xung vào FSH hoặc eCG để gây rụng trứng nhiều ở bò Simental được Broadbent và cs

(1995) thông báo gần đây là 15 thể vàng với số bò được xử lý FSH, và 16 thể vàng với bò được xử lý eCG

Theo Dieleman và cs (1993) dùng anti-eCG bổ xung vào thời điểm động dục là phương pháp hiệu quả và đơn giản để tăng hiệu quả của eCG và chất lượng phôi thu được Tuy vậy, anti-eCG có thể cho những kết quả khác nhau tuỳ theo phương pháp sử dụng Chất lượng phôi sẽ giảm sút khi anti-eCG được đưa vào trước khi xuất hiện đỉnh LH

Trạng thái buồng trứng của bò cho vào thời điểm gây rụng trứng nhiều là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến kết quả gây rụng trứng nhiều Theo Lindell và

cs (1986), xử lý FSH vào ngày thứ 9 của chu kỳ của bò cho kết quả rụng trứng

và chất lượng phôi cao hơn hẳn so với xử lý vào ngày thứ 3 hoặc 6 Gouding và

cs (1990) cũng thông báo kết quả tương tự trên đối tượng bò thịt

Về góc độ sinh lý và môi trường, các nghiên cứu đã được công bố cho thấy các yếu tố cá thể, giống, mùa vụ đề ảnh hưởng rất lớn tới kết quả gây rụng trứng nhiều ở bò Kết quả thí nghiệm của Foote và Onuma (1976) cho thấy tuỳ thuộc theo trạng thái cá thể phản ứng rụng trứng ở bò có thể dao động từ 0-104 trứng rụng/con Trong trường hợp gây rụng trứng nhiều nằng cùng một quy trình, bò có trạng thái sinh sản bình thường cho 10 trứng rụng trong đó có 6,4 trứng tốt, trong khi bò vô sinh chỉ cho 6 trứng rụng và 2,4 trứng dùng được Phản ứng rụng trứng

ở bò có chu kỳ ngắn hơn 15 ngày cũng kém hơn so với bò có chu kỳ dài 15-27 ngày (Crister và cs (1988)

Tuổi bò lúc xử lý gây rụng trứng nhiều cũng ảnh hưởng quan trọng đến kết quả tạo phôi Phản ứng rụng trứng nhiều ở bò tơ chưa đẻ và bò đẻ 1-5 lần thường cao hơn so với bò đã đẻ trên 6 lần (Grevet 1982) Chất lượng phôi thu được sau gây rụng trứng nhiều ở bò sữa 12 tháng tuổi kém hơn so với bò sữa đã đẻ 1-2 lứa; trong trường hợp bò tơ, số trứng rụng có xu hướng cao hơn (22 thể vàng/con/lần),

nhưng tỷ lệ phôi đạt tiêu chuẩn cấy phôi rất thấp (2/22 phôi) (Schilling và cs 1981) Olivera-Angel và cs (1984) nghiên cứu về tỷ lệ thu phôi và chất lượng của phôi sau khi gây rụng trứng nhiều bằng eCG (2000 IU) trên bò thịt tơ và bò thịt

đang cho bú cho thấy ở bò tơ tỷ lệ thu phôi chỉ đạt 15% và tỷ lệ phôi phát triển bình thường là 40%, thấp hơn nhiều so với tỷ lệ thu phôi đạt 39% và tỷ lệ phôi phát triển bình thường 67% ở bò đang cho bú

Phản ứng rụng trứng nhiều cũng rất khác nhau giữa các giống bò Theo Gauthier (1983), số trứng rụng trung bình trong các xử lý gây rụng trứng nhiều bằng eCG là 2,9 ở bò Pir noir, 6,2 ở bò Charolaise, 4,9 trứng ở bò lai Holstein-Fresian, và 8,2 trứng ở bò Holstein Kết quả gây rụng trứng nhiều cũng có thể thay đổi do ảnh hưởng của các điều kiện địa lý khí hậu khác nhau Phản ứng buồng trứng và chất lượng phôi thu được trong mùa Đông -Xuân thường tốt hơn

so với mùa Hè- Thu

Theo thông báo của Hasler và cs (1983) phản ứng rụng trứng nhiều của bò Holstein nuôi trong điều kiện ôn đới là 11 thể vàng nếu được xử lý vào mùa

đông-xuân, và 9,5 thể vàng nếu được xử lý vào mùa hè-thu Tương tự, kết quả rụng trứng nhiều và thu tinh ở bò Holstein nuôi tại điều kiện nhiệt đới Châu phi

là 12 thể vàng, 73% phôi tốt, 95% trứng thụ tinh đối với bò được xử lý eCG vào mùa đông, và 7 thể vàng, 46% phôi tốt, 85% trứng thụ tinh đối với bò được xử lý vào mùa hè (Gordon và cs 1987)

nhiều tỏc giả, có thể đưa ra nhận xét rằng hầu hết các phương pháp GRTN được

sử dụng phổ biến hiện nay, đều được sử dụng các hocmon sinh sản và ở mức độ các cơ chế điều khiển nội tiết-thần kinh thể dịch

Nguyên tắc chung của các phương pháp này là:

1) Khống chế thể vàng bằng các hocmon có hoạt tính làm tiêu thể vàng như oestrogen, prostaglandin và dẫn xuất của chúng

2) Khống chế hoặc làm mất nang khống chế bằng các hocmon Estradiol, hCG

3) Tăng khả năng huy động nang mới phát triển, và khả năng phát triển các nang đã được huy động bằng FSH, eCG

4) Tạo sự chín đều và rụng trứng cùng lúc cho các nang ở con cho, hoặc giữa con cho và con nhận, bằng cách sử dụng kết hợp progestin và PGF

1.2 Gõy động dục đồng pha và cấy phụi cho bũ nhận

Gây động dục đồng pha (GĐDĐP) là quá trình kích thích cho cái nhận phôi động dục đúng vào thời điểm động dục của cái cho phôi Đồng pha giữa cái nhận phôi và cái cho phôi còn có ý nghĩa trạng thái sinh lý sinh dục ở cái nhận phôi phù hợp với tuổi của phôi Như vậy nếu tiến hành cấy phôi tươi, cái cho phôi

và cái nhận phôi phải đồng thời động dục Khi cấy phôi đông lạnh, cái nhận phôi

đã động dục trước đấy một thời gian, thường là 7 ngày (đúng với tuổi của phôi)

Chu kỳ động dục của bò bình quân 21 ngày, dao động 17-24 ngày Chu kỳ này được phân thành các thời kỳ nhỏ kế tiếp nhau Trước động đực, động đực, sau động đực và yên tĩnh Nó được đặc trưng bởi hai pha: pha noãn nang và pha thể vàng Mỗi thời kỳ, mỗi pha đều có những đặc điểm và biểu hiện riêng biệt, có thể nhận thấy hoặc không thể nhận thấy được Sự thay đổi về trạng thái sinh lý của cơ quan sinh dục tương ứng ở các thời kỳ như: sưng, xung huyết, phân tiết niêm dịch, độ pH niêm dịch, thành phần các chất trong niêm dịch và sự vận động của cơ quan sinh dục đặc biệt tử cung phải phù hợp, tương ứng với trạng thái sinh

lý của hợp tử sau là phôi ở từng giai đoạn phát triển Có như vậy mới tạo điều kiện cho phôi thai sống phát triển bình thường trong cơ thể mẹ Vì lẽ đó, cấy truyền phôi chỉ được tiến hành cho những con nhận có trạng thái sinh lý sinh dục

phù hợp với giai đoạn phát triển của phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi Sự không

đồng pha sẽ làm cho mẹ nhận phôi đào thải phôi, phôi không thể tiếp tục sống, phát triển trong tử cung mẹ nhận Khi cái nhận phôi động dục đồng thời với cái cho phôi, hoặc trạng thái sinh lý sinh dục của nó phù hợp với tuổi phôi người ta gọi là đồng pha hoàn toàn và lấy số 0 làm biểu tượng Người ta cũng lấy dấu (+) hoặc (-) đặt trước thời gian cái nhận phôi động dục trước hoặc sau cái cho phôi để biểu hiện mức độ đồng pha Ví dụ +1: cái nhận phôi động dục trước 1 ngày; -1: cái nhận phôi động dục sau 1 ngày, v.v

Kết quả nghiên cứu của Rowson và ctv (1972) cho biết khi cấy phôi cho cái nhận phôi đồng pha hoàn toàn tỷ lệ đậu thai đạt đến 91%, trước 1 ngày (+1)

tỷ lệ này là 57%, còn sau 1 ngày (-1) đạt 52%, +2 ngày: 40%, -2 ngày: 30%

Thông báo của Church (1974) cho biết tỷ lệ có chửa dao động 35-80% tuỳ thuộc vào sự đồng pha giữa cái cho phôi và cái nhận phôi Lowson và ctv (1975); Church và ctv (1976); Sreenan và Beehan (1976) cùng nhận thấy nếu cái nhận phôi được chọn lọc cẩn thận, thể trạng tốt, chăm sóc nuôi dưỡng chu đáo, trạng thái sinh lý phù hợp với tuổi phôi, tỷ lệ đậu thai đạt 50-60% nếu cấy một phôi và

đạt đến 90% nếu cấy hai phôi

Mỗi phôi đã được tạo ra và lựa chọn để cấy, số phận tiếp theo của nó phụ thuộc vào kết quả đánh giá phản ứng động dục đồng pha và chuẩn bị con nhận phôi Thực chất quá trình chuẩn bị con nhận phôi là gây động dục nhân tạo và

đồng pha nhằm tạo điều kiện bảo đảm cho phôi được tiếp nhận và làm tổ sau khi cấy vào cơ thể bò nhận Chất lượng của con nhận phôi được thể hiện qua chỉ tiêu:

1- Trạng thái động dục bên ngoài (dịch nhầy, dấu hiệu động dục )

2- Sự chín của nang, rụng trứng và hình thành thể vàng

3- Trạng thái nội tiết cần thiết cho sự phát triển của phôi

4- Sự phát triển của cơ quan sinh sản cần thiết cho quá trình làm tổ, mang thai và cuối cùng là sự đồng pha của tất cả các trạng thái trên với tuổi phôi

Việc gây động dục nhân tạo và đồng pha được thể hiện chủ yếu bằng các hormone nội tiết điều khiển sinh sản với các nguyên tắc sau:

1- Tạo trạng thái khởi động chu kỳ đồng đều giữa các bò thông qua việc

triển ở số lượng thích hợp 3- Cho sự rụng trứng đồng pha vào thời điểm dự kiến

Cũng như việc gây rụng trứng nhiều, quá trình này chịu sự điều khiển nội tiết của cơ thể và qua đó chịu sự ảnh hưởng rõ rệt của các yếu tố môi trường, giống và trạng thái cơ thể

Đánh giá chất lượng gây động dục đồng pha qua tỉ lệ động dục và thụ thai cho thấy gây động dục đồng pha theo nguyên tắc rút ngắn giai đoạn thể vàng bằng PGF trong trường hợp bò được chọn lọc kỹ và nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn hoá có thể tỉ lệ thụ thai bằng hoặc cao hơn với động dục tự nhiên (75% so với 68%) Việc gây động dục bằng Chlormadion Acetate Progesteron (CAP) đơn

lẻ không đáp ứng nhu cầu chuẩn bị con nhận phôi Tỉ lệ động dục ở bò Zebu Brahman: được tiêm hoặc cho ăn 50 mg CAP trong 5 ngày, chỉ đạt 22 - 41% (Joche và cs, 1978)

Tỷ lệ động dục và thụ thai được cải tiến đáng kể khi Progesteron được kết hợp với Estradiol-17β Sử dụng Synchro-Mate-B có thể cho kết quả 88% động dục, 70% thụ thai ở bò Holstein đã đẻ vài lần (Anderson và cs, 1982) Kết quả tượng tự cũng đã được Foote và Hunter (1964) công bố trong các thí nghiệm trên

bò thịt ảnh hưởng dương tính của việc bổ xung Estrogen lên tỉ lệ động dục và thụ thai cũng đã được thông báo ở bò Herefors-Angus được gây động dục bằng PGF (Peters, 1984) hoặc Progesterone Releasing Intravanginal Divice (PRID; smith và McGowan, 1982) Theo thông báo của tác giả này, việc bổ xung Estrogen (400àg) và thời điểm 48 giờ sau khi tiêm PGF làm tăng tỷ lệ động dục và thụ thai

thêm 30%; song kết quả tương tự không xảy ra trong trường hợp bổ xung Estradiol-17βb vào thời điểm 48 giờ sau khi tiêm PGF

Việc bổ xung Equin Chorionic Gonadotropin (eCG) cũng có thể đem lại những cải tiến tỷ lệ rụng trứng và thụ thai Sự tăng tỷ lệ bò có rụng trứng đã được (Sreenan và cs, 1975) thông báo ở bò thịt được bổ xung ECG 750 I.U vào kết thúc xử lý Progesteron vào thứ 9 Việc bổ xung eCG được xem là cần thiết đối với bò thịt nghỉ ngơi sinh sản do mùa hoặc cho con bú, vì phản ứng động dục sau khi được xử lý PGF thường thấp ở các bò này

Máu sinh sản có ảnh hưởng rõ rệt lên kết quả gây động dục Kết quả gây

động dục bằng Chlormadion Acetate Progesteron (CAP) ở bò Zebu Brahman của Joche và cs (1978) cho thấy tỷ lệ động dục thầm lặng trong mùa mưa cao hơn hẳn so với mùa khô (41% so với 22%)

Kết quả gây động dục đồng pha cũng phụ thuộc nhiều vào tính năng sản xuất của bò Gây động dục đồng pha bằng PGF thường không hiệu quả đối với bò thịt đang cho con bú ở trạng thái nghỉ ngơi (anoestrus) Tỷ lệ động dục trong trường hợp này chi đạt 30 - 50% (Roche và cs, 1979) Theo Roche và cs (1976)

và Aquino và cs (1989), việc sử dụng Gonadotropin Stimulating Hormon(GnRH)

và Estradiol-17β đều không đem lại những cải tiến đáng kể trong trường hợp này Gosling và cs (1975) quan sát nồng độ hormon Luteinising Stimulating Hormon (LH) trong máu ngoại vi của bò thịt sau khi tiêm Gonadotropin Stimulating Hormon(GnRH) 100àg và Estradiol-17β 400àg hai lần, vào ngày15 và lặp lại vào ngày 30 sau khi đẻ cho thấy chỉ có 7/72 bò có đỉnh LH rõ nét

Liên quan đến việc động dục và cấy phôi, Cooper và Furr (1976) thông báo 90% bò sữa tơ được sử lý PGF (500 àg, hai lần, cách nhau 11 ngày) có biểu hiện

động dục trong vòng một ngày (n=175) Tuy vậy kết quả đo thời điểm tiêu thể vàng qua nồng độ Progesteron trong máu và thời điểm xuất hiện đỉnh LH, rụng

trứng của Hahn (1976) trên bò sữa được xử lý PGF (ICI 80 996) vào ngày thứ 10

- 11chu kỳ cho thấy thời điểm tiêu thể vàng tương đối tập trung (sai lệch 3,3 giờ

so với trung bình), nhưng thời điểm rụng trứng còn phân tán (sai lệch 18 giờ so với trung bình 81 giờ)

Theo Roche (1976) tỷ lệ động dục ở bò tơ và bò sữa Holstein được cấy Progesteron vào trong âm đạo trong 12 ngày là 99% và trong đó 90% tỷ lệ bò có

động dục cùng ngày là 72% và 70% Cũng theo Roche việc bổ xung 17β vào ngày đầu cấy Progesteron đem lại những cải tiến quan trọng: 94% bò trong trường hợp này có biểu hiện động dục đồng pha cung ngày

Estradiol-Ảnh hưởng của Equin Chorionic Gonadotropin (eCG) và Estradiol-17β lên

sự đồng pha cũng được Nancarraw và Miller (1976) thông báo trên bò được xử lý PGF, PGF kết hợp ECG (750 I.U) và PGF kết hợp với estradiol benzoate 500 àg Sai lệch thời gian xuất hiện động dục tương ứng cho các lô trên là 5,5 - 7 giờ (trên 78,9%); 3 giờ (trên 67,2%) và trên 2,4 giờ (trên 52,9%)

So sánh kết quả thụ thai sau cấy phôi ở bò có độ lệch pha khác nhau, Hensen (1976) thông báo tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi bò Belgian blue-white bred

được xử lý PGF dao động từ 40 tới 65% trong độ lệch pha cho nhận -24 tới + 12 giờ và cao nhất ở mức lệch: +6 giờ (trước con cho, tức phôi trẻ hơn), -24 giờ (con nhận rụng trứng sau con cho)

Theo Rowson và cs (1969) giới hạn lệch pha động dục chp phép tối đa là

24 giờ Việc cấy phôi vào con nhận động dục 36 giờ trước con cho hoặc hơn 12 giờ sau con cho đều cho kết quả chửa thấp, trong khi theo Hahn (1976) sự lệch pha ± 0,5 ngày có thể chấp nhận

Phương pháp sử dụng hormone có thể khác nhau, phải được lựa chọn, điều chỉnh cho từng trường hợp cụ thể mới đem lại hiệu quả cao Sử dụng SMB cho kết quả 88% động dục, 70% có chửa ở bò Holstein (Anderson và ctv, 1982)

Kết quả cuối cùng của cấy phôi được thể hiện qua tỷ lệ thụ thai Quá trình làm tổ chỉ xảy ra trong khoảng thời gian giới hạn Trong trường hợp sinh sản bình thường, sự phối hợp nhịp nhàng giữa phôi và cơ thể mẹ được thực hiện nhờ các Steroid (Maurer và Echternkamp, 1982) Protein nội mạc tử cung Uretroglobin và các tín hiệu trao đổi thông tin do phôi tổng hợp như Triphoblaxin, PSPB (Pregnancy Specific Protein)

Cấy phôi là sự chuyển phôi từ cơ thể mẹ này (mẹ cho) sang một cơ thể mẹ khác (mẹ nhận), số phận phôi sau khi cấy vào cơ thể mẹ nhận, sẽ phụ thuộc vào:

1 Môi trường cơ thể mẹ nhận

2 Giới hạn miễn dịch

3 Sự trao đổi tín hiệu mẹ - phôi trong trường hợp cấy phôi cùng loài Yếu

tố quan trọng nhất là sự trao đổi tín hiệu giữa phôi và cơ thể mẹ là sự đồng pha

Theo thông báo của các tác giả, tỷ lệ có chửa trên 50% nếu độ lệch pha giới hạn xung quanh 1 ngày, sẽ giảm xuống chỉ còn 20% nếu độ lệch pha lớn hơn

2 ngày

Newcomb và Rowon (1975), Yadan (1986), Newcomb (1977) cho rằng để

có tỷ lệ đậu phôi cao, thì bò nhận phôi động dục muộn hơn 1 ngày so với bò cho phôi Iglesias (1971), Alcalas (1986) cho rằng để có tỷ lệ đậu thai cao hơn, thì bò nhận phôi biểu hiện động dục sau bò cho phôi 1 ngày

Tỷ lệ bò có chửa cao nhất nếu cặp cho nhận phôi có độ lệch pha trong phạm vi 6 đến 24 giờ (Bùi Xuân Nguyên và ctv, 1996)

1.3 Đụng lạnh phụi

Cơ chế đông lạnh phôi: Nghiờn cứu về cơ chế đụng lạnh tế bào, theo định luật

Loi Raoult, độ hạ băng điểm của dung dịch phụ thuộc vào nồng độ các chất hoà tan khi hạ nhiệt độ, lúc xuất hiện tinh thể nước đầu tiên là bắt đầu thay đổi giai

đoạn đông băng Điều này chỉ có thể xẩy ra khi nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng độ

hạ băng điểm của dung dịch Nhiều nghiờn cứu cho biết bờn trong tế bào chứa hơn 80% nước, nồng độ nước này cao hơn bên ngoài tế bào Vì vậy, sự thay đổi giai đoạn đông lạnh nội bào xẩy ra ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bên ngoài Trong quá trình đông lạnh, trước tiên ở môi trường bên ngoài tế bào những tinh thể nước được tạo thành, làm tăng nồng độ chất hòa tan nhanh chóng Sự tăng áp suất thẩm thấu này, nước sẽ đi ra ngoài tế bào, làm giảm thể tích tế bào Mức độ mất nước tế bào phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc

độ này phải ở trên tốc độ giới hạn, mà tốc độ giới hạn lại thay đổi theo loại tế bào, khả năng tạo băng đá nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do

đông lạnh hay giải đông Tốc độ lạnh ở dưới tốc độ giới hạn thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, trong đó nồng độ chất hoà tan cũng đồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào Trong môi trường huyền phù (vừa thể lỏng vừa tinh thể) nước tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào, mọi trao đổi chất của tế bào ngừng hoạt động, tế bào sống tiềm sinh Như vậy,

sự hiện diện của tinh thể nước đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống sót của tế bào

Theo Mazur (1977), cho biết những hiện tượng vật lý chính xẩy ra trong

xung quanh chưa đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh chưa tạo đá (supercooling) và vì

sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh Tinh thể nước sẽ hình

nước - seeding), nhưng các chất bên trong tế bào vẫn chưa đông lạnh và nhiệt độ lạnh chưa tạo đá, có thể do màng tinh thanh ngăn cản sự lan rộng tinh thể nước vào trong tế bào chất Theo định nghĩa, nước ở nhiệt độ lạnh chưa tạo đá bên

trong tế bào có nồng độ hoá học cao hơn so với nước trong dung dịch được đông lạnh một phần bên ngoài tế bào, và đáp lại sự chênh lệch này, nước sẽ đi ra ngoài

tế bào và đông lạnh bên ngoài tế bào

Tốc độ làm lạnh ảnh hưởng đến cỏc hiện tượng vật lý xẩy ra tiếp theo bên trong tế bào Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hoá học ngoại bào Kết quả là tế bào mất nước và không đông lạnh bên trong tế bào Nhưng nếu tế bào được đông lạnh quá nhanh, nó không có khả năng mất nước nhanh để duy trì cân bằng, vì vậy nhiệt độ lạnh chưa tạo đá (supercolling) tăng lên và cuối cùng đạt được sự cân bằng bằng việc đông lạnh nội bào

Có nhiều chất bảo vệ lạnh được sử dụng với các nồng độ khác nhau và thường được dùng kết hợp với nhau Những chất bảo vệ lạnh được dùng phổ biến hiện nay gồm glycerol và dimethylsulphoxide (DMSO) và một số glycol (ethylene glycol, propylene glycol….)

như một chất chống đông; có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan trong nước và cồn Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế bào thay thế các phân tử nước thấm xuất ra ngoài tế bào làm cho tế bào không bị giảm dung tích Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên nước đóng băng ở dạng nhỏ, loại trừ được sự giãn nở của tinh thể nước có kích thước lớn, ngăn cản được sự phá vỡ màng và tế bào Vì vậy

mà glycerol giữ được sự ổn định về nồng độ của các chất hoà tan, không làm thay

đổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trình

đông lạnh Để phôi có thể cân bằng với glycerol, người ta chuyển phôi vào dung

dịch PBS có nồng độ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất định để thực hiện quá trình rút nước nội bào và thay thế bằng glycerol

Ethylene glycol có phân tử lượng thấp hơn (62,07) so với của glycerol (92,10), chất này có tác dụng tương tự glycerol và có thể dùng thay thế cho glycerol trong đông lạnh phôi bò Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol trong

đông lạnh phôi bò là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi phôi bò theo các bước mà chất này tự thẩm xuất ra ngoài (Docchi và cs 1995, Voelkel và Hu, 1992)

Nguyen và cs (2000) đã báo cáo rằng khi sử dụng 60% ethylene glycol trong dung dịch PBS để đông lạnh, tỷ lệ phôi sống và tỷ phôi thoát màng sau giải

đông tương ứng là 78% và 55% Tuy nhiên, khi các tác giả này kết hợp làm mất nước một phần và sử dụng 39% ethylene glycol, 0,7M sucrose và 8,6% filcoll, tỷ

lệ phôi sống và tỷ phôi thoát màng sau giải đông tương ứng là 77% và 85%

Hasler và cs (1997) đã đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm trong dung dịch PBS có nồng độ 1,4M glycerol hay 1,5M ethylene glycol Sau khi giải

đông và nuôi 72 giờ, tỷ lệ phôi thoát màng tương ứng là 69,2% và 62,4%

Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lượng thấp (78,13) Chất này lần đầu tiên được Wilmut và Rowson (1973) sử dụng để đông lạnh phôi bò Tuy nhiên, nhiều tác giả đã nhận thấy rằng, có sự khác nhau về khả năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và đối với phôi bò thì glycerol có khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO Vì thế, đến cuối những năm

1970, glycerol được dùng nhiều hơn DMSO trong việc đông lạnh phôi bò

Đường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng được dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường được dùng với các chất bảo vệ lạnh khác

Kasai (1996) đã tổng kết rằng, các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc sự dụng kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh

như dimethyl sulphoside, acetamide, propylene glycol, glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng độ khác nhau để đông lạnh phôi đông vật có vú

Theo Bui Xuan Nguyen (1997), việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phôi đông lạnh có sự khác nhau giữac các loài Đối với thỏ, khả năng sống của phôi đông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glycerol hay DMSO rất thấp (0-5%) so với đông lạnh bằng propaneol (92%) Đối với phôi dâu-phôi nang

bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0%) Trong khi đó, phôi bò được đông lạnh trong hỗn hợp chất bảo vệ lạnh sucrose-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn so với trong hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0%) Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác vẫn chưa được rõ

Với quan điểm sinh học lạnh, các tế bào phôi không khác biệt với các loại

tế bào sống khác Điều quan trọng nhất của quá trình đông lạnh là loại bỏ nước nội bào trước khi chúng được đông lạnh Đã có nhiều nghiên cứu về kỹ thuật

đông lạnh bao gồm loại chất bảo vệ lạnh và nồng độ sử dụng của chúng, tốc độ hạ nhiệt độ, nhiệt độ tạo đá và nhiệt độ chuyển phôi sang nitơ lỏng cũng như nhiệt độ và tốc độ giải đông (Renard và cs 1982; Lehn-Jensen, 1983; Franks và

cs 1986; Prather và cs 1987; Renard và cs 1984; Nguyen và cs 2000)

Cỏc nghiờn cứu trước đõy, đông lạnh phôi có thể chia làm 2 phương pháp:

đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh Đông lạnh chậm là phương pháp mà ở đó quá trình làm mất nước nội bào và việc hạ nhiệt độ có kiểm soát xẩy ra chậm trước khi phôi được chuyển vào bảo quản trong nitơ lỏng Đối với phương pháp

đông lạnh chậm, phôi được chuyển vào môi trường có chất bảo vệ lạnh theo nhiều bước với nồng độ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi trường có nồng độ chất bảo vệ lạnh thích hợp Thời gian cân bằng trong phương pháp này thường 10-30 phút Sau khi cân bằng, phôi được đông lạnh với tốc độ

hạ nhiệt 0,30C/phút xuống nhiệt độ –320C hay –350C và từ nhiệt độ này phôi

dịch glycerol 6 bước với nồng độ tăng dần (0,25M; 0,5M; 0,75M; 1,0M; 1,25M

và 1,5M) hay 3 bước (0,47M; 0,93M; 1,4M glycerol) và thời gian cân bằng ở mỗi bước khoảng 5 phút hay 1 bước vào dung dịch 1,8M ethylene glycol và cân bằng

15 phút Sau đó cọng rạ chứa phôi được chuyển ngay vào máy đông lạnh và việc

ngữ dùng để mô tả việc hình thành đá có kiểm soát ở nhiệt độ lạnh, bằng cách chạm panh đã được nhúng trước vào nitơ lỏng vào thành của cọng rạ Ngay sau khi tạo tinh thể đá, đá sẽ được hình thành nhanh chóng trong toàn bộ cọng rạ

1995)

Phương pháp đông lạnh nhanh là những phương pháp đông lạnh mà thời gian từ lúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá trình đông lạnh xẩy ra rất nhanh Phôi sau khi đã được khử nước nội bào được chuyển thẳng vào niơ lỏng

mà không cần phải sử dụng máy đông lạnh có kiểm soát nhiệt đã được lập trình sẵn

Nguyen và cs (1984) đã đề xuất một khả năng đông lạnh nhanh hay siêu nhanh trên cơ sở thay thế việc mất nước tăng dần bởi nhiệt độ thấp bằng mất nước bộ phận nhanh ở nhiệt độ phòng Dựa trên nguyên tắc này, một phương pháp đông lạnh nhanh, đơn giản trong nitơ lỏng được thực hiện bằng cách làm mất nước một phần (1-2 phút) ở nhiệt độ phòng và cân bằng ở nhiệt độ -300C đã

được công bố

Một trong những phương pháp đông lạnh nhanh được nghiên cứu rộng rãi

là phương pháp thuỷ tinh hoá (vitrification) Thuỷ tinh hoá là thuật ngữ chỉ quá trình đông cứng mà không tạo thành tinh thể đá không có sự cô đọng các chất

hoà tan như trong các phương pháp đông lạnh truyền thống; có sự tăng đột ngột

sự đặc quánh (viscovity) trong môi trường lưu phôi, tạo nên chất rắn dạng thuỷ tinh Phương pháp đông lạnh thuỷ tinh hoá lần đầu được Rall và Fahy (1985) đề xuất Sau đó phương pháp này đã được nhiều tác giả nghiên cứu thành công để

đông lạnh phôi đông vật có vú (Pugh và cs 2000, Kasai 2002, Atabay và cs

2004, Diez và cs 2005) ưu điểm của phương pháp này là thời gian đông lạnh nhanh, không cần thiết bị đông lạnh đắt tiền và điều quan trọng là tỷ lệ sống của phôi sau khi đông lạnh-giải đông cao Gần đõy TS George E Seidel, Colorado State University) đó nghiờn cứu cải tiến phương phỏp đụng lạnh thủy tinh thể(Vitrification method) phụi bũ cực nhanh bằng sử dụng Syngrod (Bioniche Animal Health) + 0.1% (w/v) polyvinyl alcohol, Ethylene Glycol(EG), Galactose Thời gian cõn bằng ở nhiệt độ phòng trong vũng 45 giõy,cọng rạ chứa phôi được khử nước một phần trên hơi Nitơ lỏng trong 1 phỳt với mục đớch nõng cao tỷ lệ phụi sống sau đụng lạnh, giải đụng

1.4 Giải đụng phụi

dụng, tế bào phôi phải được phục hồi sự sống trong điều kiện bình thường ở trạng thái ban đầu, không có tinh thể nước đá và không có chất bảo vệ lạnh ở trong và ngoài tế bào phôi; tế bào phôi tiếp tục sống và phát triển trong điều kiện mới Nhìn chung, tế bào phôi từ trạng thái sinh học bình thường chuyển sang trạng

thường của môi trường, sức sống của tế bào phôi có thể bị giảm đi rất nhiều, số lượng tế bào phôi chết có thể tăng lên

Về nguyên tắc, việc tách chất bảo vệ lạnh khỏi tế bào phôi phụ thuộc vào phương pháp đông lạnh và bổ sung chất bảo vệ lạnh Trong các quy trình pha

loãng chất bảo vệ lạnh thông thường, phôi được tiếp xúc với nồng độ chất bảo vệ lạnh giảm dần (Lehn-Jensen, 1983, Franks và cs 1986, Prather và cs 1987) Quá trình này đòi hỏi phải sử dụng kính hiển vi và thao tác trong phòng thí nghiệm

Đầu những năm 1980, một số tác giả đã nghiên cứu phương pháp giải đông mới thay thế cho phương pháp giải đông nhiều bước (Renard và cs 1982) ở phương pháp này, phôi bò đông lạnh-giải đông được chuyển từ môi trường có chất bảo vệ lạnh sang môi trường ưu trương có các chất dinh dưỡng không thẩm thấu như sucrose Khi quá trình này xẩy ra, các chất bảo vệ lạnh nội bào thẩm thấu ra ngoài phôi để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu Khi phôi không còn chứa các chất bảo vệ lạnh nội bào nữa, nó co lại tới một thể tích do áp xuất thẩm thấu của dung dịch sucrose và phôi nhanh chóng được pha loãng trong môi trường

đẳng trương Ngày nay cựng với phương phỏp đụng lạnh cải tiến, phương phỏp giải đụng phụi trở nờn đơn giản,dễ ứng dụng vào sản xuất và thuận lợi hơn rất nhiều so với trước đõy

1.5 Mụi trường đụng lạnh tinh

Trờn cơ sở nghiờn cứu về sinh lý, sinh húa, khả năng sống của tinh trựng trong mụi trường bờn ngoài cơ thể sống, khả năng chịu sốc lạnh với chất bảo quản lạnh, cỏc nha khoa học trờn thế giới đó nghiờn cứu và đưa ra những hoá chất cơ bản để thiết lập môi trường đông lạnh tinh dịch: chất cung cấp năng lượng (đường Saccharid), chất đệm (trihydroxymethylaminomethane), lòng đỏ trứng, chất chống

đại sẽ tạo ra những bước nhảy vọt về năng suất, chất lượng giống cây trồng, vật nuôi Nó không những tạo ra các giống năng suất cao, chất lượng tốt mà còn thích nghi với điều kiện môi trường sinh thái khác nhau Cấy truyền phụi và những kỹ thuật liờn quan là cụng nghệ sinh học sinh sản hiện đại được rất nhiều nhà khoa học trờn thế giới quan tõm nghiờn cứu và ứng dụng trong chăn nuụi Từ sau thớ nghiệm của Heape (1890) về cấy truyền phụi trờn thỏ được cụng bố, nghiờn cứu cấy truyền phụi trờn gia sỳc như dờ, cừu, lợn, trõu, bũ đó được nghiờn cứu ứng dụng thành cụng ở nhiều nước

Cấy truyền phôi động vật có vú thành công đầu tiên được coi là của Walter Heap Năm 1890, Heap đã cấy chuyển phôi thỏ Angora 4 tế bào vào thỏ cái Bỉ đã được phối giống, kết quả đã sinh ra 4 thỏ Bỉ và 2 thỏ con Angora Trong giai đoạn này, những hiểu biết rõ hơn về mối liên hệ giữa tuyến yên và buồng trứng đã đưa đến những tiến bộ đáng kể trong công nghệ sinh sản Sự phát triển của các kỹ thuật gây rụng trứng nhiều (GRTN), gây động dục đồng pha và thụ tinh nhân tạo (TTNT) đã đưa đến thành công về CTP trong những năm 1930

và 1940 ở một số loài, nhưng chưa thành công ở loài bò Mặc dù Umbaugh (1949) cũng đã báo cáo 4 trường hợp có chửa ở Texas từ cấy truyền phôi bò năm

1949, nhưng tất cả con nhận phôi đã sẩy thai trước khi đẻ Năm 1951, con bê đầu tiên do CTP đã sinh ra sau khi cấy bằng phẫu thuật phôi bò 5 ngày tuổi được lấy

từ bò giết ở lò mổ

Công nghệ cấy truyền phôi (CTP) phát triển nhanh chóng cuối những năm

1970, bao gồm cả số lượng kỹ thuật viên và số bò cho phôi Tuy nhiên, đầu những năm 1980 do chưa nghiờn cứu về đông lạnh và giải đông phôi, số phụi thu được nhiều, số bũ động dục đồng pha ớt, số phụi cấy khụng hết sẽ lóng phớ, vỡ vậy đã phải duy trì một số lượng lớn bò nhận phôi để tất cả phôi ở ngày thu phôi

sẽ được cấy cho bò nhận phôi Sau khi triển khai có hiệu quả các phương pháp

đông lạnh phôi, sử dụng dimethyl sulfoside hay glycerol làm chất bảo vệ lạnh, CTP trở thành một công nghệ hiệu quả hơn, mà không còn phụ thuộc vào số bò nhận phôi nữa Thành công đầu tiên của việc đông lạnh phôi động vật có vú được báo cáo ở chuột (Whittingham 1971) Năm 1973, con bê đầu tiên ra đời bằng phôi đông lạnh - giải đông (Wilmut và Rowson) Từ đó đến nay, đã có nhiều tác giả nghiên cứu cải tiến các phương pháp đông lạnh truyền thống (Renard và cs 1982; Lehn-Jensen, 1983; Franks và cs 1986; Prather và cs 1987; Renard và cs 1984; Nguyen và cs 2000)

Những tiến bộ gần đây trong đông lạnh tế bào trứng và phôi động vật có vú

đã đạt được bằng phương pháp đông lạnh thể thuỷ tinh (vitrification) Phương pháp đông lạnh thể thuỷ tinh lần đầu được Rall và Fahy (1985) đề xuất Sau đó phương pháp này luụn luụn được nghiờn cứu cải tiến của nhiều tác giả để nâng cao tỷ lệ sống của phôi động vật có vú đông lạnh (Pugh và cs 2000, Kasai 2002, Atabay và cs 2004, Diez và cs 2005)

Từ những năm 1970 đến những năm 1990 có rất ít báo cáo về bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục hay tiền nhân (chỉ có một báo cáo của Schellander và cs 1988 về thụ tinh ống nghiệm những tế bào trứng bò được bảo quản lạnh) Gần đây, đã có nhiều báo cáo về sự thành công của bảo quản lạnh tế bào trứng của một số động vật có vú như ở chuột (Hotamisligil và cs 1996; Men

và cs 1997), ở bò (Schellamder và cs 1994) và ở người (Quinn và cs 1996) Hầu hết các tác giả trên đều sử dụng chất bảo vệ lạnh là glycerol, ethylene glycol, propylene glycol Các phương pháp đông lạnh thường được áp dụng phổ biến là

đông lạnh chậm 3 bước, một bước trên máy đông lạnh đã được lập trình sẵn, phương pháp đông lạnh không cần máy đông lạnh gồm có phương pháp đông lạnh thuỷ tinh thể (vitrification), phương pháp đông lạnh vi giọt (microdrop) (Kasai M 2002; Papis và cs 2000; Lazar và cs 2000)

Những nghiên cứu về môi trường đông lạnh tinh dịch bò sữa được tiến hành từ 1917 do các tác giả người Nga I Ivanov V.K Milovanov (1934) là những người đầu tiên đưa ra cơ sở khoa học và thực nghiệm về pha loãng và bảo tồn tinh dịch với dung dịch điện giải (NaCl, KCl ) Phillips (1940), Salisbury (1943) cải tiến môi trường pha loãng và bảo tồn với lòng đỏ trứng gà, Na-Citrate

Từ đó các nghiên cứu về môi trường đông lạnh tinh dịch bò sữa phát triển không ngừng và xuất hiện những công ty khổng lồ, xuyên quốc gia tham gia vừa nghiên cứu vừa áp dụng những tiến bộ khoa học vào sản xuất như: Hãng Minitub của Cộng hoà liên bang Đức, Hãng IVM của Cộng hoà Pháp Năm 1974 hãng Minitub sáng chế ra môi trường đông lạnh tinh dịch Triladil dạng dung dịch đóng gói sẵn Năm 1992 sáng chế ra môi trường Biladil và hiện nay là AndroMed Hãng IMV sáng chế ra Bio xcell-CSSđ vv

Về thành phần hoá học của môi trường đông lạnh tinh dịch mỗi công ty đều

có bản quyền riêng về thành phần, công thức pha chế phù hợp với điều kiện của họ

và họ liên tục cải tiến nhằm càng ngày càng có những môi trường đông lạnh tinh dịch bò sữa hoàn thiện hơn Tuy vậy những hoá chất cơ bản để thiết lập môi trường

đông lạnh tinh dịch trên thế giới thường có: chất cung cấp năng lượng (đường sacharid), chất đệm (trihydroxymethylaminomethane), lòng đỏ trứng, chất chống

đóng băng (cryoprotectant) như glycerol

Trên thế giới, thụ tinh ống nghiệm ở gia súc đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ trước và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm

1959, em bé thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1978 ở Anh và con bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1981 tại Mỹ Năm 1999, số phôi tạo ra trong ống nghiệm đã đạt tới con số 31.000 Khoảng 10.000 phôi thụ tinh ống nghiệm sử dụng tế bào trứng nuôi chín trong ống nghiệm từ bò đen Nhật Bản giết thịt được cấy và 2600 bê được sinh trong năm 2001 để làm bò vỗ béo giết thịt

Đến năm 2003, đã có 106.220 ca cấy phôi tạo ra trong ống nghiệm (Thiber 2004)

Ở giai đoạn đầu của kỹ thuật tạo phôi trong ống nghiệm, nguồn tế bào trứng là buồng trứng lấy ở lò mổ Giờ đây, tế bào trứng của những con cho có giá trị được lấy thường xuyên hơn từ gia súc sống bằng việc thu tế bào trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm qua âm đạo (OPU) Kỹ thuật thu tế bào trứng bằng việc

đưa kim vào buồng trứng qua âm đạo nhờ hướng dẫn của hệ thống siêu âm đã

được một số tác giả nghiên cứu (Pieters và cs 1988; Irvine và cs 1993; Walton

và cs 1993; Kruip và cs 1994; Stubbings và cs 1995; Konishi và cs 1996; Guyader và cs 1999; Hwang và cs 1997; Goodhand và cs 1999; Goodhand và

cs 1999; Goodhand và cs 2000; Galli và cs 2001; Reis và cs 2002; Henrique và

cs 2004; De Roover và cs 2005; Rizos và cs 2005)

Đối với sản xuất phụi bũ thịt, theo Arlotto và cs ( 2001), nghiờn cứu ứng dụng TTON nhằm phỏt triển hệ thống sản xuất phụi bũ thịt ở quy mụ lớn ngày càng được chỳ ý phỏt triển Kĩ thuật kết hợp tiền kớch thớch buồng trứng bằng Gonadotropin với thu trứng bằng siờu õm (ovum pick-up) và TTON cũng đó cho kết quả khả quan để sản xuõt phụi bũ thịt và phụi lai cỏc giồng thịt-sữa, với tỉ lệ thu trứng đạt 55 - 81% , tỉ lệ phụi nang đạt 30% (Armstrong vcs, 1994; Rover vcs, 2008) Thớ nghiệm so sỏnh hiệu quản TTON giữa cỏc giống bũ sữa Holstein Friesian , bũ thịt Belgian Blue beef của một số tỏc giả cho thấy tỉ lệ phụi bũ thịt phỏt triển thành phụi nang cú thể cao hơn so với phụi bũ sữa ( 17% sv 4%) (Leroy vcs, 2005) Kết quả tương tự cũng được thụng bỏo trong trường hợp phụi TTON với tinh của giống bũ đen (Japanese Black) với trứng bũ sữa so với phụi

bũ sữa thuần (27% so với 20%; Boediono, 2003)

Thực tế phỏt triển hệ thống nhõn giống bũ bằng cụng nghệ sinh sản và di truyền trờn thế giới trong những năm gần đõy cho thấy với cỏc tiến bộ, thành

cụng mới về chế độ và mụi trường nuụi thành thục trứng, nuụi phụi in vitro, ỏp dụng cỏc kĩ thuật siờu õm khai thỏc trứng, cụng nghệ sản xuất phụi bằng thụ tỡnh ống nghiệm, cụng nghệ đụng lạnh tinh, phụi đụng và cấy truyền phụi đang thể hiện vai trũ trung tõm; ngoài việc nõng cao hiệu quả cụng tỏc chọn lọc nhõn giống, cỏc cụng nghệ này gúp phần cải tiến tỡnh trạng mang thai và sinh sản của

bũ thụng qua việc ứng dụng liờn hoàn cỏc phương thức quản lý và kĩ thuật khỏc (Arlotto vcs, 2001; Hansnen vcs, 2006)

2.2 Nghiờn c u trong n c

Ở Việt Nam, năm 1978 đã có một số tác giả tại Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia bắt đầu nghiên cứu cấy truyền phôi trên thỏ, những con thỏ đầu tiên ra đời bằng công nghệ cấy truyền phôi vào năm 1979 (Bùi Xuân Nguyên và Nguyễn Thị Ước) Từ năm 1980, các tác này cũng đã bắt đầu nghiên cứu cấy truyền phôi trên bò Từ năm 1989, tại Viện Chăn nuôi, Bộ môn Cấy truyền phôi đã được thành lập Từ đó đến nay, cấy truyền phôi đã được nhà nước

hỗ trợ kinh phí bằng các đề tài 470-10-107 (1981-1985), 520-01013 1990), KC-08-16 (1991-1995), với sự chủ trì của Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa Học Việt Nam và sự tham gia của Trường ĐH Nông nghiệp I, Viện Quân Y 103, Viện Chăn nuôi và một số cơ quan khác Đề tài KC-04-11 giai đoạn 2001-2004 đã được thực hiện với sự chủ trì của Viện Chăn nuôi và sự tham gia của trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, ĐH Thái Nguyên, Trung tâm công nghệ phôi - Viện Quân Y và nhiều cơ quan khác Năm 1986, con bê đầu tiên ở nước ta cũng được ra đời từ công nghệ này Năm 1994, bò sinh đôi trong đó có một bê do trứng rụng tự nhiên trong chu

(1986-kỳ động dục và một bê do cấy truyền phôi Đây là trường hợp bê đầu tiên sinh ra

ở nước ta do cán bộ Viện Chăn nuôi quốc gia thực hiện cấy truyền phôi Ngày 3/3/2002, cặp bê cái sinh đôi từ một phôi cắt thành 2 phôi đã ra đời Đây là thành

công đầu tiên ở Việt Nam về công nghệ cloning từ tế bào phôi Ngày 14/1/2004, con bê đầu tiên từ phôi thụ tinh ống nghiệm do cán bộ nghiên cứu Viện Chăn nuôi quốc gia thực hiện đã sinh ra Trong những năm qua công nghệ phôi đã đạt

được một số kết quả sau: Số phôi thu được đạt 3,6 phôi/bò/lần thu phôi và 15 phôi/bò/năm; tỷ lệ động dục đạt 59,43%, tỷ lệ có chửa đạt 38% và tỷ lệ đẻ đạt 25,32% Những kết quả trên đây chứng tỏ rằng chúng ta đã tiếp cận thành công Công nghệ sinh học sinh sản của động vật

Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được nghiên cứu từ năm

nước bộ phận ở nhiệt độ hiện trường trên phôi bò đã thành công (Bùi Xuân Nguyên và cs 1984) Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs nghiên cứu tỷ lệ sống của phôi đông lạnh-giải đông đạt 73,24% và đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò bằng glycerol Năm 1990, bê Charolais

đầu tiên được sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu Đến nay đã có hàng trăm bê hướng sữa được sinh ra do cấy phôi đông lạnh trong nước cũng như phôi đông lạnh nhập khẩu

Thụ tinh ống nghiệm (TTON) tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ đã

được nghiên cứu từ năm 1994, con bê thụ tinh ống nghiệm sinh ra tại Viện Công nghệ sinh học và 8 bê thụ tinh ống nghiệm sinh ra tại Việt Nam (Bùi Xuân Nguyên và cs 1994, 1997; Nguyễn Thị Ước và cs 1996, 1999, 2003; Nguyễn Hữu Đức và cs 1996, 2003, 2005; Nguyễn Văn Lý và cs 2003, 2004, 2005, 2006) Tỷ lệ thụ tinh đạt 54,14% và tỷ lệ tạo phôi trong ống nghiệm đạt 30,78% Nghiên cứu hàm lượng P4 bằng kỹ thuật EIA Bước đầu đã xác định được động thái P4 ở bò sinh sản bình thường, bò chậm sinh và chẩn đoán có thai sớm sau 21 - 23 phối giống (Phan Văn Kiểm và cs năm 2001 – 2005)

Từ năm 2005, tại Viện Chăn nuôi bắt đầu nghiên cứu ứng dụng siêu âm hút tế bào trứng từ bò sữa và tạo phôi trong ống nghiệm Bước đầu đã thu được

một số kết quả đáng khích lệ với 4 tế bào trứng thu được/lần siêu âm từ một bò cái

Ở Việt Nam, nghiên cứu về đông lạnh tế bào trứng bò chưa cú nhiều bỏo cỏo, nghiên cứu về môi trường đông lạnh tinh dịch bò sữa từ trước đến nay chúng

ta chủ yếu áp dụng các môi trường có sẵn nhập ngoại hoặc theo các công thức đã

có để sản xuất tinh viên hay tinh cọng rạ bò sữa, bò thịt

Từ những năm 1998 trở về trước, Trung tâm đông lạnh Moncada chủ yếu sản xuất tinh đông lạnh dạng viên bằng môi trường đông lạnh theo quy trình và hoá chất do Cuba cung cấp Sau giải đông sức hoạt động của tinh trùng thường

đạt 30% Từ năm 1998, nhờ những tiến bộ kỹ thuật và do nhu cầu của sản xuất, Trung tâm đông lạnh Moncada đã chuyển sang sản xuất tinh đông lạnh dạng cọng bằng môi trường đông lạnh tinh bò nhập từ hãng Minitub của Đức là Triladil Từ năm 2001 đến nay, với sự giúp đỡ của tổ chức JICA Nhật bản, Trung tâm đông lạnh Moncada đã tự phối chế được môi trường đông lạnh tinh trùng theo công thức của Nhật Bản LIAJ1 Sau đông lạnh-giải đông, sức hoạt động của tinh trùng đạt 40% và tỷ lệ loại thải giảm từ 34% năm 2001 xuống 1,84% năm

2005 Tuy nhiên, gần đây tại Nhật Bản đã áp dụng hai loại môi trường đông lạnh tinh trùng mới là LIAJ2 và LIAJ3 ưu điểm của 2 loại môi trường này là giá thành đã giảm được 2/3 do không sử dụng những loại hoá chất đắt tiền

Trong cụng nghệ phụi, cụng nghệ tinh bũ từ năm 2005 hầu như chưa cú một cải tiến nào đỏng kể về quy trỡnh sản xuất phụi invivo và phụi invitro, đụng lạnh phụi, mụi trường sản xuất tinh đụng lạnh trờn bũ sữa Với mức độ thành cụng trước đõy sản xuất phụi invivo với số lượng phụi trung bỡnh thu được từ một bũ cho phụi chỉ dao động từ 2,4-3,6 phụi/lần thu phụi/ bũ, mặt khỏc phải để cho bũ nghỉ 2-3 thỏng rồi mới tiếp tục gõy rụng trứng nhiều lặp lại, như vậy một năm chỉ tiến hành thu phụi 3-4 lần / bũ và số phụi thu được bỡnh quõn/bũ/năm chỉ đạt 15

phụi Để khai thỏc được tiềm năng sinh sản của bũ cỏi chỳng tụi nghiờn cứu cải tiến quy trỡnh gõy rụng trứng nhiều lập lại trờn bũ sữa với để nõng cao được số phụi thu được/bũ/năm

Trước đây nghiên cứu về tạo phôi trong ống nghiệm bằng nguồn trứng lấy

ở lò mổ mục đích hoàn thành về phương pháp, nhưng chưa có ý nghĩa trong sản xuất, vì chưa tạo được nguồn phôi từ những giống tốt, giống cao sản, với nội dung nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất phôi trong ống nghiệm một cỏch hoàn chỉnh, bằng nguồn trứng lấy siêu âm trên bò sồng để tạo được nguồn phôi

từ bò năng xuất cao có ý nghĩa kinh tế và ý nghĩa khoa học

Để nõng cao tỷ lệ cú chửa trong cụng nghệ cấy truyền phôi, việc gõy động dục đồng pha cho bũ nhõn phụi là một trong những khõu kỹ thuật quan trọng đó

và đang được cỏc nhà nghiờn cứu quan tõm Cựng với kỹ thuật định lượng hormone Progesterone (P4) để chẩn đoỏn cú chửa sớm ở bũ nhận phụi đó gúp phần xỏc định kết quả cú thai sớm ở bũ sau 21 ngày là những chỉ số tin cậy để chẩn đoỏn sớm cú chửa ở bũ nhõn phụi

Mục đích của gây động dục đồng pha (GĐDĐP) là tạo ra được nhiều bò nhận phụi động dục cựng thời gian động dục với bò cho phôi (nếu cấy phôi tươi) hoặc phù hợp với tuổi của phôi (nếu cấy phôi đông lạnh) Trong công nghệ cấy truyền phôi, kỹ thuật GĐDĐP giữa cái cho phôi và cái nhận phôi là vô cùng quan trọng Kỹ thuật gây đồng pha càng tốt, hiệu quả cấy truyền phôi càng cao

Cải tiến quy trình đông lạnh phôi và quy trình sản xuất tinh đông lạnh sẽ nâng cao được tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh, giải đông và chủ động được môi trường sản xuất tinh đông lạnh góp phần nâng cao được hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bò sữa

Vì vậy chỳng tụi tiến hành đề tài :“ Nghiờn cứu cải tiến tổ hợp cụng nghệ sinh sản phục vụ cụng tỏc tạo và nhõn giống bũ”

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

N i dung 1: Nghiên c u c i ti n công ngh phôi bò s a

1.1 Nghiên cứu cải tiến công nghệ sản xuất phôi in vivo

1.2 Nghiên cứu cải tiến công nghệ sản xuất phôi in vitro

1.3 Nghiên cứu cải tiến gây động dục đồng pha cho bò nhận phôi

N i dung 2: Nghiên cúu c i ti n công ngh ông l nh phôi bò s a

2.1 Nghiên cứu cải tiến công nghệ đông lạnh phôi in vivo, phôi in vitro

2.2 Bước đầu thử nghiệm đông lạnh trứng bò

N i dung 3: Nghiên c u môi tr ng s n xu t tinh bò s a ông l nh d ng

c ng r

3.1 Nghiên cứu thử nghiệm 3 loại môi trường pha loãng đông lạnh tinh cọng rạ LIAJ 1, LIAJ 2 và LIAJ 3 và sản xuất thử nghiệm tinh đông lạnh dạng cọng rạ 3.2 So sánh thành phần hóa học và giá thành của 3 loại môi trường LIAJ1, LIAJ2 và LIAJ 3

N i dung 4: Công ngh phôi bò th t

4.1 Thử nghiệm sản xuất phôi bò thịt bằng tổ hợp công nghệ thụ tinh ống nghiệm và các công nghệ hộ trợ sinh sản liên quan

4.2 Đông lạnh phôi, nghiên cứu khả năng tạo ngân hàng phôi bò thịt thích hợp nhu cầu nhân giống lâu dài

4.3 Nghiên cứu tổ chức cấy phôi

II PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.1 Nội dung 1: NGHIấN CỨU CẢI TIẾN CễNG NGHỆ PHễI Bề SỮA

2.1.1 Cải tiến cụng nghệ sản xuất phụi in vivo

* Nõng cao khả năng tạo phụi invivo ở bũ sữa bằng kỹ thuật gõy rụng trứng nhiều và thu phụi lặp lại

i) Rỳt ngắn gõy rụng trứng nhiều (GRTN)và thu phụi lặp lại từ 2-3 thỏng xuống 35 ngày/lần/bũ

- Chọn bò cho phôi

lượng >500kg, lứa đẻ từ 2-4, có chu kỳ động dục bình thường, không có khuyết tật về đường sinh dục, đã được tiêm phòng các bệnh truyền nhiễm Tiến hành kiểm tra hoạt động của buồng trứng bằng phương pháp khám qua trực tràng

Tinh dịch phối giống phải lấy từ những đực giống tốt nhất, đặc trưng cho giống về tính trạng mong muốn như: sản lượng sữa, sản lượng thịt, tính trạng cao sản ở đực giống phải được di truyền cho thế hệ sau

- Gõy rụng trứng nhiều cho bũ cho phụi

+ Đặt PRID vào xoang âm đạo Ngày đặt là ngày 0 của quy trình

+ Tiêm FSH từ ngày thứ 10 kể từ khi đặt PRID trong vòng 4 ngày theo liều giảm dần (3 ml; 2,5ml; 2,0ml; 1,5ml lần lượt cho 4 ngày) tiêm bắp FSH cho bò cho phôi vào buổi sáng và buổi chiều với khoảng cách 12 giờ

buổi sỏng)

+ Ngày thứ 13 tiờm 1,5ml FSH( sỏng, chiều)

+ Bò động dục vào ngày thứ 14 sau khi tiêm Thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông

lạnh đã đ−ợc giải đông

phẫu thuật,

+ Đỏnh giỏ chất lượng phôi sau khi thu hoạch

Ngày thứ 7 ứng với giai đoạn phôi dâu và phôi nang Đây là giai đoạn thích hợp cho bảo quản và cấy truyền Những phôi chất l−ợng tốt và phỏt triển đỳng giai đoạn đ−ợc sử dụng trong công nghệ cấy phôi Sau khi thu phôi, tiêm

trình nh− trên lần thứ hai

ii) Gõy rụng trứng nhiều và thu phụi lặp lại với tần suất 28 ngày /lần/bũ

Phương phỏp GRTN trờn bũ tương tự như trờn, nhưng rỳt ngắn với

khoảng cỏch là 28 ngày/lần/bò và lặp lại 8 lần /bò/năm

2.1.2 Cải tiến cụng nghệ sản xuất phụi in vitro bũ sữa

* Tạo phụi bũ sữa từ tế bào trứng thu trờn bũ sống bằng phương phỏp siờu

tần suất khỏc nhau: ỏp suất chõn khụng 60mmHg, 90mmHg, 120mmHg và 150mmHg; tần suất 1 lần/2 tuần, 1 lần/ tuần, 2lần/tuần

Quỏ trỡnh siờu õm hỳt tế bào trứng được thực hiện bằng hệ thống siờu õm,

sử dụng kim 18 G dài 55 cm, mụi trường hỳt tế bào trứng (mDPBS của Sigma)

cú bổ sung 50 iu/ml heparin và 5% huyết thanh bờ và khỏng sinh (100.000iu

penicilin/ml + 100µl streptomycin/ml) duy trì ở nhiệt độ 370C bằng máy ổn nhiệt

cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng

cố định buồng trứng về phía mặt quét của đầu giò, Nhẹ nhàng xoay đưa các nang trứng về vị trí mũi kim, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêu âm và chọc hút dịch nang trứng Trước khi hút dịch nang trứng, hút một ít dung dịch hút trứng để làm trơn hệ thống kim và ống dẫn Sau khi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện Dịch hút được thu vào ống ly

buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcol có đường kính lỗ lọc 20µm, khoảng 10ml dung dịch còn lại được chuyển vào đĩa petri vô trùng có đường kính 90mm để soi tìm, đánh giá, phân loại dưới kính hiển vi soi nổi Những tế bào trướng đủ tiêu chuẩn( loại A,B) được nuôi chín invitrro( Trong ống nghiệm) và thụ tinh để tạo phôi trong ống nghiệm(invitro ferlitization)

Đánh giá, phân loại tế bào trứng và phôi được theo phương pháp của Saito

vµ cs.(1995) và theo kinh nghiệm của Bộ môn Cấy truyền phôi- Viện Chăn nuôi

ii ) Ảnh hưởng của tuổi bò đến số lượng và chất lượng tế bào trứng (TBT ) thu đượcbằng phương pháp siêu âm và tạo phôi trong ống nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên bò sữa F2, F3 có năng suất sữa trên

5000 kg sữa/chu kỳ ở 2 độ tuổi khác nhau (bò 3 tuổi và bò 6 tuổi), khám bộ phận sinh sản, buồng trứng chọn bò có bộ phận sinh sản và buồng trứng tốt để