Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác và nhân giống bò

Header Page of 133 VIN CHN NUễI BO CO TNG KT TI NGHIấN CU CI TIN T HP CễNG NGH SINH SN PHC V CễNG TC V NHN GING Bề CNT : NGUYN TH THOA 8245 H NI 2010 Footer Page of 133 Header Page of 133 LI NểI U Công nghệ Cấy truyền phôi bò đợc nghiên cứu ứng dụng Việt Nam từ năm 1978, nhng từ đến hầu nh cha có cải tiến đáng kể k thut sản xuất phôi in-vivo, phôi in-vitro bò sữa Với kết nghiên cứu trớc đây, số lợng phôi in-vivo trung bình thu đợc từ bò cho phôi dao động từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần thu phôi, mặt khác khoảng cách thu phôi lặp lại sau 60-90 ngy, nh năm tiến hành thu phôi 4-5 lần/bò v s phụi bỡnh quõn/bũ/nm ch t 15 phụi Nghiên cứu cải tiến rút ngắn khoảng cách lần thu phôi từ 60-90 ngy xung 28-35 ngy/bũ/ln tng s phụi thu c t 2,4-3,6 phôi/bò/lần lờn 5,5-5,7 phôi/bò/lần tăng số phôi thu đợc 30- 45 phụi/bũ/nm Nghiờn cu to phụi bũ in-vitro t t bo trng thu lũ m trc õy vi mc ớch nghiờn cu hon thin phng phỏp ch cú ý ngha nghiờn cu khoa hc ý ngha giống sn xut Nghiờn cu tạo phôi in-vitro từ tế bào trứng thu bò sống phơng pháp siêu âm a c quy trỡnh thu t bo trng vi tn xut ln/ tun v ỏp xut chõn khụng 120 mmHg bũ sa 3-6 tui cú th thu c 7-8 t bo trng/bũ/ln v to c ngun phụi in-vitro t nhng bũ sa cú giá trị giống v tim nng di truyn cao Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đợc nghiên cứu từ năm 1984 Viện Khoa học Việt Nam Phơng pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 120C/phút) sau khử nớc phần nhiệt độ phòng với phôi bò thành công (Bùi Xuân Nguyên cs 1984) Năm 2003, Lu Công Khánh cng s báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò glycerol Năm 2005 Nguyễn Thị Thoa cng s nghiên cứu phơng pháp đông lạnh phôi Vitrivication (tạo thuỷ tinh thể) bớc đầu thành công nhng tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh thấp đạt 73,24% Trong nghiên cứu đa đợc quy trình đông lạnh thuỷ tinh thể (vitrification) cải tiến tăng tỷ lệ sống phôi đông lạnh sau giải đông từ 73,24% lên 80% Chúng đa quy trình ci tin với mục tiêu cung cấp xác cỏc bc tin hnh quy trình cho cán nghiên cứu kỹ thuật viên cú th ng dng sn xut phụi in-vitro, phôi in-vitro, đông lạnh phôi trờn bũ sa Việt Nam Footer Page of 133 Header Page of 133 BO CO TNG HP KT QU TI NGHIấN CU CễNG NGH SINH HC 2007-2010 THễNG TIN CHUNG V TI Tờn ti: Nghiờn cu ci tin t hp cụng ngh sinh sn phc v cụng tỏc to v nhõn ging bũ Ch nhim ti: Nguyn Th Thoa Hc v : Thc s in thoi: 0913321521 a ch: Nh s 1, Ngỏch 148, Ph Hong Ngõn- Trung Ho- Cu Giy- H Ni C quan : Vin Chn nuụi a ch : Thu Phng- T Liờm- H Ni S in thoi: 048389971 C quan phi hp: Vin Cụng ngh Sinh hc- Vin Khoa hc Vit Nam Trung tõm Thc nghim v Bo tn vt nuụi- Vin Chn nuụi Trung tõm Nghiờn cu Bũ v ng c Ba Vỡ; H Tõy Trung tõm, Trm tri tnh Thanh Hoỏ, Hi Dng Thi gian thc hin: T nm 2007-2010 Kinh phớ: 2.500.000.000 ng Footer Page of 133 Header Page of 133 PHN I : M U I T VN Chn nuụi nc ta cú vai trũ quan trng i vi nụng nghip v phỏt trin kinh t quc dõn, giỏ tr ngnh chn nuụi hng nm chim t l 30% tng giỏ tr nụng nghip Trong nhng nm va qua chn nuụi ang gúp phn quan trng i vi chuyn i c cu kinh t nụng nghip, tng thu nhp ci thin i sng cho nụng dõn Tc phỏt trin chn nuụi v sn phm chn nuụi hng nm tng bỡnh quõn t 6-8% ỏp ng nhu cu tiờu dựng nc ngy cng cao v sn phm chn nuụi Tng sn lng tht sn xut nm 2009 ca nc ta t trờn 3,7 triu tn tht hi v cú tc tng trng bỡnh quõn nm t trờn 6%/nm a bỡnh quõn sn lng tht trờn u ngi lờn trờn 43kg/ngi/nm Phỏt trin chn nuụi bũ tht, bũ sa v gia sỳc n c c B Nụng nghip v Nh nc cng nh cỏc a phng quan tõm u t v cú chớnh sỏch khuyn khớch phỏt trin t nhng nm cui ca th k trc v u th k XXI Quyt nh s 167 ca Th tng Chớnh ph v mt s bin phỏp v chớnh sỏch phỏt trin bũ sa Vit Nam giai on 2001-2010, ngy 20 thỏng 10 nm 2001 l mt nhng minh chng cho s quan tõm ú Trong thi gian t 2001 n nay, thc hin Chng trỡnh phỏt trin bũ sa theo Quyt nh 167 ca Th tng Chớnh ph, chn nuụi bũ sa Vit nam ó thu c nhiu kt qu tt p, phỏt trin mt cỏch bn vng ỏp ng nhu cu tiờu dựng sa ngy cng cao ca xó hi Tng n bũ sa v sn lng sa ca c nc tng t 40.000 v 64.000 tn nm 2001 lờn 140.000 v 290.000 tn nm 2010 Chn nuụi bũ sa ó thc s mang li hiu qu kinh t v xó hi cao i vi nụng nghip ca Vit Nam thi gian 2001-2010 Footer Page of 133 Header Page of 133 cú c s lng v cht lng bũ sa HF Vit Nam nh hin l kt qu ỏp dng khoa hc k thut v cụng ngh sinh hc li to v nhõn ging bũ sa Vit Nam ca cỏc nh khoa hc sut thi gian hn 50 nm K thut th tinh nhõn to v cụng ngh phụi ú cú k thut ụng lnh tinh, phụi l mt nhng k thut sinh sn quan trng nht ó v ang c ỏp dng ci tin v nhõn ging bũ sa HF Vit Nam i vi bũ tht mc dự ó cú nhiu tin b k thut ỏp dng cụng tỏc lai to v nhõn ging, nhng chn nuụi bũ tht ti Vit Nam cha ỏp ng kp nhu cu tiờu th tht bũ ca th trng nụi a v s lng v cht lng Hu ht cỏc nh hng, khỏch sn v siờu th cao cp phi nhp tht bũ t M, Australia, New Zealand Theo s liu thng kờ nm 2009 sn lng tht trõu, bũ hi ch t 330 ngn tn tht trõu bũ/nm; tng ng mc tiờu th trung bỡnh trờn u ngi cha n 1,5 kg/tht/nm l rt thp so vi mc tiờu th 9-10 kg/nm ti cỏc nc khu vc nh Trung Quc, Nht Bn phỏt trin chn nuụi bũ tht, thnh mt ngnh sn xut hng hoỏ, d ỏn Ci tin v nõng cao cht lng ging bũ tht Vit Nam 2006-2010 v Chin lc phỏt trin chn nuụi n nm 2020 theo Quyt nh s 10/2008/Q-TTg ca Th tng Chớnh ph ngy 16 thỏng nm 2008 ó t mc tiờu tng cng c cu ging bũ lai, bũ tht cht lng cao nhm t tng sn lng tht bũ 310 ngn tn vo nm 2015 v 425 ngn tn nm 2020 t c mc tiờu trờn ca bũ tht v bũ sa, vic ci tin cỏc cụng ngh sinh hc sinh sn, nh ci tin cụng ngh to phụi ng nghim (TTON-in vitro fertilisation) t t bo trng thu trờn bũ sng bng k thut siờu õm, k thut gõy rng trng nhiu (hay gõy siờu bi noón) to phụi in vivo, v mt s k thut liờn quan chỳng ta cú th khai thỏc c ti a tim nng sinh sn ca bũ cỏi cao sn gúp phn tng Footer Page of 133 Header Page of 133 nhanh s lng, cht lng ca n bũ ht nhõn õy l bin phỏp k thut then cht cn c quan tõm u t nghiờn cu Cn c vo mc tiờu v yờu cu cp bỏch v tht sa cho tiờu dựng nc nhng nm va qua, B Nụng nghip v PTNT ó phờ duyt v cho phộp chỳng tụi tin hnh ti: Nghiờn cu ci tin t hp cụng ngh sinh sn phc v cụng tỏc to v nhõn ging bũ II MC TIấU ti ny c xõy dng theo hng s dng t hp cụng ngh sinh hc sinh sn tiờn tin phc v cho vic to v nhõn ging bũ nh:Cụng ngh phụi, cụng ngh ụng lnh t bo sinh sn, nõng cao nng xut sinh sn v cht lng ging bũ mt cỏch nhanh chúng v hiu qu Mc tiờu chớnh ca ti l : Ci tin v ng dng thnh cụng cỏc cụng ngh sinh sn hin i (cụng ngh sn xut phụi invivo, phụi invitrro, cụng ngh ụng lnh tinh, ụng lnh phụi) nõng cao nng sut sinh sn v cht lng ging bũ bũ tht, bũ sa Footer Page of 133 Header Page of 133 PHN II TNG QUAN CC VN CN NGHIấN CU I C S KHOA HC CễNG NGH CY TRUYN PHễI Bề 1.1 Kớch thớch noón bao phỏt trin ng lot bng s tỏc ng hormone Nhiu tỏc gi cho thy rng tim nng sinh sn ca bũ ln hn rt nhiu so vi kh nng sinh sn thc ca chỳng Theo Erickson (1966) cho bit bung trng ca bũ cú trờn 70.000 noón bao nguyờn thu cú th phỏt trin thnh t bo trng th tinh v to phụi Nghiờn cu trờn bũ cú chu k ng dc u Danell(1987) cho bit trung bỡnh s t bo trng 12636 bò không hoạt động có số tế bào trứng 10132, khác không rõ ràng (P>0,05) Nghiên cứu tế bào mô học buồng trứng bò, Hafbigo (1947) công bố bê tháng tuổi có 21000 bò già có 2500 tế bào trứng bũ, mi chu k ch rng trng, nu th tinh ch c mt bờ, mt i bũ cỏi ch sinh c 7-8 bờ nh vy thc t s noón bo c s dng hu ớch l rt ớt, i vi mt i cỏi cao sn tht l lóng phớ Nhiu nghiờn cu cho thy chu kì bò thờng có đến đợt sóng nang phát triển cá biệt có tới đợt Sóng nang phát triển số noãn bao thời gian Nghiên cứu theo dõi v phát triển nang trng trờn buồng trứng bũ sng phong pháp siêu âm đợc nhiều tác giả công bố Đợt bắt đầu diễn sau rụng trứng vào ngày thứ 3-9 chu kì, đợt hai vào ngày 11-17, đợt ba ngày 18-0 Mỗi đợt sóng nang huy động tới 15 nang kích thớc từ 5-7 mm phát triển, sau có nang phát triển mạnh gọi nang trội (nang khống chế) Kích thớc nang khống chế đợt 1, 2, đạt 12-15 mm đỉnh kích thớc nang tơng ứng quan sát thấy vào ngày 6, 13, 21 (Dalin 1987, Monget 1993) Đặc điểm đợt Footer Page of 133 Header Page of 133 phát triển nang phát triển có tính tự điều khiển cạnh tranh nang Mỗi đợt có 1-2 nang trội, vài nang lớn phát triển phát triển nang lại bị kìm hãm Tuy thể vàng tồn tại, nang khống chế nang lớn bị thoái hoá, có đợt cuối thể vàng không nang khống chế phát triển tới chín rụng Đây lí giải thích chu kì động dục bò có trứng chín rụng (cá biệt có trứng) Do đặc điểm đợt phát triển nang đợc gọi sóng nang phát triển Trong đợt sóng nh tồn nang nang khống chế dao động từ 5-6 ngày (Ireland 1987, Fortune cs 1988) Riêng nang khống chế phát triển nhanh sau ngày 18 chu kì, tốc độ phát triển nang khống chế vào thời điểm đạt 1,6mm ngày (Fortune cs.1988, Savio cs 1988) Trờn c s nghiờn cu v quy luật phát triển nang trờn bung trng v hiểu biết hormone điều khiển sinh sản, nhiều cỏc nh khoa hc tạo cho trứng rụng đồng loạt chu kì to đợc nhiu phôi có chất lợng vào điểm đợc xác định kỹ thuật gây rụng trứng nhiu K thut gõy rng trng nhiu ó thu đợc nhiều kết khả quan Gây rụng trứng nhiều (GRTN) lần đầu tiờn c nghiên cứu chuột Engle (1927); bò cừu Col Miller (1933); Parker Hammond (1940) Casida cs (1944) Các phơng pháp GRTN giai đoạn bớc đầu nghiờn cu chủ yếu sở mối tơng quan tuyến yên-buồng trứng phát hocmon ECG estrogen phụ nữ có thai ngựa chửa (Smith Engle: 1927; Zondek Aschheim: 1927) Kết GRTN giai đoạn hạn chế tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi đạt từ 2-10% Nghiên cứu xây dựng phơng pháp GRTN cách hệ thống sở hiểu biết đầy đủ chế điều khiển phát triển nang rụng trứng bắt Footer Page of 133 Header Page of 133 đầu thực từ năm 1970 Trong giai đoạn này, s phát triển công nghệ phôi quy mô lớn đối tợng chăn nuôi quan trọng nh cừu, bò; phơng tiện nghiên cứu đại xác nh miễn dịch phóng xạ, siêu âm đợc áp dụng phổ biến nghiên cứu sinh học sinh sản Những đóng góp quan trọng liên quan đến việc xây dựng phơng pháp GRTN giai đoạn đợc thực sở nghiên cứu quy luật phát triển nang, rụng trứng vai trò thể vàng hoạt động chu kỳ tính buồng trứng Nghiên cứu nhiều tác giả cho thấy rụng trứng xy nang phát triển tới độ chín cần thiết, bao gồm tăng tối đa kích thớc nang xoang chứa dịch nang, chín noãn đợc thể qua tợng tan màng nhân, phân lập cầu cực 1, phân bố thể nhiễm sắc giai đoạn metaphase II (M II) (Thibault 1985, Blerk Van bell, 1986) Điều kiện cần thiết để trình chín rụng trứng xẩy tăng cờng phân tiết LH tuyến yên máu ngoại vi Sự chín rụng trứng xy sau xuất đỉnh LH Quan sát bò cho thấy chu kỳ bình thờng, tan màng nhân xuất khoảng sau đỉnh LH, hình thành nhiễm sắc thể M II xẩy khoảng 17-22 sau đỉnh LH, rụng trứng xy 22 sau đỉnh LH (Dieleman 1993) Vào thời điểm rụng trứng, tăng thể tiếp nhận LH đợc quan sát thấy nang khống chế dẫn tới tăng tổng hợp Progesterone PGF Các hocmon có tác động gây vỡ nang thông qua kích thích hoạt động co trơn nằm lớp màng buồng trứng (Akamura cs 1972; Virutamanen 1972, Chaning cs 1980) tăng tổng hợp enzym gây tan màng nang nh plasmin, hyaluronidaza (Beer 1975; Espey 1974) Những nghiên cứu góp phần đa dẫn vai trò phơng thức sử dụng LH hCG gây rụng trứng nhiều Ngoài ra, Footer Page of 133 Header Page 10 of 133 có nhiều tác giả nghiên cứu phơng pháp sử dụng loại hocmôn khác để GRTN bò cho phôi Theo Elsden cs (1974), gây rụng trứng nhiều PMSG PGF2 bò cho kết tốt Bò đợc tiêm PMSG vào chu kì động dục với liều 1500 2000 UI, sau 48h tiêm liều 1,9mg PGF2 cách 12 h Trong tổng sối 24 bò đợc tiến hành gây rụng trứng nhiều có 18 bò động dục vòng ngày kể từ tiêm PGF2 Trong số có 14 bò động dục vào ngày thứ Bằng phơng pháp phẫu thuật để đánh giá kết cho thấy 24 bò có phản ứng mạnh có số trứng rụng bình quân 13,219, có 20 bò có noãn bao không rụng bình quân 3,3 Thí nghiệm khác 35 bò với liều 2000 UI, PMSG tác dụng vào ngày thứ 16 chu kì động dục, kết có 24 bò phát có phản ứng với PMSG phơng pháp khám lâm sàng qua trực tràng Khi mổ khám có bò số 29 bò không rụng trứng có u nang buồng trứng Trên 17 bò bình quân trứng rụng 8,01,5 có bò noãn bao không rụng Một nghiên cứu đợc tiến hành 10 bò với kết hợp PMSG PGF2 phối giống thời gian động dục Trong tổng số 141 trứng rụng thu đợc 97 phôi (đạt tỉ lệ 69% trứng rụng), có 88% phôi thụ tinh Từ kết thu đợc tác giả có nhận xét kết hợp PMSG với PGF2 cho kết tốt dùng PMSG để gây rụng trứng nhiều bò Boland cs 1978; Chupin Procureur, 1982; Newcomb cs 11976) cho thấy việc sử dụng eCG để GRTN bò thờng kèm theo hạn chế ảnh hởng âm tính lên kết thụ tinh phát triển phôi nh thời điểm xuất động dục không xác, động dục kéo dài Trong trờng hợp tỷ lệ bò có phản ứng rụng trứng cao (89% cú phản ứng), nhng có 44% bò có 5phôi/1 lần, có 25% số phôi đạt tiêu chuẩn tốt Trong thực tiễn khả gây rụng trứng nhiều lặp lại cá thể cho phôi Footer Page 10 of 133 Header Page 114 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 C nh bũ, ly ht phõn, sch âm hộ v sỏt khun bng cn 700 Cho u giũ siờu õm vo trc trng, c nh bung trng v phớa mt quột ca u giũ Nh nhng xoay, m v o kớch thc nang trng cú mt trờn bung trng qua mn hỡnh ca mỏy siờu õm Quỏ trỡnh o, m phải thc hin t m v chớnh xỏc - Siờu õm hỳt t bo trng Vận hành h thng siờu õm hỳt t bo trng, s dng kim cỡ 18G, di 55 cm, mụi trng hỳt t bo trng (mDPBS ca Sigma) cú b sung 50 iu/ml heparin v 5% huyt bờ v khỏng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100àl streptomycin/ml) trỡ nhit 370C bng mỏy n nhit Nh nhng cho u dũ siờu õm cú gn h thng dn kim vo õm o, cho tay qua trc trng c nh bung trng, a cỏc nang trng v v trớ mi kim, quan sỏt cỏc nang trng trờn mn hỡnh mỏy siờu õm v chc hỳt dch nang trng Dch hỳt c thu vo ng ly tõm 50ml v trỡ nhit 370C bng mỏy n nhit Sau hỳt xong, a v phũng thớ nghim, lc bng cc lc Emcol cú ng kớnh l lc 20àm, khong 10ml dung dch cũn li c chuyn vo a petri vụ trựng cú ng kớnh 90mm soi tỡm, ỏnh giỏ, phõn loi t bo trng di kớnh hin vi soi ni T bo trng sau ỏnh giỏ, phõn loi c nuụi chớn mụi trng IVM Nuôi thành thục tế abfo trứng ống nghiệm (IVM) * Chuẩn bị môi trờng - Lấy PBS, TCM 199, kháng sinh từ tủ lạnh để nhiệt độ phòng - Lấy huyết bê từ tủ lạnh sâu cho vào bể ấm 37oC Footer Page 114 of 133 Header Page 115 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 - Khử trùng vị trí thao tác cồn ethanol 70% Pha môi trờng nh sau: - TCM 199 23,75 ml - Huyết bê 1,25 ml - Kháng sinh 25 àl - Bịt miệng ống đong thủy tinh parafin, nghiêng lắc 20 lần - Lọc microfilter vào chai 100 ml - Chuẩn bị đĩa giọt, giọt 100àl 4,5 ml dầu khoáng - Chuẩn bị hai đĩa rửa 2.5ml IVM ml dầu khoáng - Đặt vào tủ ấm trớc dùng * Nuôi thành thục tế bào trứng ống nghiệm - Sau thu tế bào trứng, rửa tế bào trứng lần đĩa rửa Sau chuyển tế bào trứng vào giọt IVM, giọt 20 tế bào đặt vào tủ ấm để nuôi thành thục tế bào trứng vòng 20- 24h CHUN B MễI TRNG RA TRNG, RA TINH TRNG V PHA LONG TINH TRNG Chuẩn bị mụi trng gốc BO Môi trờng BO - Lấy ống đong thủy tinh loại 100ml - Sodium piruvate 0,01375 g - Dung dịch gốc BO A 76ml - Dung dịch gốc BO B 24ml (sục khí CO2) 100 àl - Kháng sinh - Dán miệng ống đong parafin, nghiêng lắc nhẹ 20 lần Dung dịch rửa trứng ( Chai 50 ml) - BO solution Footer Page 115 of 133 10ml Header Page 116 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 - BSA (cristalised) 0,1g (100mg) - Để tan tự nhiên Dung dịch pha long tinh trùng (Chai 50 ml) - Dung dịch BO solution 10ml - BSA (cristalised) 0,2g (200mg) Dung dịch rửa tinh trùng (Bỏ 40 ml dung dịch BO ống, sử dụng 40 ml lại) - Dung dịch BO - Hypotaurinl - Novo Heparin 40ml 0,04364 g 160àl (tủ lạnh) - Dán miệng ống đong parafin, nghiêng lắc nhẹ 20 lần Dùng bơm tiêm loại 50ml để lọc dung dịch microfilter theo thứ tự sau: - Dung dịch rửa tinh trùng vào chai 50 ml - Dung dịch pha loãng tinh trùng vào ống facol 50 ml - Dung dịch rửa trứng vào ống falcon 50ml Sau lọc xong, cất dung dịch rửa pha loãng tinh trùng vào tủ ấm + Chuẩn bị đĩa rửa trứng, đĩa thụ tinh (loại đĩa nunclon) + Lấy 3ml dung dịch rửa trứng cho vào đĩa, không cần phủ dầu khoáng + Lấy àl dung dịch rửa trứng vào đĩa thụ tinh (4 giọt), phủ 4,5 ml dầu khoáng + Cất đĩa vào tủ ấm Xong công việc trên, chờ môi trờng ấm lên bắt đầu công việc xử lý tinh trùng CHUN B GII ễNG TINH TRNG V TH TINH NG NGHIM - pipet loại 10 ml, pipet loại ml pipet loại ml để lên bàn sởi ấm Footer Page 116 of 133 Header Page 117 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 - ống tube falcon 15 ml để bể nớc ấm 37oC - Nớc muối 3%, ống tube thuỷ tinh 15ml, buồng đếm tinh trùng Thoma - Máy li tâm, ống cân bằng, kéo cắt cọng rạ, cồn Tiến hành: - Lấy cọng rạ bình nitơ, để không khí giây thả vào bình nớc ấm giải đông - Lấy cọng rạ khỏi bể nớc ấm, lau khô, lau khử trùng cồn, dùng kéo cắt để rót tinh trùng vào ống tube falcon bình nớc ấm - Lấy ml dung dịch rửa tinh trùng cho vào ống falcon có tinh trùng - Lấy cốc nớc bể nớc ấm cho vào ống li tâm, đặt vào máy ly tâm khởi động máy - Lấy ml nớc muối cho vào ống thuỷ tinh, bỏ bớt 50àl - Chuẩn bị buồng đếm tinh trùng, dán chặt phiến kính vào buồng đếm tinh trùng - Ly tâm xong, bỏ ống tube ra, hút bỏ phần để lại khoảng 0.5 ml phần cuối - Cho ml dung dịch rửa tinh trùng cho vào ống tube trộn - Lấy lại nớc ấm vào ống li tâm, đặt ống tube có tinh trùng vào máy ly tâm khởi động máy - Ly tâm xong lấy ống tube hút bỏ phần trên, để lại khoảng 0.5 ml phía dới Dùng pipet thuỷ tinh 2ml để đo lợng dung dịch thực tế ống tube - Lấy 50 àl dung dịch tinh trùng cho vào ống tube nớc muối, đặt lên votex - Nhỏ hai giọt dung dịch ống tube nớc muối lên buồng đếm Thoma để đếm mật độ tinh trùng (lấy trung bình cộng hai lần đếm) Footer Page 117 of 133 Header Page 118 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 Tính dung dịch cần bổ sung theo công thức sau Mật độ tinh trùng /12.5 * thể tích lúc đầu (trừ 50àl) - V lúc đầu = (A) Bổ sung lợng (A) dung dịch rửa tinh trùng, trộn Lấy (A) + V lúc đầu = (B) Bổ sung lợng (B) dung dịch pha loãng tinh trùng, trộn - Lấy 95àl dung dịch tinh trùng cho vào giọt thụ tinh Rửa tế bào trứng, chuyển vào giọt thụ tinh, đặt tủ ấm để thụ tinh tạo phôi NUễI PHễI INVITRRO (IVC) Chuẩn bị môi trờng nuôi phôI in vitro (IVC) CR1aa - Dung dịch gốc CR1aa A 76 ml - Dung dịch gốc CR1 B ml - BEM essential aa (x50) 0,5 ml (nghiêng lắc trớc lấy) - MEM Nonessential aa (x100) 0,25 ml - L- glutamic acid - Kháng sinh 0,25 ml 25 àl - Lắc bỏ 1,25 ml - Bổ sung Huyết bê 1,25 ml - BSA 0,075g (A7030) - Dán miệng ống đong parafin, chờ tan tự nhiên, nghiêng lắc - Lọc microfilter - Tạo giọt nuôi cấy + 4,5 ml dầu khoáng - Chuẩn bị đĩa rửa 2,5 ml + 2ml dầu khoáng - Cất vào tủ ấm trớc chuyển tế bào trứng vào nuôi cấy Footer Page 118 of 133 10 Header Page 119 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 Tế bào trứng sau thụ tinh, đợc chuyển qua đĩa rửa để tách phần tế bào cumulus Sau rửa đĩa rửa chuyển hợp tử vào giọt nuôi cấy nuôi tủ ấm điều kiện 38,5C, 5%CO2, độ ẩm tối đa thời gian ngày 6: Kiểm tra phát triển phôi Kiểm tra phân chia phôi ngày 2, 4, 6, 7, sau thụ tinh, thu hoch phụi ghi chép lại Iv Sơ đồ Minh hoạ quy trình sản xuất phôi invitro cải tiến Siêu âm thu tế bào trứng TIM TRNG V Nuôi trứng chín invitro Hoạt hoá tinh trùng tạo phôi in vitro Footer Page 119 of 133 11 Header Page 120 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 QUY TRèNH CễNG NGH SN XUT PHễI IN-VIVO CI TIN TRấN Bề SA I Những quy định chung 1.1 nh ngha: Sn xut phụi invivo ci tin trờn bũ sa l quỏ trỡnh rút ngắn khoảng cách tác động hócmon sinh sản để gây rụng trứng nhiều lặp lại (GRTN ) từ 2-3 tháng xuống 28-35 ngày, theo dõi động dục, phối giống cho bò, thu hoạch phôi vào ngày sau phối giống 1.2 Phm vi ỏp dng - Công nghệ phôi Việt Nam nên thực trang trại chăn nuôi lớn trờn ton quc, với mục đích tạo đàn giống hạt nhân, từ thông qua công nghệ nhân nhanh đàn giống sản xuất - Chúng ta ứng dụng công nghệ phôi việc kiểm tra suất sữa đực giống thông qua suất chị em gái, phơng pháp kiểm tra suất phù hợp với nớc phát triển nh Việt Nam chi phí thấp thời gian ngắn so với kiểm tra suất đực giống qua đời sau - Sản xuất phôi nớc thay cho việc phải nhập giống từ nớc ngoài, tránh đợc lây truyền bệnh tật, stress thay đổi khí hậu đột ngột 1.3 Yờu cu k thut ca quy trỡnh S lng v cht lng phụi bũ thu c cao hn so vi cỏc quy trỡnh hin hnh 1.4 Thit b dng c hoỏ cht cn thit cho vic sn xut phụi invivo - CIDR, FSH, PRID, PGF2, Estradiol - Mụi trũng di thu hoch phụi( PBS hoc Ringer lactat b sung CS, mụi trng lu phụi (PBS+ 20% CS) Footer Page 120 of 133 Header Page 121 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 - Dng c t CIDR , PRID - Dng c thu phụi: Catheter, h thng ng dn, lừi thộp, nong t cung, bm tiờm, kim tiờm, bụng, cn, găng tay vô trùng, chai thu tinh trung tớnh 500ml ng dung dch di ra, bn nc m n nhit, giúng giỏ c nh bũ, phu lc phụi vụ trựng, phin lc 0,22àl, đa petri 90, đa petri 30, pipet 10 ml, pipet ml, micropipet, đầu hút phôi thuỷ tinh trung tính, đèn cồn, dao cắt đầu hút thuỷ tinh chuyên dụng II Sơ đồ quy trình sản xuất phôi invivo cải tiến LP K HOCH GY RNG TRNG NHIU CHN Bề CHO PHễI CHUN B S GHI CHẫP CHO MI Bề GRTN CHUN B DNG C V HểC MễN LCH GY RNG TRNG NHIU NGY 0: T CIDR NGY 5: TIấMM OESTRADIOL NGY 10: SNG TIấM FSH + CHIU TIấM FSH NGY 11: SNG TIấM FSH + CHIU TIấM FSH NGY 12: SNG TIấM FSH RT CIDR;CHIU TIấM FSH V PGF2 NGY 13: SNG TIấM FSH , CHIU TIấM FSH NGY 14, NGY 15: PHT HIN NG DC V PHI GING Footer Page 121 of 133 Header Page 122 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 NGY 21: THU PHễI III QUY TRèNH CễNG NGH SN XUT PHễI IN-VIVO CI TIN * Lập kế hoạch gây rụng trứng nhiều (GRTN) Chn bò cho phôi: Bò cho phôi bò lai hớng sữa khỏe mạnh, đợc chọn từ đàn hạt nhân, suất sữa bình quân 4000-6000l/chu kỳ, có chu kỳ sinh dục bình thờng, sinh đẻ bình thờng, dị tật quan sinh dục, cổ tử cung phát triển bình thờng, dễ dàng thao tác dẫn tinh quản, dụng cụ giội rửa thu hoạch phôi, buồng trứng mềm, không mắc bệnh truyền nhiễm, có độ tuổi từ 3-6 năm Chuẩn bị mẫu ghi chép cho bò GRTN Mẫu ghi chép gồm thông tin sau: - Ghi chép tình trạng sinh sản quan sinh dục bò cho phôi (buồng trứng, tử cung phối giống) - Các thông tin GRTN (liều lợng thời gian tiêm FSH PGF2 , ngày động dục ngày phối giống, ngày thu hoạch phôi,) - Thông tin thu hoạch phôi (số hiệu bò, số phôi thu đợc, chất lợng phôi thu đợc) Chuẩn bị dụng cụ hormon, tinh bò đông lạnh cho tạo phôi - Chuẩn bị PRID, CIDR, FGF2 , Estradiol - Dụng cụ đặt PRID, CIDR, dầu nhớt, găng tay, bơm tiêm ml, kim tiêm 18G, Cồn 700, thấm nớc, giấy vệ sinh - Tinh trùng đực giống tốt có chất lựợng: hoạt lực sau ụng lnh, gii ụng 45% Footer Page 122 of 133 Header Page 123 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 Chú ý: - Tất hoocmon phải hạn sử dụng đợc bảo quản quy định nhà sản xuất Các dụng cụ phải đảm bảo vô trùng 4: Lch gây rụng trứng nhiều phối giống cho bò Ngày đặt PRID CIDR (ngày 0) Thời gian tiêm Liều tiêm FSH giảm dần (FSH super-ov) Ngày (đặt PRID CIDR 10 11 12 Sáng ml FSH Chiều ml FSH Sáng 2.5 ml FSH Chiều 2.5 ml FSH Sáng 2ml FSH Rút PRID CIDR Chiều Tiêm 2ml FSH ml PGF2 13 Footer Page 123 of 133 Sáng 1,5 ml FSH Chiều 1,5 ml FSH 14 Chiều Động dục -phối giống 15 Sáng Động dục -phối giống 21 Sáng Thu hoạch phôi Header Page 124 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 Chú ý: Bảo đảm vệ sinh phận sinh dục cái, thao tác nhanh, nhẹ nhàng, phối giống thời điểm, (Bò động dục sau tiêm PGF2 42 - 48 giờ, phối giống tốt 10 24 kể từ chịu đứng yên cho khác nhảy Lần phối tinh thứ chiều ngày thứ 14 lịch trình GRTN) Lần phối tinh thứ vào sáng ngày thứ 15 chơng trình GRTN Thu hoạch phôi Thu hoạch phôi sau phối giống ngày - Chuẩn bị thu hoạch phôi + Chuẩn bị mụi trũng di phụi (PBS hoc Ringer lactat b sung huyết bê kháng sinh, giữ ấm nhiệt độ 37C + Mụi trng lu phụi (PBS+ 20% CS) giữ ấm nhiệt độ 37C + Folley Catheter, h thng ng dn, lừi thộp, nong t cung, bơm tiêm, kim tiờm, bụng , cn, giy chuyờn dng, găng tay vô trùng, chai thu tinh trung tớnh 500ml ng dung dch di ra, bn nc m ổn nhit, giúng giỏ c nh bũ + Cố định bò vào dóng giá, móc bỏ phân, vệ sinh âm hộ, gây tê khấu đuôi novocain (dao động từ 3-10ml tuỳ cá thể), tin hnh khỏm bung trng qua trc trng v m s lng th vng ca bung trng qua ú ỏnh giỏ s trng rng d oỏn s lng phụi thu c - Tiến hành rửa phôi: - Làm ớt Folley catheter dung dịch rửa, đa Folley catheter vào sừng tử cung, bơm khí vào bóng Folley catheter (lợng khí dao động từ 15-20 ml phụ thuộc vào kích cỡ sừng tử cung bò), vị trí bóng khí 1/3 phía dới sừng tử cung, rút lõi sắt ra, nối ống dẫn với Folley catheter, mở khoá ống dẫn cho Footer Page 124 of 133 Header Page 125 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 dung dịch chảy vào đồng thời vuốt nhẹ từ chóp sừng tử cung xuống thân tử cung, hứng dung dịch rửa vào chai - Sau rửa xong sừng tử cung bên này, thay Folley catheter tiếp tục tiến hành rửa sừng tử cung bên với bớc nh Rửa xong hai sừng, thụt rửa tử cung dung dịch sát trùng Lugol, Iodine kháng sinh, sau tiêm 5ml Lutalyse để phá thể vàng - Dung dịch thu đợc đợc a v phũng thớ nghim, tiến hành lọc phôi phễu lọc chuyên dụng soi tìm phôi kính hiển vi soi - Lọc dung dịch rửa phôi + Chuẩn bị dụng cụ lọc môi trờng lu phôi - Phu lc phụi vụ trựng - Môi trờng lu phôi ( PBS 20% CS kháng sinh) - Mng lc Microfinter 0,22àl lc mụi trng lu phụi, - Đa petri 90, a petri 30, kẻ ô vuông dới đĩa để giúp cho việc tìm phôi - Pipet 10 ml, pipet ml, Micropipet, - Đầu hút phôi chuyên dụng, đèn cồn, dao cắt chuyên dụng, bật lửa - Kính hiển vi soi - Ghi số hiệu bò vào thành đĩa đựng phôi + Tiến hành lọc phôi Lắc nhẹ chai dung dịch rửa phôi cho vào phễu lọc giữ lại khoảng 30-40ml dung dịch cho vào đĩa petri 90 (chú ý rửa chất nhầy bám đáy phễu lọc để tránh phôi sót bám dới đáy phễu) + Tìm lu phôi - Chuẩn bị ống hút phôi Đốt ống thuỷ tinh đèn cồn kéo dài dao cắt chuyên dụng để đờng kính ống vừa đủ cho hút phôi - Sau lọc phôi đa đĩa petri 90 lên kính hiển vi soi để tìm phôi Footer Page 125 of 133 Header Page 126 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 - Dùng ống hút phôi chuyển phôi vào môi trờng l phôi( mPBS có chứa 20% CS) Phân loại phôi dới kính hiển vi soi - Phôi loại A: Rất tốt Đúng với giai đoạn phát triển, khối tế bào có hình cầu, tế bào liên kết chặt chẽ, màu sắc đặc trng - Phôi loại B: Tốt Đúng với giai đoạn phát triển, hình thái phôi tơng tự nh loại A (có khoảng dới 10 % tế bào thoái hoá) - Phôi loại C: Trung bình Đúng với giai đoạn phát triển, có số tế bào liên kết không chặt chẽ, có số túi nớc - Loại D: Xấu Kích thớc tế bào không đồng đều, có nhiều phôi bào đẩy ngoài, có nhiều túi nớc xuất có 30-50% tế bào thoái hoá Nhng phụi ỳng giai on phỏt trin v t tiờu chun A, B c s dng cho ụng lnh v cy truyn Riêng phôi loại D sử dụng cho việc cấy phôi tơi mà không dùng cho việc đông lạnh phôi Sau thu hoạch phôi cho bò nghỉ 1-2 tuần ( sau 28-35 ngy k t t CIDR t trc) tiếp tục gây rụng trứng nhiều thu phôi đợt Footer Page 126 of 133 Header Page 127 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 iV Sơ đồ Minh hoạ quy trình sản xuất phôi invivo cải tiến Bò sữa cao sản Đặt CIRD cho bò Kiểm tr bò động duc Thu hoạch phôi Footer Page 127 of 133 Chuẩn bị Hocmon Tiêm Hocmon Phối giống cho bò Soi tìm phôi Header Page 128 of 133 Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 ỏnh giỏ phõn loi phụi Phụi nang loi A Phụi chm phỏt trin Phụi dõu loi A Phụi thoỏi hoỏ Trng khụng th tinh Footer Page 128 of 133 ... NểI U Công nghệ Cấy truyền phôi bò đợc nghiên cứu ứng dụng Việt Nam từ năm 1978, nhng từ đến hầu nh cha có cải tiến đáng kể k thut sản xuất phôi in-vivo, phôi in-vitro bò sữa Với kết nghiên cứu. .. phát triển công nghệ phôi quy mô lớn đối tợng chăn nuôi quan trọng nh cừu, bò; phơng tiện nghiên cứu đại xác nh miễn dịch phóng xạ, siêu âm đợc áp dụng phổ biến nghiên cứu sinh học sinh sản Những... khám có bò số 29 bò không rụng trứng có u nang buồng trứng Trên 17 bò bình quân trứng rụng 8,01,5 có bò noãn bao không rụng Một nghiên cứu đợc tiến hành 10 bò với kết hợp PMSG PGF2 phối giống thời