Nghiên cứu phương pháp động học huỳnh quang xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức Ruteni(II) polypiridin

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ THỦY NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỘNG HỌC HUỲNH QUANG XÁC ĐỊNH TYROSIN DỰA TRÊN PHẢN ỨNG VỚI PHỨC RUTENI(II) POLYPIRIDIN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ THỦY NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỘNG HỌC HUỲNH QUANG XÁC ĐỊNH TYROSIN DỰA TRÊN PHẢN ỨNG VỚI PHỨC RUTENI(II) POLYPIRIDIN Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG TS NGUYỄN XUÂN TRƢỜNG Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp Bộ môn Hóa phân tích, Viện kỹ thuật hóa học, trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội học hỏi đƣợc nhiều kiến thức bổ ích Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin trân trọng cám ơn TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng, TS Nguyễn Xuân Trƣờng tận tình hƣớng dẫn hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, Thầy cô Bộ môn Hóa phân tích, trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội quan tâm, giúp đỡ suốt trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô Bộ môn Hoá Phân tích, Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ trình làm luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè bên cạnh động viên để hoàn thành tốt luận văn Hà nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Phạm Thị Thủy Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tyrosin 1.2 Phƣơng pháp phân tích Tyrosin 1.2.1 Phương pháp so màu 1.2.2 Phương pháp quang phổ đo quang 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 1.2.4 Phương pháp phổ huỳnh quang 10 1.3 Tổng quan phƣơng pháp phổ huỳnh quang phân tử 10 1.3.1 Hiện tượng huỳnh quang 10 1.3.2 Sự tạo thành phổ huỳnh quang - chế phát quang 10 1.3.3 Cường độ huỳnh quang 11 1.3.4 Phổ huỳnh quang 12 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tạo thành huỳnh quang 13 1.3.5.1 Ảnh hưởng cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang 13 1.3.5.2 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang 14 1.3.6 Máy quang phổ huỳnh quang 15 1.3.7 Thiết bị đo quang phổ huỳnh quang theo thời gian 17 1.3.8 Ứng dụng quang phổ huỳnh quang 18 1.3.9 Động học trình phát quang 19 1.3.9.1 Xác định thời gian sống trạng thái kích thích 19 1.3.9.2 Xác định số tốc độ trình giải hoạt 20 1.4 Tổng quan phức chất Ruteni(II) polypiridin 22 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 24 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 24 Footer Page of 126 Header Page of 126 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.1.2.1 Nghiên cứu đặc trưng quang phổ phức chất Ruteni(II) polypiridin 24 2.1.2.2 Ảnh hưởng pH tới động học phản ứng quang oxi hóa khử phức [Ru(bpy)3]Cl2 phức Tyrosin 24 2.1.2.3 Ảnh hưởng ion lạ tới động học phản ứng quang oxi hóa khử phức [Ru(bpy)3]Cl2 Tyrosin 25 2.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng lực ion tới động học phản ứng phức chất Ruteni(II) polypiridin amino axit Tyrosin 25 2.1.2.5 Xây dựng quy trình định lượng amino axit Tyrosin dựa phản ứng với phức chất Ruteni(II) polypiridin 27 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 28 2.2.1 Hóa chất 28 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 28 2.4 Thẩm định phƣơng pháp 28 2.5 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu protein phân tích Tyrosine 30 2.6 Sử dụng phƣơng pháp HPLC làm phƣơng pháp đối chiếu 32 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis 34 3.2 Phổ phát xạ phân tử trạng thái dừng 36 3.3 Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian (time-domain) 37 3.4 Ảnh hƣởng pH tới động học phản ứng quang oxi hóa khử phức [Ru(bpy)3]Cl2 phức Tyrosin 38 3.5 Ảnh hƣởng ion lạ tới động học phản ứng quang oxi hóa khử phức [Ru(bpy)3]Cl2 , phức Tyrosin 40 3.6 Ảnh hƣởng lực ion tới động học phản ứng quang oxi hóa khử phức [Ru(bpy)3]Cl2 , Tyrosin 42 3.7 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Tyrosin dựa phản ứng quang oxi hóa khử với phức [Ru(bpy)3]Cl2 phức 44 3.7.1 Độ lặp lại phương pháp 46 3.7.2 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ 48 3.7.3 Khoảng tuyến tính 49 3.7.4 Độ phương pháp 51 3.8 Phân tích Tyrosin mẫu protein 53 3.8.1 Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu protein phân tích Tyrosin 53 Footer Page of 126 Header Page of 126 3.8.2 Kết phân tích Tyrosin mẫu protein 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 61 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lƣợng Tyrosin số mẫu thực tế…………………………………….7 Bảng 1.2 Tổng hợp dẫn xuất xác định axit amin HPLC………………………… Bảng 3.1:Sự phụ thuộc số tốc độ phản ứng phức [Ru(bpy)3]Cl2, Tyrosin vào pH………………………………………….39 Bảng 3.2: Hằng số tốc độ phản ứng quang oxi hóa-khử (kq) phức [Ru(bpy)3]Cl2 Tyrosin I thay đổi…………………………………………………………… 43 Bảng 3.3: Hằng số tốc độ phản ứng quang oxi hóa-khử (kq) phức Tyrosin I thay đổi………………………………………………………….43 Bảng 3.4: Kết xác định độ lặp lại phƣơng pháp dựa phản ứng với phức [Ru(bpy)3]Cl2…… 47 Bảng 3.5: Kết xác định độ lặp lại phƣơng pháp dựa phản ứng với phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 47 Bảng 3.6: Kết xác định LOD LOQ dựa phản ứng với phức [Ru(bpy)2]Cl2…….48 Bảng 3.7: Kết xác định LOD LOQ dựa phản ứng với phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2.49 Bảng 3.8: Kết khảo sát khoảng tuyến tính xác định Tyrosin dựa phản ứng với phức [Ru(bpy)3]Cl2 phức …………………………………….50 Bảng 3.9: Kết xác định độ thu hồi xác định Tyrosin dựa phản ứng với phức [Ru(bpy)3]Cl2…………………………………………………………………….52 Bảng 3.10: Kết xác định độ thu hồi xác định Tyrosin dựa phản ứng với phức …………………………………………………………….52 Bảng 3.11: Kết khảo sát thể tích NaOH dùng để thủy phân mẫu protein………………53 Bảng 3.12: Kết khảo sát nhiệt độ thủy phân mẫu protein………………………………53 Bảng 3.13: Kết khảo sát thời gian thủy phân mẫu protein .54 Bảng 3.14: Kết phân tích Tyrosin mẫu protein theo phƣơng pháp động học huỳnh quang phƣơng pháp đối chiếu HPLC…………………… 54 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 (a) Cấu trúcphân tử Tyrosin; (b) Cấu trúc lập thể Tyroin……… …… Hình 1.2 Một số cấu trúc đồng phân Tyrosin……………………………………………3 Hình 1.3: Sự vận chuyển electron pha sáng trình quang hợp (sơ đồ hình chữ Z ) ……………………………………………………………………………………… Hình 1.4 : Quy trình tổng hợp tyrosin từ prephenate…………………………………………4 Hình 1.5: Quá trình chuyển đổi phenylalanine tyrosin từ chất dẫn xuất sinh học…….5 Hình 1.6: Con đƣờng tổng hợp catecholamines amin não ngƣời……………….6 Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang…………………………………… 16 Hình 1.8 Sơ đồ khối hệ thiết bị quang phổ huỳnh quang phân giải thời gian…………… 17 Hình 1.9 Cấu trúc bát diện phức ……………………………………… 22 Hình 2.1 Thế khử chuẩn Tyrosin theo pH…………………………………………… 24 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu protein phân tích Tyrosin Tryptophan ………… 31 Hình 3.1: (a) Phổ hấp thụ phức [Ru(bpy)3]Cl27.5 M;(b) axit amin Tyrosin (c) hỗn hợp phức [Ru(bpy)3]Cl2+Tyrosin, pH 12……………………………………… 35 Hình 3.2: (a) Phổ hấp thụ phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 7.5 M;(b) axit amin Tyrosin (c) hỗn hợp phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2+Tyrosin, pH 12…………………………… 36 Hình 3.3: Phổ phát xạ phân tử trạng thái dừng (a) phức [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M, pH 12; (b) phức 7.5M, pH12…………………………………… 37 Hình 3.4: Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian (a) phức [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M, pH 7.5 M, pH 12……………………………… 38 12; (b) phức Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc số tốc độ phản ứng phức Tyr vào pH…………………………………………… 39 Hình 3.6: (a) Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian dung dịch phức [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M Ca2+ M; (b) [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M + Tyrosin Ca2+ M; pH 12, I = 0.05M………………………………………….41 M Hình 3.7: (a) Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian dung dịch phức Ca2+ Ca2+ M (b) + Tyrosin M M; pH 12, I = 0.05M…………………………………………….42 Hình 3.8: Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian phức [Ru(bpy)3]Cl2 tăng dần nồng độ Tyrosin……………………………………………………………………… 44 Footer Page of 126 Header Page of 126 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn 0 / -1 phức [Ru(bpy)3]Cl2 [TyrOH]; pH 12, I = 0.05M, kq = 1,10.109M-1s-1 ………………………………………………………………45 Hình 3.10: Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian phức tăng dần nồng độ Tyrosin…………………………………………………………… 45 Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn 0 / -1 phức [TyrOH]; pH 12, I = 0.05M kq = 1.99 109 M-1s-1… …………………………………………………………… 46 Hình 3.12: Đƣờng hồi quy tuyến tính xác định Tyrosin dựa phản ứng với phức phản [Ru(bpy)3]Cl2……………………………………………………………………50 Hình 3.13: Đƣờng hồi quy tuyến tính xác định Tyrosin dựa phản ứng với phức …………………………………………………………….51 Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic axit Axit đêôxy ribônuclêic Bpy 2,2-bipyrydine 2,2’-bipyridin bxbg Bis(o-xylene)bipyridine Bis(o-xylene)bipyridin glycoluril glycoluril Dipyrido[3,2-d:2,3-f] dipyrido[3,2-d:2,3-f] quinoxaline quinoxaline Phe phenylalanine phenylalanin p-tyr para – tyrosine para- tyrosin m- tyr meta – tyrosine meta-Tyrosin o- tyr orthor-tyrosine orthor-tyrosin Tyr Tyrosine Tyrosin Trp Tryptophan Tryptophan UV – Vis Ultraviolet – visible Tử ngoại – khả kiến HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao dpq Chromatography Footer Page 10 of 126 Header Page 23 of 126 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tạo thành huỳnh quang 1.3.5.1 Ảnh hưởng cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang  Cấu tạo phân tử: - Các chất có dây nối đôi liên hợp có khả phát quang Càng nhiều dây nối đôi liên hợp khả phát quang cao Ví dụ: Các chất vô hay chất hydrocacbon no hầu nhƣ không phát quang Các hợp chất thơm có khả phát quang nhiều vòng thơm ngƣng tụ hiệu suất huỳnh quang lớn - Các nhóm chức có khả cho điện tử làm tăng hiệu suất huỳnh quang Ví dụ: -OH, , - Các nhóm chức có khả nhận điện tử làm giảm hiệu suất huỳnh quang Ví dụ: , -COOH, -CHO, - Vị trí nhóm nhân thơm làm tăng làm giảm hiệu suất huỳnh quang Ví dụ: Vị trí para ortho làm tăng không định vị điện tử nhân thơm, làm tăng hiệu suất huỳnh quang Ngƣợc lại vị trí meta làm giảm hiệu suất huỳnh quang - Đồng phân cis làm tăng khả phát quang đồng phân trans làm giảm khả phát quang hợp chất  Độ cứng nhắc phân tử Các chất có cấu tạo cứng nhắc khả phát quang cao ngƣợc lại Ví dụ: Flourene, Flourescein: Phát quang mạnh Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang  Chất tạo dẫn: Có hợp chất bình thƣờng phát quang yếu nhƣng tạo dẫn chất phát quang mạnh Ví dụ: 13 Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 Không phát quang Phát quang mạnh Tetracyclin Tetracyclin + Hydrocortison Hydrocortison + Vitamin B1 Thiocrom Adrenalin Adrenochrom + Barbiturat + ethanol 1.3.5.2 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang  Sự có mặt chất tan khác nhau: Có thể gây tƣợng sau: - Hiệu ứng lọc nội: Các chất khác không phát quang nhƣng lại hấp thụ ánh sáng chất phát quang làm giảm cƣờng độ huỳnh quang - Sự làm tắt hóa học: Các chất khác làm tắt phần hay toàn cƣờng độ phát quang va chạm hay làm biến đổi cấu trúc hóa học chất phát quang Cơ chế: F + h   F + h Trong F chất phân tích có khả phát huỳnh quang ( ) Do va chạm nên: +Q F+ Khi Q đóng vai trò chất làm tắt hóa học (quencher) Ví dụ: Q Quinin môi trƣờng HCl Quinin không phát quang ADN Q Acridin nên xét nghiệm sinh hóa sử dụng Acridin định lƣợng  Nồng độ ion , vai trò pH: - pH có ảnh hƣởng lớn đến cƣờng độ phát quang Một số chất có tính axit yếu hay bazơ yếu cƣờng độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH Ví dụ: Ta có axit AH, nƣớc AH phân ly theo phƣơng trình: 14 Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 AH  + Nếu dạng phát quang AH tăng Nếu dạng phát quang tăng, phản ứng xảy theo chiều nghịch, F F giảm môi trƣờng axit tăng môi trƣờng kiềm  Ảnh hƣởng dung môi: Cƣờng độ phát quang bƣớc sóng cực đại thay đổi theo dung môi tác động khác Ví dụ: - Sự tắt huỳnh quang hóa học dung môi: Quininsulfat phát quang mạnh môi trƣờng , nhƣng không phát quang môi trƣờng HCl - Oxi hòa tan dung môi làm biến đổi hóa học chất phát quang, oxi có ảnh hƣởng đến cƣờng độ phát quang - Độ nhớt làm tăng cƣờng độ phát quang - Độ tinh khiết dung môi: Dung môi có tạp huỳnh quang làm sai lệch kết phép đo  Ảnh hƣởng nhiệt độ: Nhiệt độ tăng làm giảm cƣờng độ phát quang làm tăng tần số va chạm phân tử làm cho tƣợng bất hoạt tăng lên Do máy quang phổ huỳnh quang, đèn nguồn có công suất lớn nên phải có kính cách nhiệt có phận làm mát đèn 1.3.6 Máy quang phổ huỳnh quang Máy quang phổ huỳnh quang có phận nhƣ: nguồn sáng, phận đơn sắc hóa, buồng đo phận phát 15 Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 Nguồn sáng Khe chắn Cách từ nhiễu xạ Đơn sắc kích thích Đơn sắc phát xạ Khe chắn Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang - Nguồn sáng máy quang phổ huỳnh quang có nhiệm vụ tạo xạ kích thích cần thiết Nguồn sáng thƣờng dùng đèn xenon có khả phát xạ khoảng rộng 200 – 800nm nhƣng phổ xạ không đều, tia UV mạnh tia Vis Ngoài ngƣời ta dùng nguồn cảm ứng laser - Bộ đơn sắc hóa gồm phần đơn sắc hóa xạ kích thích đơn sắc hóa xạ huỳnh quang Hai phận đƣợc bố trí trƣớc sau buồng đo - Buồng đo đƣợc bố trí cho phƣơng nguồn sáng phƣơng thu tín hiệu vuông góc với Do cuvet sử dụng phải cuvet có hai mặt suốt vuông góc với hay mặt suốt Để tăng tín hiệu đến phận thu ngƣời ta bố trí thêm gƣơng phía đối diện Nguyên tắc hoạt động: Nguồn sáng phát ánh sáng bƣớc sóng kích thích chất phân tích có mẫu Ánh sáng trƣớc truyền đến mẫu phải qua phận đơn sắc kích thích, cho phép bƣớc sóng định phổ kích thích chất phân tích qua, bƣớc sóng khác bị cản lại Ánh sáng từ đơn sắc kích thích qua mẫu chứa cuvet kích hoạt chất phân tích Sau kích thích, chất phân tích hấp thụ phát ánh sáng bƣớc sóng phát xạ dài bƣớc sóng kích thích Ánh sáng phát xạ qua lọc đơn sắc phát xạ vị trí góc bên phải so với ánh sáng kích thích Bộ đơn sắc phát xạ giảm thiểu tán xạ ánh sáng quét ánh sáng phát xạ trƣớc đến đƣợc phận phát (detector) Bộ phận phát đo ánh sáng phát ra, hiển thị giá trị huỳnh quang tạo 16 Footer Page 26 of 126 Header Page 27 of 126 tín hiệu huỳnh quang chất phân tích Giá trị huỳnh quang tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích mẫu 1.3.7 Thiết bị đo quang phổ huỳnh quang theo thời gian Sơ đồ khối thiết bị quang phổ huỳnh quang theo thời gian time-domain đƣợc biểu diễn nhƣ hình 1.8 Kính lọc sáng Cuvet chứa mẫu Nguồn sáng LED kích thích Bộ sóng Bộ tạo xung Hình 1.8 Sơ đồ khối hệ thiết bị quang phổ huỳnh quang phân giải thời gian (1) Nguồn sáng LED kích thích: Kích thích phổ huỳnh quang chất nghiên cứu (2) Bộ tạo xung – Function generator: Bật ngắt xung để theo dõi cƣờng độ phát xạ huỳnh quang chất nghiên cứu theo thời gian (3) Nguồn cấp cho nguồn sáng LED (4) Cuvet chứa mẫu (5) Kính lọc sáng – long pass filter: Tránh ánh sáng tán xạ ảnh hƣởng tín hiệu phát xạ huỳnh quang (6) PMT - ống nhân quang: Bộ phận thu nhận chuyển đổi tín hiệu quang phát xạ thành tín hiệu điện (7) Nguồn cấp cho PMT (8) Bộ sóng- Oscilloscope: thu tín hiệu phát xạ huỳnh quang theo thời gian 17 Footer Page 27 of 126 Header Page 28 of 126 (9) Máy tính điều khiển: Xử lý số liệu, tính toán kết phân tích 1.3.8 Ứng dụng quang phổ huỳnh quang - Định tính: Có thể dựa vào bƣớc sóng kích thích bƣớc sóng huỳnh quang để định tính hợp chất - Định lƣợng: Do phƣơng pháp huỳnh quang có độ nhạy độ đặc hiệu cao:  Có thể đo cƣờng độ huỳnh quang dùng phƣơng pháp so sánh để định lƣợng hợp chất có khả phát huỳnh quang lớn  Với chất huỳnh quang tác dụng với thuốc thử không huỳnh quang để tạo dẫn chất có huỳnh quang hay dùng thuốc thử có huỳnh quang để đo sử dụng cách xử lý thích hợp - Phân tích động học – động học huỳnh quang: Phản ứng làm tắt huỳnh quang phân tử chất phát quang S* tƣơng tác với phân tử Q nhƣ sau: S* + Q  S + Q Vận tốc phản ứng: vQ = kq[S*][Q] Trong đó, kq số tốc độ phản ứng S* Q Theo Stern-Volmer, kq đƣợc xác định theo phƣơng trình:  ⁄  (1.6) Trong đó:   tƣơng ứng thời gian tồn hay thời gian “sống” (lifetime) chất phát quang S* có tƣơng tác với Q Do đó, giá trị kq đƣợc tính từ hệ số góc đƣờng thẳng biểu diễn mối quan hệ đại lƣợng  ⁄ [Q] 18 Footer Page 28 of 126 Header Page 29 of 126 Ngoài ghi phổ huỳnh quang đƣợc sử dụng phận phát sắc ký lỏng, tính đặc hiệu cao độ nhạy với nguồn sáng laser nên giới hạn phát tới g 1.3.9 Động học trình phát quang Một chất hấp thụ xạ, phân tử đƣợc chuyển từ mức lƣợng lên mức lƣợng khác cao [9] Năng lƣợng mà phân tử đƣợc bổ sung hấp thụ xạ không đƣợc giữ lâu, khoảng (s) Có nhiều cách để phân tử làm biến đổi lƣợng hấp - thụ đó, va chạm phân tử dẫn tới việc phân bố lại lƣợng chúng Do lƣợng dƣ mà phân tử có đƣợc hấp thụ xạ chuyển thành dạng lƣợng khác Vì chất hấp thụ xạ bị nóng lên, từ trạng thái kích thích e trở trạng thái đƣờng phát huỳnh quang lân quang Do nghiên cứu động học trình quang hóa cần biết thời gian sống trạng thái kích thích, hiệu suất lƣợng tử số vận tốc trình Cơ chế phản ứng quang hóa: Tốc độ Quá trình h + S0  S1 (hấp thụ) I S1  h + S0 (phát huỳnh quang) kH[S1] SI  S0 + (nhiệt chuyển dời nội phân tử) ks[S1] SI  T1 + (nhiệt chuyển dời ngoại phân tử) kST[S1] T1  S0 + h (phát lân quang) kL[T1] T1  S0 + (nhiệt chuyển dời chéo) kT[T1] Với I tốc độ (cƣờng độ) hấp thụ photon, [S1] [T1] nồng độ mol/l trạng thái tƣơng ứng 1.3.9.1 Xác định thời gian sống trạng thái kích thích Giả thiết trạng thái kích thích singlet bị giải hoạt đƣờng phát huỳnh quang, nghĩa là: S1 Vậy  , [S1] = [ S0 + h ln 19 Footer Page 29 of 126 (1.7) Header Page 30 of 126 Trong [ nồng độ phân tử bị kích thích thời điểm t=0 Theo định nghĩa, thời gian sống trạng thái kích thích thời gian cần thiết để số phân tử kích thích ban đầu giảm e lần, thay [ /[S1] =e vào 1.7 ta có: = Khi (1.8) thời gian sống trạng thái kích thích bị giải hoạt theo phƣơng thức phát xạ Trong thực tế, bên cạnh phát tia xạ, phân tử bị giải hoạt nhiều con đƣờng phi xạ khác nhƣ chuyển dời nội, chuyển dời chéo, phản ứng hóa học, thời gian sống xác định thực nghiệm bé 0 có giá trị: = (1.9) ∑ Trong ki số tốc độ trình giải hoạt i (bức xạ phi xạ) Nhƣ vậy, thời gian sống trạng thái kích thích đƣợc đặc trƣng nghịch đảo tổng số tốc độ giải hoạt trạng thái Mặt khác, thời gian sống xác định sở phổ hấp thụ theo công thức gần sau:   giây (1.10) Trong đó: m: tần số trung bình vạch hấp thụ (cm-1) m  : hệ số hấp thụ cực đại : Một nửa bề rộng vạch hấp thụ Từ biểu thức 1.10 ta thấy thời gian sống 0 tỉ lệ nghịch với hệ số hấp phụ , có nghĩa phân tử dễ hấp phụ ( lớn) dễ phát xạ (0 bé) 1.3.9.2 Xác định số tốc độ trình giải hoạt Giả thiết trạng thái S0 đƣợc kích thích lên trạng thái singlet S1 Từ S1 trình truyền kích thích lƣỡng phân tử phân tử phát huỳnh quang (hằng 20 Footer Page 30 of 126 Header Page 31 of 126 số tốc độ kH), chuyển dời nội (kS) S0 chuyển dời chéo (kST) trạng thái triplet T1 Sau dó từ T1 phân tử trở trạng thái S0 cách phát lân quang (kL), chuyển dời chéo (kT) Áp dụng nguyên lý riêng độ ổn định cho trạng thái S1 T1 ta có: I = ( kH + kS + kST )[S1] Và: (1.11) kSTS1 = (kL + kT)[T1]  (1.12) [S1] = (1.13) [T1] = (1.14) Hiệu suất lƣợng tử huỳnh quang (H) lân quang (L) tỉ số tốc độ trình tƣơng ứng tốc độ hấp thụ, nghĩa là: H = (1.15) L = (1.16) ( Tỉ số ) (1.17) đƣợc xác định cách so sánh cƣờng độ phổ lân quang huỳnh quang, kL kH đƣợc xác định dựa vào giá trị 0 + Xác định kT kST: Giả thiết tất phân tử bị kích thích, không phát lân quang huỳnh quang đƣờng giải hoạt phi xạ chủ yếu qua trạng thái T1, trƣờng hợp viết: kT  kL* + (1.18) Nếu biết kT, dựa vào biểu thức 1.18 ta tính đƣợc kST Nếu kT