nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác và nhân giống bò

VIỆN CHĂN NUÔI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN PHỤC VỤ CÔNG TÁC VÀ NHÂN GIỐNG BÒ CNĐT : NGUYỄN THỊ THOA 8245 HÀ NỘI – 2010 LI NểI U Công nghệ Cấy truyền phôi bò đã đợc nghiên cứu ứng dụng ở Việt Nam từ những năm 1978, nhng từ đó đến nay hầu nh cha có một cải tiến đáng kể nào về k thut sản xuất phôi in-vivo, phôi in-vitro ở bò sữa. Với kết quả nghiên cứu trớc đây, số lợng phôi in-vivo trung bình thu đợc từ bò cho phôi dao động từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần thu phôi, mặt khác khoảng cách thu phôi lặp lại sau 60-90 ngy, nh vậy một năm chỉ tiến hành thu phôi 4-5 lần/bò v s phụi bỡnh quõn/bũ/nm ch t 15 phụi. Nghiên cứu cải tiến rút ngắn khoảng cách giữa các lần thu phôi từ 60-90 ngy xung 28-35 ngy/bũ/ln đã tng s phụi thu c t 2,4-3,6 phôi/bò/lần lờn 5,5-5,7 phôi/bò/lần và tăng số phôi thu đợc 30- 45 phụi/bũ/nm. Nghiờn cu to phụi bũ in-vitro t t bo trng thu lũ m trc õy vi mc ớch nghiờn cu hon thin phng phỏp ch cú ý ngha trong nghiờn cu khoa hc và không có ý ngha về giống trong sn xut. Nghiờn cu tạo phôi in-vitro từ tế bào trứng thu trên bò sống bằng phơng pháp siêu âm đã a ra c quy trỡnh thu t bo trng vi tn xut 2 ln/ tun v ỏp xut chõn khụng 120 mmHg bũ sa 3-6 tui cú th thu c 7-8 t bo trng/bũ/ln v to c ngun phụi in-vitro t nh ng bũ sa cú giá trị giống v tim nng di truyn cao. ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã đợc nghiên cứu từ năm 1984 tại Viện Khoa học Việt Nam. Phơng pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12 0 C/phút) sau khi khử nớc một phần ở nhiệt độ phòng với phôi bò đã thành công (Bùi Xuân Nguyên và cs. 1984). Năm 2003, Lu Công Khánh và cng s đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò bằng glycerol. Năm 2005 Nguyễn Thị Thoa và cng s đã nghiên cứu phơng pháp đông lạnh phôi Vitrivication (tạo thuỷ tinh thể) bớc đầu đã thành công nhng tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh còn thấp chỉ đạt 73,24%. Trong nghiên cứu này đã đa ra đợc quy trình đông lạnh thuỷ tinh thể (vitrification) cải tiến đã tăng tỷ lệ sống của phôi đông lạnh sau giải đông từ 73,24% lên 80%. Chúng tôi đa ra các quy trình ci tin với mục tiêu cung cấp chính xác về cỏc bc tin hnh trong quy trình cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên cú th ng dng sn xut phụi in-vitro, phôi in-vitro, đông lạnh phôi trờn bũ sa tại Việt Nam. 1 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2007-2010 THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: “ Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò” Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thoa Học vị : Thạc sĩ . Điện thoại: 0913321521 Địa chỉ: Nhà số 1, Ngách 148, Phố Hoàng Ngân- Trung Hoà- Cầu Giấy- Hà Nội Cơ quan : Viện Chă n nuôi Địa chỉ : Thuỵ Phương- Từ Liêm- Hà Nội Số điện thoại: 048389971 Cơ quan phối hợp: 1. Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học Việt Nam 2. Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi- Viện Chăn nuôi 3. Trung tâm Nghiên cứu Bò và Đồng cỏ Ba Vì; Hà Tây 4. Trung tâm, Trạm trại tỉnh Thanh Hoá, Hải Dương. Thời gian thực hiện: Từ năm 2007-2010. 5. Kinh phí: 2.500.000.000 đồng 2 PHẦN I : MỞ ĐẦU I. ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi ở nước ta có vai trò quan trọng đối với nông nghiệp và phát triển kinh tế quốc dân, giá trị ngành chăn nuôi hàng năm chiếm tỷ lệ 30% tổng giá trị trong nông nghiệp. Trong những năm vừa qua chăn nuôi đang góp phần quan trọng đối với chuyển đổi cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp, tăng thu nhập cải thiện đời sống cho nông dân. Tốc độ phát triển chăn nuôi và sả n phẩm chăn nuôi hàng năm tăng bình quân từ 6-8% đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước ngày càng cao về sản phẩm chăn nuôi. Tổng sản lượng thịt sản xuất năm 2009 của nước ta đạt trên 3,7 triệu tấn thịt hơi và có tốc độ tăng trưởng bình quân năm đạt trên 6%/năm đưa bình quân sản lượng thịt trên đầu người lên trên 43kg/người/năm. Phát triển chăn nuôi bò thịt, bò sữa và gia súc ăn cỏ được Bộ Nông nghiệp và Nhà nước cũng như các địa phương quan tâm đầu tư và có chính sách khuyến khích phát triển từ những năm cuối của thế kỷ trước và đầu thế kỷ XXI. Quyết định số 167 của Thủ tướng Chính phủ về một số biện pháp và chính sách phát triển bò sữa Việt Nam giai đoạn 2001-2010, ngày 20 tháng 10 năm 2001 là một trong những minh chứng cho sự quan tâm đó. Trong thời gian từ 2001 đến nay, thực hiện Chương trình phát triển bò sữa theo Quyết Định 167 của Thủ tướng Chính phủ, chăn nuôi bò sữa Việt nam đã thu được nhiều kết quả tốt đẹp, phát triển một cách bền vững đáp ứng nhu cầu tiêu dùng sữa ngày càng cao của xã hội. Tổng đàn bò sữa và sản lượng sữa của cả nước tăng từ 40.000 con và 64.000 tấn năm 2001 lên 140.000 con và 290.000 tấn năm 2010. Chăn nuôi bò sữ a đã thực sự mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội cao đối với nông nghiệp của Việt Nam trong thời gian 2001-2010. 3 Để có được số lượng và chất lượng bò sữa HF Việt Nam như hiện nay là kết quả áp dụng khoa học kỹ thuật và công nghệ sinh học trong lại tạo và nhân giống bò sữa Việt Nam của các nhà khoa học trong suốt thời gian hơn 50 năm. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo và công nghệ phôi trong đó có kỹ thuật đông lạnh tinh, phôi là một trong những kỹ thuật sinh sản quan trọng nhất đã và đ ang được áp dụng trong cải tiến và nhân giống bò sữa HF Việt Nam. Đối với bò thịt mặc dù đã có nhiều tiến bộ kỹ thuật áp dụng trong công tác lai tạo và nhân giống, nhưng chăn nuôi bò thịt tại Việt Nam vẫn chưa đáp ứng kịp nhu cầu tiêu thụ thịt bò của thị trường nôi địa về số lượng và chất lượng. Hầu hết các nhà hàng, khách sạn và siêu thị cao c ấp vẫn phải nhập thịt bò từ Mỹ, Australia, New Zealand. Theo số liệu thống kê năm 2009 sản lượng thịt trâu, bò hơi chỉ đạt 330 ngàn tấn thịt trâu bò/năm; tương đương mức tiêu thụ trung bình trên đầu người chưa đến 1,5 kg/thịt/năm là rất thấp so với mức tiêu thụ 9-10 kg/năm tại các nước trong khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản. Để phát triển chăn nuôi bò thịt, thành một ngành s ản xuất hàng hoá, dự án Cải tiến và nâng cao chất lượng giống bò thịt Việt Nam 2006-2010 và Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 theo Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 16 tháng 1 năm 2008 đã đặt mục tiêu tăng cường cơ cấu giống bò lai, bò thịt chất lượng cao nhằm đạt tổng sản lượng thịt bò 310 ngàn tấn vào năm 2015 và 425 ngàn tấn năm 2020. Để đạt được mục tiêu trên của bò thịt và bò sữa, việc cải tiến các công nghệ sinh học sinh sản, như cải tiến công nghệ tạo phôi trong ống nghiệm (TTON-in vitro fertilisation) từ tế bào trứng thu trên bò sống bằng kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật gây rụng trứng nhiều (hay gây siêu bài noãn) để tạo phôi in vivo, và một số kỹ thuật liên quan chúng ta có thể khai thác được tối đa tiềm năng sinh sản của bò cái cao sản góp phần tăng 4 nhanh số lượng, chất lượng của đàn bò hạt nhân đây là biện pháp kỹ thuật then chốt cần được quan tâm đầu tư nghiên cứu. Căn cứ vào mục tiêu và yêu cầu cấp bách về thịt sữa cho tiêu dùng trong nước trong những năm vừa qua, Bộ Nông nghiệp và PTNT đã phê duyệt và cho phép chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò” II. MỤC TIÊU Đề tài này được xây dựng theo hướng sử dụng tổ hợp công nghệ sinh học sinh sản tiên tiến phục vụ cho việc tạo và nhân giống bò như:Công nghệ phôi, công nghệ đông lạnh tế bào sinh sản, để nâng cao năng xuất sinh sản và chất lượng giống bò một cách nhanh chóng và hiệu quả. Mục tiêu chính của đề tài là : Cải tiến và ứng dụng thành công các công nghệ sinh sản hiện đại (công nghệ sản xuất phôi invivo, phôi invitrro, công nghệ đông lạnh tinh, đông lạnh phôi…) để nâng cao năng suất sinh sản và chất lượng giống bò bò thịt, bò sữa. 5 PHN II TNG QUAN CC VN CN NGHIấN CU I. C S KHOA HC CễNG NGH CY TRUYN PHễI Bề 1.1. Kớch thớch noón bao phỏt trin ng lot bng s tỏc ng hormone Nhiu tỏc gi cho thy rng tim nng sinh sn ca bũ ln hn rt nhiu so vi kh nng sinh sn thc ca chỳng. Theo Erickson (1966) cho bit bung trng ca bũ cú trờn 70.000 noón bao nguyờn thu cú th phỏt trin thnh t bo trng th tinh v to phụi. Nghiờn cu trờn bũ cú chu k ng d c u Danell(1987) cho bit trung bỡnh s t bo trng là 12636 và ở bò không hoạt động có số tế bào trứng là 10132, sự khác nhau này không rõ ràng (P>0,05). Nghiên cứu về tế bào và mô học buồng trứng bò, Hafbigo (1947) đã công bố rằng bê 3 tháng tuổi có 21000 và ở bò già có 2500 tế bào trứng. bũ, mi chu k ch rng 1 trng, nu th tinh ch c mt bờ, trong mt i bũ cỏi ch sinh c 7-8 bờ nh vy trong thc t s noón bo c s dng hu ớch l rt ớt, i vi mt i con cỏi cao sn tht l lóng phớ. Nhiu nghiờn cu cho thy trong một chu kì ở bò thờng có 2 đến 3 đợt sóng nang phát triển cá biệt có tới 4 đợt. Sóng nang là sự phát triển của một số noãn bao ở cùng một thời gian. Nghiên cứu theo dõi v sự phát triển của nang trng trờn buồng trứng bũ sng bằng phong pháp siêu âm đợc nhiều tác giả công bố. Đợt một bắt đầu diễn ra sau khi rụng trứng vào ngày thứ 3-9 của chu kì, đợt hai vào ngày 11-17, đợt ba là ngày 18-0. Mỗi đợt sóng nang có thể huy động tới 15 nang kích thớc từ 5-7 mm phát triển, sau này có một nang phát triển mạnh hơn gọi là nang trội (nang khống chế). Kích thớc của nang khống chế ở đợt 1, 2, 3 có thể đạt 12-15 mm và các đỉnh kích thớc nang tơng ứng quan sát thấy vào các ngày 6, 13, 21 (Dalin 1987, Monget 1993). Đặc điểm trong các đợt 6 phát triển nang là sự phát triển có tính tự điều khiển và cạnh tranh giữa các nang. Mỗi đợt có 1-2 nang trội, vài nang lớn phát triển và sự phát triển của các nang còn lại bị kìm hãm. Tuy vậy trong khi thể vàng còn tồn tại, nang khống chế và nang lớn sẽ bị thoái hoá, chỉ có đợt cuối cùng khi thể vàng không còn thì nang khống chế mới phát triển tới chín và rụng. Đây là lí do giải thích tại sao mỗi chu kì động dục của bò chỉ có một trứng chín và rụng (cá biệt có 2 trứng). Do đặc điểm này các đợt phát triển nang còn đợc gọi là các sóng nang phát triển. Trong mỗi đợt sóng nh vậy sự tồn tại của các nang không phải nang khống chế dao động từ 5-6 ngày (Ireland 1987, Fortune và cs. 1988). Riêng nang khống chế có thể phát triển nhanh sau ngày 18 của chu kì, tốc độ phát triển của nang khống chế vào thời điểm này có thể đạt 1,6mm một ngày (Fortune và cs.1988, Savio và cs. 1988). Trờn c s nghiờn cu v về quy luật phát triển của nang trờn bung trng v những hiểu biết hormone điều khiển sinh sản, nhiều cỏc nh khoa hc đã tạo cho trứng rụng đồng loạt trong một chu kì và to đợc nhiu phôi có chất lợng vào điểm đợc xác định bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiu. K thut gõy rng trng nhiu ó thu đợc nhiều kết quả khả quan. Gây rụng trứng nhiều (GRTN) lần đầu tiờn c nghiên cứu trên chuột của Engle (1927); trên bò và cừu của Col và Miller (1933); Parker và Hammond (1940) và Casida và cs. (1944). Các phơng pháp GRTN trong giai đoạn này bớc đầu nghiờn cu chủ yếu trên cơ sở về mối tơng quan tuyến yên-buồng trứng và sự phát hiện hocmon ECG và estrogen ở phụ nữ có thai và ngựa chửa (Smith và Engle: 1927; Zondek và Aschheim: 1927). Kết quả GRTN ở giai đoạn này còn rất hạn chế và vì vậy tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi chỉ đạt từ 2-10%. Nghiên cứu xây dựng các phơng pháp GRTN một cách hệ thống và trên cơ sở hiểu biết đầy đủ về cơ chế điều khiển sự phát triển nang và rụng trứng bắt 7 đầu thực hiện từ những năm 1970. Trong giai đoạn này, s phát triển công nghệ phôi ở quy mô lớn đối với các đối tợng chăn nuôi quan trọng nh cừu, bò; các phơng tiện nghiên cứu hiện đại và chính xác nh miễn dịch phóng xạ, siêu âm cũng đã đợc áp dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học sinh sản. Những đóng góp quan trọng liên quan đến việc xây dựng các phơng pháp GRTN trong giai đoạn này đã đợc thực hiện trên cơ sở nghiên cứu quy luật phát triển nang, rụng trứng và vai trò thể vàng trong hoạt động chu kỳ tính buồng trứng. Nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy sự rụng trứng chỉ xy ra ở các nang đã phát triển tới độ chín cần thiết, bao gồm sự tăng tối đa kích thớc nang và xoang chứa dịch nang, và sự chín noãn đợc thể hiện qua các hiện tợng tan màng nhân, phân lập cầu cực 1, và phân bố thể nhiễm sắc ở giai đoạn metaphase II (M II) (Thibault 1985, Blerk Van và bell, 1986). Điều kiện cần thiết để các quá trình chín và rụng trứng xẩy ra là sự tăng cờng phân tiết LH của tuyến yên trong máu ngoại vi. Sự chín và rụng trứng chỉ xy ra sau khi xuất hiện đỉnh LH. Quan sát ở bò cho thấy trong chu kỳ bình thờng, sự tan màng nhân xuất hiện khoảng 5 giờ sau đỉnh LH, sự hình thành nhiễm sắc thể M II xẩy ra khoảng 17-22 giờ sau đỉnh LH, và rụng trứng xy ra 22 giờ sau đỉnh LH (Dieleman 1993). Vào thời điểm sắp rụng trứng, sự tăng các thể tiếp nhận LH đợc quan sát thấy trong các nang khống chế sẽ dẫn tới tăng tổng hợp Progesterone và PGF. Các hocmon này có tác động gây sự vỡ nang thông qua sự kích thích hoạt động co các cơ trơn nằm ở lớp màng ngoài buồng trứng (Akamura và cs. 1972; Virutamanen 1972, Chaning và cs. 1980) hoặc tăng sự tổng hợp các enzym gây tan màng nang nh plasmin, hyaluronidaza (Beer 1975; Espey 1974). Những nghiên cứu này góp phần đa ra các chỉ dẫn về vai trò và phơng thức sử dụng LH hoặc hCG trong gây rụng trứng nhiều. Ngoài ra, đã 8 có rất nhiều tác giả nghiên cứu về các phơng pháp và sử dụng các loại hocmôn khác nhau để GRTN ở bò cho phôi. Theo Elsden và cs. (1974), gây rụng trứng nhiều bằng PMSG và PGF 2 trên bò cho kết quả rất tốt. Bò đợc tiêm PMSG vào giữa chu kì động dục với liều 1500 2000 UI, sau 48h tiêm 2 liều 1,9mg PGF 2 cách nhau 12 h. Trong tổng sối 24 bò đợc tiến hành gây rụng trứng nhiều có 18 bò động dục trong vòng 5 ngày kể từ khi tiêm PGF 2 . Trong số đó có 14 bò động dục vào ngày thứ 2 và 4. Bằng phơng pháp phẫu thuật để đánh giá kết quả cho thấy rằng cả 24 bò đều có phản ứng mạnh và có số trứng rụng bình quân là 13,219, trong đó có 20 bò có noãn bao không rụng bình quân là 3,3. Thí nghiệm khác trên 35 bò với liều 2000 UI, PMSG tác dụng vào ngày thứ 16 của chu kì động dục, kết quả chỉ có 24 bò phát hiện có phản ứng với PMSG bằng phơng pháp khám lâm sàng qua trực tràng . Khi mổ khám có 7 bò trong số 29 bò không rụng trứng và có u nang buồng trứng. Trên 17 bò bình quân trứng rụng là 8,01,5 có 4 bò vẫn còn noãn bao không rụng. Một nghiên cứu nữa đợc tiến hành trên 10 bò với sự kết hợp cả PMSG và PGF 2 đã phối giống trong thời gian động dục. Trong tổng số 141 trứng rụng đã thu đợc 97 phôi (đạt tỉ lệ 69% trứng rụng), trong đó có 88% phôi thụ tinh. Từ những kết quả thu đợc tác giả có nhận xét rằng kết hợp PMSG với PGF 2 cho kết quả tốt hơn khi dùng một mình PMSG để gây rụng trứng nhiều trên bò. Boland và cs. 1978; Chupin và Procureur, 1982; Newcomb và cs. 11976) cho thấy việc sử dụng eCG để GRTN ở bò thờng kèm theo các hạn chế có thể ảnh hởng âm tính lên kết quả thụ tinh và sự phát triển phôi nh thời điểm xuất hiện động dục không chính xác, động dục kéo dài. Trong các trờng hợp này tỷ lệ bò có phản ứng rụng trứng cao (89% cú phản ứng), nhng chỉ có hơn 44% bò có trên 5phôi/1 lần, và chỉ có 25% số phôi đạt tiêu chuẩn tốt. Trong thực tiễn khả năng gây rụng trứng nhiều lặp lại trên cùng một cá thể cho phôi. [...]... kim vào buồng trứng qua âm đạo nhờ hớng dẫn của hệ thống siêu âm đã đợc một số tác giả nghiên cứu (Pieters và cs 1988; Irvine và cs 1993; Walton và cs 1993; Kruip và cs 1994; Stubbings và cs 1995; Konishi và cs 1996; Guyader và cs 1999; Hwang và cs 1997; Goodhand và cs 1999; Goodhand và cs 1999; Goodhand và cs 2000; Galli và cs 2001; Reis và cs 2002; Henrique và cs 2004; De Roover và cs 2005; Rizos và. .. thực hiện đã sinh ra Trong những năm qua công nghệ phôi đã đạt đợc một số kết quả sau: Số phôi thu đợc đạt 3,6 phôi /bò/ lần thu phôi và 15 phôi /bò/ năm; tỷ lệ động dục đạt 59,43%, tỷ lệ có chửa đạt 38% và tỷ lệ đẻ đạt 25,32% Những kết quả trên đây chứng tỏ rằng chúng ta đã tiếp cận thành công Công nghệ sinh học sinh sản của động vật Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã đợc nghiên cứu từ năm 1984... truyền phôi bò Năm 1986, tác giả Kostov và cs đã tiến hành gây rụng trứng nhiều ở bò bằng Synchromate B và Estradiol, PMSG và PGF2 Kết quả bò đã động dục sau tiêm 96h và có 17,6% số bò không động dục Số bò có thể vàng từ 2-4; 5-10; 1115 và trên 15 tơng ứng là 3; 6; 2 và 4 con Sau khi gây rụng trứng nhiều bằng FSH và Estradiol Dieleman và cs (1987) báo cáo kết quả gây rụng trứng nhiều ở bò bằng sử dụng... PMSG, PGF2 và anti-PMSG Bình quân số trứng rụng và noãn bao tơng ứng là 15,72.5 và 15,41,6 cho mỗi bò thí nghiệm Kết quả ở bò thí nghiệm cao gấp 2 lần so với bò đối chứng về số lợng trứng rụng và độ tin cậy (P . Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò II. MỤC TIÊU Đề tài này được xây dựng theo hướng sử dụng tổ hợp công nghệ sinh học sinh sản tiên tiến. VIỆN CHĂN NUÔI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN PHỤC VỤ CÔNG TÁC VÀ NHÂN GIỐNG BÒ CNĐT : NGUYỄN THỊ THOA . 2007-2010 THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: “ Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thoa Học vị : Thạc sĩ