Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học iiTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THANH HỒNG PHÂN LẬ
Trang 1Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học ii
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGUYỄN THỊ THANH HỒNG
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỰ NHIÊN LÊN MEN RƯỢU VANG CHÔM CHÔM JAVA
(Nephelium lappaceum)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG
NĂM 2013
Footer Page 1 of 126
Trang 2Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học iii
TÓM LƯỢC
Với mục đích tạo ra sản phẩm rượu vang chôm chôm Java chất lượng cao từ dòng nấm men thuần chủng và góp phần đa dạng sản phẩm của trái chôm chôm Java, đa dạng sản phẩm rượu vang và tăng thu nhập cho người dân Đề tài: “ Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang chôm chôm Java” được tiến hành Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 39 dòng nấm men từ dịch chôm chôm Java và bước đầu định danh sơ bộ 39 dòng
nấm men phân lập thuộc 03 giống nấm men Saccharomyces, Hanseniaspora
và Pichia Dòng nấm men phân lập từ dịch quả chôm chôm Java lên men tự
nhiên cùng với vỏ và bổ sung đường ở Vĩnh Long (VVĐ3) được tuyển chọn từ
39 dòng nấm men phân lập, thể hiện hoạt lực lên men rượu mạnh nhất biểu hiện qua: thời gian kết thúc cột khí CO2 trong ống Durham sớm nhất (12 giờ), hàm lượng ethanol cao nhất (14,2 % v/v) Rượu vang chôm chôm Java lên men từ nấm men tuyển chọn và dịch phối chế ban đầu: 26oBrix, pH 3,9 và mật
số tế bào nấm men 105 tế bào/mL, lên men ở nhiệt độ 25oC trong 12 ngày cho
độ cồn cao nhất (16,8% v/v) Sản phẩm rượu vang chôm chôm Java có màu sắc đẹp, mùi vị hài hòa đặc trưng cho sản phẩm Kết quả định danh dòng nấm men VVĐ3 bằng phương pháp giải trình tự, cho thấy dòng nấm men ưu việt
tạo ra rượu vang chôm chôm Java tốt nhất tương đồng với loài Saccharomyces
cerevisiae
Từ khóa: chôm chôm Java, lên men, nấm men, phân lập, rượu vang,
Saccharomyces cerevisiae
Đề tài: Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang chôm chôm Java
Footer Page 2 of 126
Trang 3Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học iv
ABSTRACT
In order to obtain the high quality Java rambutan wine product from pure yeast and create variety of Java rambutan and wine products, increase income for farmers producing rambutan Researching on “Isolation and selection of natural yeasts to apply in Java rambutan wine production” was conducted Results are: 39 yeast strains were obtained from rambutan juices at different treatment conditions (natural, sugar, and rambutan shell added fermentation) Based on the preliminary identification of yeasts, 39 isolated
yeast strains are belong to 3 genus of yeast: Saccharomyces, Hanseniaspora
and Pichia As a result, the yeast strain isolated from natural fermented, added
sugar and rambutan’s shell at Vinh Long province (VVD3) having the best fermented activity with good characteristics such as the fastest fermention by Durham test (12 hours) and the highest ethanol content (14.2% v/v) Moreover, results showed that with the optimal fermentation parameters:
26oBrix, pH 3.9 and 105 CFU/mL of yeast cell density inoculated and incubaled at 25oC, 12 days of fermentation, as a result, the ethanol content reached to 16.8% v/v The Java rambutan wine product had good smell and
color Result of the identification of yeast by DNA sequencing, the superior
yeast train VVD3 which produced the best Java rambutan wine belong to
Saccharomyces cerevisiae
Keywords: fermentation, isolation, Java rambutan, Saccharomyces
cerevisiae, wine, yeast
Title: Isolation and selection of natural yeasts to apply for Java rambutan wine production
Footer Page 3 of 126
Trang 4Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học vi
MỤC LỤC
Chấp nhận của Hội đồng i
Lời cảm tạ ii
Tóm lược iii
Abstract iv
Cam kết kết quả v
Mục lục vi
Danh sách bảng ix
Danh sách hình x
Danh mục từ viết tắt xiii
Chương 1: Giới thiệu 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3 Nội dung nghiên cứu 2
Chương 2: Lược khảo tài liệu 3
2.1 Nguồn nguyên liệu chôm chôm 3
2.1.1 Sơ lược nguồn gốc 3
2.1.2 Phân loại 3
2.1.3 Đặc điểm chung 4
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng cây chôm chôm 7
2.1.5 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng 8
2.2 Nấm men 10
2.2.1 Hình dạng và kích thước 10
2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men 11
2.2.3 Sự sinh sản của tế bào nấm men 12
2.2.4 Phân loại nấm men 13
2.2.5 Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men 13
2.2.6 Các hình thức hô hấp của nấm men 16
2.2.7 Các chủng nấm men thường thấy trong lên men rượu vang tự nhiên 17
2.2.8 Vùng gen ITS của nấm men 18
2.3 Phân lập nấm men 19
2.4 Rượu vang quả 21
2.4.1 Tìm hiểu rượu vang quả 21
2.4.2 Thành phần hóa học rượu vang quả 22
2.4.3 Phân loại rượu vang 23
2.4.4 Quá trình sản xuất rượu vang quả 24
2.4.5 Cơ chế quá trình lên men 26
Footer Page 4 of 126
Trang 5Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học vii
2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong lên men rượu vang 28
2.4.7 Những khó khăn và thuận lợi trong sản xuất rượu vang ở Việt Nam 30
2.5 Phản ứng PCR 30
2.5.1 Kỹ thuật PCR 30
2.5.2 Nguyên lý của kỹ thuật PCR 31
2.5.3 Chuẩn bị mẫu DNA 31
2.5.4 Thiết kế mồi 31
2.5.5 Điều kiện phản ứng PCR 32
2.5.6 Chu kỳ nhiệt 33
2.6 Một số đề tài nghiên cứu về rượu vang ở Việt Nam 34
Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 37
3.1 Phương tiện nghiên cứu 37
3.1.1 Địa điểm và thời gian 37
3.1.2 Nguyên liệu 37
3.1.3 Hóa chất và môi trường sử dụng 37
3.1.4 Thiết bị và dụng cụ 38
3.2 Phương pháp 38
3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men tự nhiên từ dịch quả chôm chôm 40 3.2.2 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn các dòng nấm men có hoạt lực lên men rượu cao 42
3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng các nhân tố mật số nấm men, độ Brix, pH ban đầu đến quá trình lên men rượu vang chôm chôm và đánh giá chất lượng sản phẩm rượu vang chôm chôm Java 44
Chương 4: Kết quả thảo luận 47
4.1 Kết quả phân lập nấm men 50
4.1.1 Địa điểm thu mẫu tại Vĩnh Long 50
4.1.2 Địa điểm thu mẫu tại Bến Tre 53
4.1.3 Địa điểm thu mẫu tại Cần Thơ 57
4.1.4 Định danh sơ bộ các dòng nấm men đã phân lập 62
4.2 Khả năng lên men dịch chôm chôm Java của các chủng nấm men vừa phân lập và so sánh với dòng nấm men đối chứng 75
4.2.1 Kết quả chiều cao cột khí CO2 trong ống nghiệm chứa ống Durham 76
4.2.2 Khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập với dòng nấm men đối chứng 77
4.3 Kết quả khảo sát các nhân tố mật số nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên quá trình lên men rượu vang chôm chôm 79
4.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm rượu vang chôm chôm Java 82
4.4.1 Phân tích các chỉ tiêu hóa học trong sản phẩm rượu vang chôm chôm Java 82
Footer Page 5 of 126
Trang 6Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học viii
4.4.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm rượu vamg chôm chôm Java 85
4.5 Định danh dòng nấm men VVĐ3 bằng phương pháp giải trình tự 86
Chương 5: Kết luận và kiến nghị 88
5.1 Kết luận 88
5.2 Đề nghị 88
Tài liệu tham khảo 90
Phụ lục 93
Footer Page 6 of 126
Trang 7Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học ix
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Bảng phân biệt đặc điểm cơ bản của ba loài phụ của Nephelium
lappaceum 4
Bảng 2.2: Đặc tính một số giống chôm chôm đang được quan tâm 7
Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thịt của quả chôm chôm chín 8 Bảng 2.4: Thành phần hóa học của nấm men 14
Bảng 2.5: Các chất khoáng cần thiết cho nấm men 15
Bảng 2.6: Thành phần rượu vang quả Ba Lan 22
Bảng 3.1: Thành phần dung dịch lysis buffer 47
Bảng 3.2: Công thức chạy phản ứng PCR 48
Bảng 4.1: Hình dạng nấm men ở Vĩnh Long, Bến Tre và Cần Thơ 61
Bảng 4.2: Khả năng lên men đường glucose và đường saccharose của 39 dòng nấm men đã phân lập 72
Bảng 4.3: Tổng hợp đặc điểm hình thái và sinh lý của 39 dòng nấm men 74 Bảng 4.4: Chiều cao cột khí CO 2 (cm) của 15 dòng nấm men theo thời gian lên men 77
Bảng 4.5: Độ cồn và độ Brix sau khi lên men của 15 dòng nấm men 78
Bảng 4.6: Độ cồn, độ Brix và pH của rượu chôm chôm Java sau khi lên men80 Bảng 4.7: Kết quả các chỉ tiêu phân tích sản phẩm theo TCVN 7045:2009 82
Bảng 4.8: So sánh các chỉ tiêu phân tích của sản phẩm rượu vang chôm chôm Java và rượu vang nhãn 84
Bảng 4.9: Kết quả đánh giá cảm quan rượu vang chôm chôm Java 85
Bảng 4.10: Kết quả giải trình tự ITS - rDNA (ITS1 - 5.8S rDNA - ITS2) của dòng VVĐ3 86
Footer Page 7 of 126
Trang 8Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Hoa chôm chôm 4
Hình 2.2:Sự phát triển trọng lượng trái chôm chôm Java 24 năm tuổi tại huyện Phong Điền TP Cần Thơ 5
Hình 2.3: Chôm chôm Java 6
Hình 2.4: Chôm chôm nhãn 6
Hình 2.5: Chôm chôm Rongrien 6
Hình 2.6: Nấm men Saccharomyces cereviceae 11
Hình 2.7: Biểu đồ biểu diễn đường tăng trưởng nấm men 16
Hình 2.8: Vị trí vùng ITS trên rDNA 19
Hình 2.9: Sơ đồ quá trình phân lập nấm men 20
Hình 2.10: Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men 27
Hình 2.11: Các bước của phản ứng PCR 34
Hình 3.1: Quy trình tổng quát quá trình phân lập nấm men và sản xuất rượu vang chôm chôm Java 39
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập nấm men tự nhiên từ dịch chôm chôm Java 41
Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm khảo sát và tuyển chọn hoạt tính nấm men 43
Hình 3.4: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của các nhân tố lên quá trình lên men rượu vang chôm chôm Java 45
Hình 3.5: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 48
Hình 4.1: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long lên men trong điều kiện không có vỏ và không bổ sung đường (hình ở vật kính 100) 50
Hình 4.2: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long lên men trong điều kiện có vỏ và không bổ sung đường (vật kính 100) 51
Hình 4.3: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long lên men trong điều kiện không có vỏ và bổ sung đường (vật kính 100) 52
Hình 4.4: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long lên men trong điều kiện có vỏ và bổ sung đường (hình ở vật kính 100) 52
Hình 4.5: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre lên men trong điều kiện không có vỏ và không bổ sung đường (hình ở vật kính 100) 53
Hình 4.6: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre lên men trong điều kiện có vỏ và không bổ sung đường (vật kính 100) 54
Footer Page 8 of 126
Trang 9Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học xi
Hình 4.7: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre
lên men trong điều kiện không có vỏ và bổ sung đường (vật kính 100)
55
Hình 4.8: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre lên men trong điều kiện có vỏ và bổ sung đường (hình ở vật kính 100) 56
Hình 4.9: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ lên men trong điều kiện không có vỏ và không bổ sung đường (hình ở vật kính 100) 57
Hình 4.10: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ lên men trong điều kiện có vỏ và không bổ sung đường (vật kính 100) 58
Hình 4.11: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ lên men trong điều kiện không có vỏ và bổ sung đường (vật kính 100) 59
Hình 4.12: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ lên men trong điều kiện có vỏ và bổ sung đường (hình ở vật kính 100) 60
Hình 4.13: Nấm men nhóm 1 (nấm men hình cầu lớn) 63
Hình 4.14: Nấm men nhóm 2 (nấm men hình cầu nhỏ) 63
Hình 4.15: Nấm men nhóm 3 (nấm men hình ovan lớn) 64
Hình 4.16: Nấm men nhóm 4 (nấm men hình ovan nhỏ) 64
Hình 4.17: Nấm men nhóm 5 (nấm men hình elip) 67
Hình 4.18: Nấm men nhóm 6 (nấm men hình elip dài) 68
Hình 4.19: Nấm men nhóm 7 (nấm men hình elip nhọn) 68
Hình 4.20: Sự hình thành tế bào nảy chồi của 39 dòng nấm men phân lập (hình vật kính 100) 69
Hình 4.21: Hình dạng bào tử của các nhóm nấm men (vật kính 100) 71
Hình 4.22: Môi trường Christensen khi vừa mới cấy các dòng nấm men 73 Hình 4.23: Sau khi nuôi cấy các dòng nấm men một tuần 73
Hình 4.24: Các dòng nấm men có khả năng sinh urease làm môi trường đổi màu (đỏ) so với dòng không sinh urease (vàng) 73
Hình 4.25: Khuẩn lạc và tế bào nấm men VVĐ3 79
Hình 4.26: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự tương quan giữa pH ban đầu và mật số tế bào nấm men đến quá trình tạo ethanol 81
Hình 4.27: Biểu đồ đường mức thể hiện sự tương quan giữa độ pH ban đầu và mật số nấm men đến quá trình tạo ethanol 81
Hình 4.28: Kết quả chạy PCR của nấm men VVĐ3 trên gel agarose 86
Footer Page 9 of 126
Trang 10Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học xii
Hình 4.29: So sánh trình tự vùng ITS – rDNA của nấm men VVĐ3 và chủng
Saccharomyces cerevisiae với số đăng ký KC183726.1 87
Hình 5.1: Quy trình lên men rượu vang chôm chôm Java (đề nghị) 89
Footer Page 10 of 126
Trang 11Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học xiii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
STT Chữ viết
tắt
Nội dung
không có vỏ, không đường
không vỏ, có đường
có vỏ, không đường
có vỏ, có đường
không vỏ, không đường
không vỏ, có đường
có vỏ, không đường
có vỏ, có đường
Long không vỏ, không đường
Long không vỏ, có đường
Long có vỏ, không đường
Long có vỏ, có đường
Footer Page 11 of 126
Trang 12Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học 1
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề
Chôm chôm là loại cây ăn trái đặc trưng của vùng Đông Nam Á Tuy hình dạng không được bắt mắt như các loài trái cây khác nhưng với hương vị đặc trưng, chôm chôm đã chiếm một vị thế cao đối với người tiêu dùng Tại Việt Nam, chôm chôm tập trung chủ yếu ở các tỉnh thuộc lưu vực sông Đồng Nai và Nam Trung Bộ, trong đó tỉnh Đồng Nai có diện tích trồng chôm chôm lớn nhất, sau đó là Bến Tre, Vĩnh Long và Tiền Giang Chôm chôm cùng họ với vải và nhãn nhưng có một số đặc trưng hình thái và các đặc tính sinh học khác hẳn Trong ba loại quả này, chôm chôm là loại quả có triển vọng, nhất là
ở miền Nam vì cho sản lượng cao, ổn định, dễ trồng Chôm chôm có hương vị thơm ngon, thịt giòn hợp với khẩu vị của đa số các dân tộc Châu Á
Giống chôm chôm trồng chủ yếu ở nước ta hiện nay là chôm chôm Java, đây là loại chôm chôm rất phổ biến với mùi thơm đặc trưng và có vị vừa hơi chua vừa ngọt Chính vì thế chôm chôm Java không gây cảm giác ngán nên được mọi người ưa chuộng Trong những năm gần đây, một số giống chôm chôm mới được trồng tại Việt Nam như chôm chôm nhãn, chôm chôm Thái (chôm chôm Rongrien) Các giống chôm chôm này cũng được nhiều người ưa chuộng vì có vị ngọt nhiều Nhưng một số người lại không ưa chuộng bằng chôm chôm Java vì chôm chôm đường và chôm chôm Rongrien chỉ có vị ngọt nhiều nên mau ngán
Ở Việt Nam, chôm chôm Java thường được sử dụng chủ yếu để ăn tươi
do chôm chôm có hương vị đặc trưng và nhiều dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể Tuy nhiên khi đến mùa chôm chôm, do sản lượng chôm chôm của các nhà vườn cao nên dẫn đến hiện trạng các nhà vườn bị ép giá bởi thương lái, nhất là loại chôm chôm Java Có những năm chôm chôm Java chỉ có 1.800 đồng/kg Bên cạnh đó là việc không tránh khỏi vấn đề hư hỏng do lượng quá nhiều không tiêu thụ hết được Mặt khác, các sản phẩm được chế biến từ chôm chôm còn khá ít, chưa được đầu tư nghiên cứu nhiều gây nên sự lãng phí nguồn nguyên liệu chôm chôm phong phú, gây khó khăn cho các nhà vướn Vì vậy việc nghiên cứu làm đa dạng sản phẩm chôm chôm sẽ giúp cải thiện vấn đề đầu ra cho chôm chôm là vấn đề rất cần thiết
Một trong các hướng nghiên cứu đó là tạo ra sản phẩm rượu vang chôm chôm Java Rượu vang là một loại rượu có độ cồn tương đối thấp được lên men từ dịch ép trái cây nên phù hợp với nhiều đối tượng Ngoài chức năng là
Footer Page 12 of 126