phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt từ thực phẩm lên men

i Đề tài được tiến hành nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men ethanol ở nhiệt độ cao và khảo sát khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men này trên môi trư

Trang 1

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MSSV: 3113753 LỚP: VI SINH VẬT K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014

Trang 2

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MSSV: 3113753 LỚP: VI SINH VẬT K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014

Trang 3

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Trần Thái Thanh

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký tên)

Trang 4

Em xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học, cùng các thầy cô đã giảng dạy cho em trong các học kì qua

Xin gửi lời cảm ơn đến cố vấn học tập – thầy Phạm Hồng Quang đã luôn giúp đỡ,

hỗ trợ nhiệt tình cùng những lời khuyên của thầy đã giúp em hoàn thành tốt quá trình học tập cũng như hướng dẫn em thực hiện đề tài này

Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Bùi Hoàng Đăng Long – cán

bộ phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài

Chân thành cảm ơn các chị cao học cũng như các bạn cùng thực hiện luận văn trong phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm đã quan tâm, chia sẻ kinh nghệm và ủng hộ tinh thần trong suốt thời gian vừa qua

Kính chúc quý thầy cô được nhiều sức khỏe, thành công trong công tác nghiên cứu

và luôn có những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đào tạo

Xin chân thành cảm ơn!

Cần thơ, ngày tháng 12 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Trần Thái Thanh

Trang 5

i

Đề tài được tiến hành nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men ethanol ở nhiệt độ cao và khảo sát khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men này trên môi trường rỉ đường Đề tài đã phân lập được 30 chủng nấm men từ các loại thực phẩm lên men khác nhau Các chủng nấm men thu được đa số có tế bào dạng hình ovan và hình elip dài Có 19 chủng có hoạt tính gelatinase và 25 chủng có hoạt tính urease Tất cả các chủng nấm men phân lập được đều có khả năng phát triển đến 37°C nhưng chỉ có 9 chủng có khả năng phát triển ở 43°C Khả năng chịu ethanol tối đa của các chủng nấm men nằm trong khoảng 9% (v/v) với 25 chủng có khả năng phát triển ở nồng độ ethanol này Ba chủng nấm men AD7, CC1 và CD3.1, có khả năng chịu nhiệt ở mức trên 40°C, chịu ethanol ở mức 9%, và có khả năng lên men tạo bọt khí trong môi trường glucose 2% tốt hơn các chủng khác, được khảo sát khả năng lên men trong môi trường rỉ đường ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 30°C đến 39°C Kết quả cho thấy chủng nấm men AD7 và CC1 có nhiệt độ lên men thích hợp là 30 – 37°C, nồng

độ ethanol lần lượt là 1,83% (v/v) và 1,61% ở nhiệt độ 37°C Chủng nấm men CD3.1 sinh lượng ethanol cao ở nhiệt độ 30°C (2,77%), nhưng giảm nhanh khi tăng nhiệt độ lên men

Từ khóa: Chịu ethanol, chịu nhiệt, lên men ethanol, nấm men, thực phẩm lên men

Trang 6

Chuyên nghành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Nấm men 2

2.1.1 Giới thiệu chung về nấm men 2

2.1.2 Phân loại 2

2.1.3 Hình dạng và kích thước 2

2.1.4 Thành phần tế bào 2

2.1.5 Đặc tính sinh lý, sinh hóa 3

2.1.6 Quá trình sinh trưởng và phát triển 4

2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men 6

2.1.8 Nấm men chịu nhiệt 8

2.2 Một số loại thực phẩm lên men 9

2.2.1 Giấm 9

2.2.2 Dưa cải 10

2.2.3 Chao 10

2.2.4 Nước tương đậu nành 10

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Phương tiện 12

3.1.1 Thời gian và địa điểm 12

3.1.2 Nguyên vật liệu 12

3.1.3 Hóa chất 12

3.1.4 Thiết bị, dụng cụ 13

Trang 7

Chuyên nghành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

3.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Phân lập nấm men 14

3.2.2 Khảo sát đặc tính hình thái, sinh lý của nấm men 15

3.2.3 Khảo sát sơ bộ hoạt tính lên men của nấm men 18

3.2.4 Khảo sát khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men 18

3.2.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men 19

3.2.6 Khảo sát khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men được chọn 19 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Phân lập các chủng nấm men từ thực phẩm lên men 21

4.2 Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của nấm men 22

4.2.1 Đặc điểm hình thái 22

4.2.2 Đặc tính sinh hóa 27

4.3 Sơ tuyển hoạt tính lên men của nấm men 29

4.4 Khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men 30

4.5 Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men 32

4.6 Khả năng lên men của các chủng nấm men 34

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Một số hình ảnh thí nghiệm

Phụ lục 2 Kết quả và phân tích thống kê các thí nghiệm

Phụ lục 3 Các phương pháp phân tích

Trang 8

Chuyên nghành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần vỏ tế bào nấm men S cerevisiae 3

Bảng 2: So sánh các yếu tố phát triển của một số loại nấm men 8

Bảng 3: Một số loại nấm men trong thực phẩm lên men 9

Bảng 4: Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu và ký hiệu 21

Bảng 5: Đặc điểm hình thái của 30 chủng nấm men phân lập được 22

Bảng 6: Đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng nấm men 27

Bảng 7: Chiều cao cột khí của các chủng nấm men khi lên men đường glucose 29

Bảng 8: Khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men 30

Bảng 9: Khả năng chịu nhiệt của 30 chủng nấm men 32

Bảng 10: Độ Brix, pH và nồng độ ethanol sinh ra sau 5 ngày lên men 34 Bảng 12: Khả năng lên men sucrose của 30 chủng nấm men (đơn vị: mm) Phụ lục 2.1 Bảng 13: Khả năng lên men maltose của 30 chủng nấm men (đơn vị: mm) Phụ lục 2.2 Bảng 14: Khả năng lên men glucose trong 48 giờ (đơn vị: mm) Phụ lục 2.3 Bảng 14 (tt): Khả năng lên men glucose trong 48 giờ (đơn vị: mm) Phụ lục 2.3 Bảng 15: Kết quả thử nghiệm khả năng lên men rỉ đường Phụ lục 2.4

Trang 9

Chuyên nghành Vi sinh vật học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Nấm men S cerevisiae 2

Hình 2: Chao trắng 10

Hình 3: Nước tương đậu nành lên men (shoyu) 11

Hình 4: Kết quả thử nghiệm hoạt tính urease 28

Hình 5: Kết quả thử nghiệm hoạt tính gelatine 28

Hình 6: Khuẩn lạc nấm men ở các nồng độ ethanol khác nhau 31

Hình 7: Khuẩn lạc nấm men ở các nhiệt độ khác nhau 33

Hình 8: Nồng độ ethanol thu được khi lên men ở các mức nhiệt độ khác nhau 35 Hình 9: Các dụng cụ sử dụng trong phòng thí nghiệm Phụ lục 1.1 Hình 10: Kết quả thử nghiệm hoạt tính urease của 30 chủng nấm men Phụ lục 1.2 Hình 11: Kết quả thử nghiệm hoạt tính gelatinase Phụ lục 1.3

Trang 10

Chuyên nghành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL: Đồng bằng Sông Cửu Long v/v : thể tích/thể tích

w/v: khối lượng/thể tích YPG: Yeast extract – Pepton – Glucose

Trang 11

Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, nấm men đang là một trong những đối tượng được nghiên cứu mạnh mẽ không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới Bởi vì chúng có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp cũng như đối với đời sống và chăm sóc sức khỏe của con người Một số ứng dụng nổi bật là: sản xuất nhiên liệu sinh học (Biogasoline), ethanol công nghiệp, sinh khối phục vụ ngành công nghiệp thực phẩm, hóa chất, đặt biệt là β – glucan được chiết tách từ thành tế bào nấm men có rất nhiều tác dụng như: tăng cường miễn dịch, điều trị ung thư, chống oxy hóa, tái tạo da… Nhờ đó, β – glucan được ứng dụng nhiều trong bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho gia súc, mỹ phẩm và dược phẩm (Phạm Việt Cường, 2005)

Trong công nghiệp, tùy thuộc vào kiểu lên men, nhiệt độ có thể đạt từ 40 - 50C gây chết hầu hết nấm men Do đó, người ta thường dung nước để làm mát bồn lên men đồng nghĩa với việc tăng chi phí sản xuất (Đồng Thị Thanh Thu, 2003) Có hai biện pháp được dùng để nâng cao khả năng chịu nhiệt của nấm men đó là: dung chất phụ gia

và huấn luyện nấm men (Đinh Đức Tài, 2006) Nhưng khi dùng chất phụ gia chỉ có ích trong vấn đề khi sấy khô nấm men

Đó cũng là mục đích mà đề tài: “Phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt từ thực phẩm lên men” hướng đến

1.2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập được các chủng nấm men từ các thực phẩm lên men ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long có khả năng chịu nhiệt, chịu ethanol và lên men ethanol tốt Nội dung thực hiện:

+ Phân lập các chủng nấm men từ các loại thực phẩm lên men

+ Khảo sát các đặc điểm, đặc tính sinh lý, sinh hóa của nấm men

+ Khảo sát khả năng lên men các chủng nấm men phân lập được

+ Khảo sát khả năng chịu ethanol của nấm men

+ Khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men

+ Khảo sát khả năng lên men ethanol của nấm men

Trang 12

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nấm men

2.1.1 Giới thiệu chung về nấm men

Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có các đặc điểm như: có cấu tạo đơn bào, nhân có màng bao bọc, sinh sản bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, có khả năng lên men đường tạo thành ethanol và CO2 Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là những nơi có chứa đường và pH thấp (Nguyễn Hữu Tường, 2013)

Nấm men được dùng nhiều trong công nghiệp sản xuất rượu, bia, đồ uống chứa ethanol, bánh mì và nhiều loại thực phẩm lên men khác Tế bào nấm men chứa khoảng

30 – 50% protein, 24 – 40% polysaccaride (trọng lượng khô) và nhiều loại vitamin Chúng được bổ sung vào thức ăn gia súc và có thể sản suất các loại thực phẩm khác (Đinh Đức Tài, 2006)

2.1.2 Phân loại

Nấm men đa phần thuộc ngành nấm túi (Ascomycota) và một số ít thuộc ngành nấm đảm (Basidiomycota)

Theo Kurtzman et al (2011) có 149 chi và gần 1500 loài đã được mô tả

Phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc giống lớp nấm men thật (lớp

Ascomyces) bao gồm: Giống Saccharomyces (ví dụ: Sacchromyces cerevisiae),

Trang 13

Lên men

2.1.4 Thành phần tế bào

Trung bình trong tế bào nấm men chứa 75% nước, 25% chất khô, trong đó có chứa:

30 – 50% protein, 24 – 40% glucid, 2 – 5% lipid và 5 – 11% khoáng

Bảng 1: Thành phần vỏ tế bào nấm men S cerevisiae

Phân tử hữu cơ % khối lượng vỏ tế bào Phân tử khối (kDa)

(*Theo Ida van der Klei năm 2011)

2.1.5 Đặc tính sinh lý, sinh hóa

Nấm men có khả năng hô hấp hiếu khí và kỵ khí và cho các sản phẩm lên men tùy thuộc vào kiểu hô hấp Khi hô hấp kỵ khí, nấm men lên men ethanol và sin CO2 Khi cho thêm hydrosulfit vào dịch nấm men đang lên men glucose (làm tăng pH môi trường) thì hiệu suất lên men ethanol giảm đồng thời xuất hiện glycerol (Wang et al.,2001) Nấm men có thể sinh trưởng và phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 2 – 45oC Arthur và Watson (1976) đã phân nhóm nấm men theo những nhiệt độ mà chúng phát triển, cụ thể là: nấm men ưa lạnh (psychrophilic) phát triển trong khoảng từ 2 – 20oC, nấm men ưa nhiệt độ trung bình (mesophilic) là 5 – 35oC, nấm men chịu nhiệt (thermo-tolerant) là 8 – 42oC và nấm men ưa nhiệt (thermophilic) là 28 – 45oC (Nguyễn Hữu Tường, 2012) Cá biệt có một số loại nấm men có khả năng phát triển ở 50oC (Nguyễn Hữu Thanh, 2012)

Nâm men có một số đặc điểm như: lên men được dung dịch đường có nồng độ cao (25 – 30%), nồng độ thích hợp là 10 – 15% Khả năng chịu ethanol của nấm men nằm trong khoảng 3 – 6% (Ngô Thị Phương Dung, 2009)

Nguồn Carbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccarose, maltose, lactose, glucose…

Hô hấp hiếu khí:

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 674 cal

Hô hấp kị khí

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal

Dinh dưỡng oxy, hydro:

Oxy được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch

Dinh dưỡng Nitơ:

Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ

Trang 14

hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amide, urea Đạm vô cơ

là các muối amon khử nitrate, sulfate,…

Các vitamin và chất khoáng:

Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men

− Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn

− Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme

− Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men

− Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác

− Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic

− Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê

2.1.6 Quá trình sinh trưởng và phát triển

a Sự sinh trưởng

Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều

b Sự sinh sản

Sinh sản sinh dưỡng:

 Nảy chồi: từ một cực của tế bào mẹ nảy chồi thành 1 tế bào con sau đó hình thành

1 vách ngăn giữa hai tế bào Tế bào con có thể tách ra hoặc dính với tế bào mẹ

và nó lại có thể tiếp tục nảy chồi

 Phân đôi: tương tự như vi khuẩn, tế bào mẹ phân cắt theo chiều ngang và tạo thành 2 tế bào con

Sinh sản đơn tính:

− Bằng bào tử

Sinh sản hữu tính:

− Do 2 tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp tử (tiếp hợp đẳng giao và

dị giao) Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang

Trang 15

c Sự phát triển

Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già Vì rằng tế bào được phân chia thành hai cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa

Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới

Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian

Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:

− Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch

− Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào,…

Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5 giai

Trang 16

2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men

a Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca và vitamin Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất tốt Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trước tiên phải thủy phân bằng acid hoặc enzyme của mầm mạ, của vi sinh vật để biến các polysacaride thành các dạng đường mà nấm men

đồng hóa được Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà

nguồn carbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trường đường với nguồn nguyên liệu được nấu chín thì tốt hơn Một số giống nấm men phân lập từ men thuốc bắc có khả năng sử dụng cả môi trường đường và môi trường tinh bột hoặc cấy trực tiếp vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cám, số lượng nấm men có thể đạt hàng chục triệu tế bào/mL dịch nuôi cấy

Môi trường rỉ đường hoặc dung dịch đường được acid hóa với pH = 4, bổ sung thành phần dinh dưỡng và duy trì nhiệt độ 25 – 30°C, lượng sinh khối thu được khoảng

25 – 50 g/l (Nguyễn Thị Hồng Phượng, 2006) Theo phòng vi sinh thuộc Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, từ 1 m3 nước bã rượu nuôi nấm men có thể thu được 10 – 15 kg men khô Môi trường nước chiết giá đậu cũng được sử dụng để nuôi cấy nấm men do trong đậu chứa hàm lượng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men Ngoài ra, còn

có các vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trưởng khác Tuy nhiên, vitamin C trong nước chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men Ngoài ra, môi trường thủy phân từ cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm rạ, lõi ngô, bã mía…), hay parafin từ dầu mỏ cũng có thể sử dụng để nuôi cấy nấm men

Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng được môi trường dịch kiềm sulfide (chất thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đường pentose Người ta tính được rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất giấy sẽ thải một lượng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 180 kg đường Dịch này hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với bình thường (Lương Đức Phẩm, 2006) Hiện nay, môi trường được sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến nhất vẫn là môi trường rỉ đường 90% lượng sinh khối nấm men dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trên thế giới được sản xuất từ rỉ đường mía và củ cải đường Thành phần chính của loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35 – 40% Trong đường mía chứa các chất sinh trưởng (biotin,

Trang 17

acid pantotenic, inozit) với hàm lượng lớn, nhưng lại nghèo chất khoáng và các acid amin

Vì vậy, khi sử dụng đường mía làm nguồn carbon nuôi cấy nấm men cần phải loại

bỏ một phần các chất sinh trưởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân vào giai đoạn nhân giống Lượng đường trong môi trường khoảng 2 – 3%, không nên nhiều hơn hay ít hơn:

− Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí và vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngược đến quá trình tạo sinh khối

− Nếu lượng đường quá nhỏ sẽ không đủ nguồn carbon cần thiết cho sự tạo sinh khối

Một điểm đáng lưu ý là hệ keo và các chất màu có trong mật rỉ Hệ keo có trong mật rỉ được hình thành bởi protein và pectin, thường có độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, gây ra hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, dẫn đến hiệu suất sinh khối thu được thấp Các chất màu có trong rỉ đường như hợp chất caramen, melanin…sẽ làm sinh khối nấm men có màu sẫm, ảnh hưởng đến cảm quan Vì thế, đặc biệt trong sản xuất men bánh mì người ta phải xử lý rỉ đường trước khi nuôi cấy

b Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của

chúng Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28 – 30°C, trên 43°C và dưới

28°C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn

Ở 30°C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S cerevisiae 2 – 3 lần, ở 35 –

38°C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20 – 23°C, hạn chế được mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn

(*Nguồn: http://d.violet.vn/uploads/resources/561/1394182/preview.swf , ngày 18/11/2014)

c pH

pH của môi trường pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,2 – 5,5 Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3,0 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein

Trang 18

đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6 ( Lương Đức Phẩm, 2006)

d Tốc độ sục khí và khuấy trộn

Tốc độ sục khí và khuấy trộn trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hoà oxy hoà tan Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống của tế bào nấm men Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua

2 giai đoạn: đầu tiên oxy được hoà tan vào môi trường nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa 1

kg đường, nhưng thực tế chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là được nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trường (Vương Thị Hồng Vi, 2007, trích dẫn từ Lao Thị Nga, 1987) Khi nuôi cấy nấm men ở qui mô công nghiệp, kích thước của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hưởng gián tiếp lên sự tăng trưởng của nấm men

Bảng 2: So sánh các yếu tố phát triển của một số loại nấm men

(*Theo Fleet 2011)

2.1.8 Nấm men chịu nhiệt

Theo Roehr (2001), nấm men chịu nhiệt có một số thuận lợi trong việc sản xuất ethanol trong điều kiện nhiệt độ cao bao gồm: hoạt động trao đổi chất vẫn tốt và tốc độ lên men cao tạo ra nhiều sản phẩm; độ tan của oxy cà các khí khác trong nước giảm khi nhiệt độ tăng đảm bảo điều kiên kỵ khí cho quá trình lên men; độ nhớt của môi trường

Nấm men nhiệt độ Giới hạn o C Giới hạn pH

Giới hạn sucrose (% w/v)

Giới hạn NaCl (% w/v)

Trang 19

lên men giảm khi nhiệt độ tăng nên năng lượng cần thiết cho việc trộn môi trường được giảm đi; cơ hội bị nhiễm được giảm thiểu

Nguyễn Vân Anh et al (2011) đã tuyển chọn được 11 chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt tương đối cao (42°C) Nguyễn Hữu Tường (2012) cũng đã tuyển chọn được

7 chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt tương đối cao (ở 43°C)

2.2 Một số loại thực phẩm lên men

Bảng 3: Một số loại nấm men trong thực phẩm lên men

Bia, rượu Saccharomyces cerevisiae Sữa lên men Kluyveromyces spp

Saccharomyces bayanus Candida parasilosis Saccharomyces pastorianus Candida krusei

Pho – mát Debaryomyces hansenii Candida valida

Candida spp Dưa chuột Debaryomyces spp

Kluyveromyces maxianus Candida spp

Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus Yarrowia lipolytica Lachancea cidri

Tương nhão Zygosaccharomyces spp Nước tương Debaryomyces spp

(*Theo Johnson, 2011)

2.2.1 Giấm

Giấm là một loại gia vị được sử dụng trong các món ăn hằng ngày, được sản xuất

từ các nguồn nguyên liệu có đường hoặc tinh bột bằng cách kết hợp lên men rượu và lên men acid acetic Từ “giấm” trong tiếng Pháp là “vinaigre” có nghĩa là “vang chua” (Nguyễn Thị Thùy Lam, 2006)

Cơ chế lên men giấm chủ yếu là quá trình lên men đường thành ethanol bởi nấm men và quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic bởi vi khuẩn acetic Trong đó, nấm men đóng vai trò khá quan trọng khi lên men giấm từ các nguồn nguyên liệu giàu glucose như nước trái điều (khoảng 25o Brix)

Trang 20

2.2.2 Dưa cải

Dưa cải à một sản phẩm lên men lactic, cải được lên men ở nồng độ muối thấp, khi

đó các loài vi khuẩn khác phát triển chậm hoặc bị ức chế chỉ có vi khuẩn lactic phát triển được và dần chiếm ưu thế làm giảm pH của môi trường dẫn đến vị chua của dưa cải Hàm lượng muối là 6 – 9% so với khối lượng rau Cho thêm 1,0 – 1,5% đường nếu lượng đường trong nguyên liệu thấp Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men cải bẹ tốt nhất là 20 – 25oC ở nhiệt độ này sản phẩm có chất lượng tốt nhất Nếu lên men ở nhiệt

độ cao sản phẩm có màu xỉn và có mùi lạ Thời gian kết thúc quá trình lên men là 15 –

16 ngày (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

2.2.3 Chao

Chao có nguồn gốc từ Trung Quốc, khá phổ biến ở miền Trung và miền Nam của Việt Nam Chao được làm từ khối đậu hũ (thu được từ kết tũa sữa đậu nành) Đậu hũ được dùng làm chao cứng hơn bởi ép hoặc được sử lý hơi nóng nhanh, và tuần tự được chủng giống trên bề mặt và ủ ở ẩm độ cao tại nhiệt độ 20 – 35°C, tuỳ thuộc vào địa điểm

và mùa các loài nấm mốc: Actinomucor elegans, Mucor hiemalis, M silvaticus, M

subtilis Trong đó loài Actinomucor elegans là tốt nhất

Hình 2: Chao trắng

(*Nguồn: http://www.foodnk.com/ , 15/10/2011)

Bước cuối cùng trong giai đoạn làm chao là chan nước muối để chao chín Thành phần của nước muối để chao chín ảnh hưởng mạnh mẽ đến tính chất của sản phẩm cuối cùng Nó luôn chứa 10 – 12% NaCl, và rượu gạo 10% hàm lượng ethanol Ngoài loại chao thông thường còn có loại chao đỏ, trong nước chan của loại chao này có chứa ang – kak Ang – kak không chỉ cho sắc tố cam và đỏ mà còn chứa đựng nhiều phân hoá tố (enzyme) tích cực góp phần vào sự phân cắt và tạo hương vị của chao (Nguyễn Vắn Bá

et al., 2005)

2.2.4 Nước tương đậu nành

Nước tương đậu nành lên men có nguồn gốc từ Trung Quốc Nước tương có nhiều dạng khác nhau, nhưng Koikuchi – Shoyu là đại diện tốt nhất của nước tương lên men

Nó là một chất lỏng nâu xậm trong với thành phần xấp xỉ: 22°Bé, 17% NaCl, 1,6% đạm

Trang 21

tổng số, 1% đạm formol, 3% đường khử, 2,3% rượu alcohol và pH 4,7 (Nguyễn Văn

Bá et al., 2005)

Hình 3: Nước tương đậu nành lên men (shoyu)

Nguồn: http://www.musashirestaurant.co.nz/

Trong quy trình làm nước tương, loại vi sinh vật chủ yếu được sử dụng là

Asper-gillus oryzae hoặc A sojae Nhưng trong giai đoạn lên men trong nước muối thì vi

khuẩn axít lactic (Tetragenococcus halophila) sẽ phát triển trong 2 tháng đầu ở 15 – 20°C và những tháng tiếp theo ở 30°C, nấm men ưa muối (Zygosaccharomyces rouxii)

sẽ phát triển, vào khoảng thời gian chín, những sản phẩm trao đổi chất của chúng thêm vào thành phần hương vị thực chất thơm ngon của nước tương

Trang 22

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 06/2014 đến 12/2014

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và

Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Nguyên vật liệu

Các mẫu thực phẩm lên men được thu thập từ địa bàn các tỉnh Hậu Giang, Sóc Trăng và Vĩnh Long, bao gồm 22 mẫu:

Hậu Giang: 4 mẫu giấm, 4 mẫu dưa cải

Sóc Trăng: 4 mẫu giấm, 4 mẫu dưa cải

Vĩnh Long: 4 mẫu dưa cải, 2 mẫu chao

Trang 23

(Hi-Ngoài ra còn có các dụng cụ khác như: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh (Merck), eppendorf, đèn cồn, que cấy, khăn giấy, dao, bọc nhựa, dây thun cùng các thiết bị và dụng cụ khác của phòng thí ngiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ

Trang 24

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân lập nấm men

a Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường YPG và YPG agar được khử trùng ở 121oC trong 20 phút và được bổ sung tetracycline (0,1 mg/mL) sau khi môi trường được làm nguội đến 65°C

b Nuôi tăng sinh nấm men

Chuyển 1 mL (hoặc 1 g) mẫu vào 100 mL dung dịch môi trường nuôi tăng sinh YPG trong bình tam giác 250 mL, đậy nắm gòn, ủ lắc với vận tốc 150 rpm ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 24 – 48 giờ Dùng dung dịch này để tiến hành phân lập nấm men

c Cấy phân lập nấm men

Cấy trải:

 Chuyển 10 µl dịch nuôi tăng sinh lên bề mặt môi trường YPG agar trong đĩa petri

 Trải đều mẫu trên mặt môi trường bằng que cấy trải vô trùng

 Úp ngược đĩa và ủ ở 30oC trong 24 – 48 giờ

Cấy phân lập:

 Chọn các khuẩn lạc nấm men đặc trưng, cấy ria trên môi trường YPG agar mới

 Úp ngược đĩa và ủ ở 30oC trong 24 – 48 giờ

 Tiếp tục cấy cấy phân lập đến khi thu được chủng nấm men thuần (nấm men thuần: có khuẩn lạc đồng nhất về màu sắc, kích thước, độ nổi, dạng bìa và hình dạng tế bào đồng nhất khi quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính E100

Trang 25

3.2.2 Khảo sát đặc tính hình thái, sinh lý của nấm men

 Phân lập các chủng nấm men trên môi trường YPG agar

 Ủ ở 30oC trong 24 – 48 giờ, ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm men

 Làm tiêu bản của các chủng nấm men và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính E100, ghi nhận hình dạng và kích thước của tế bào nấm men

 Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ thẫm

 Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần

Trang 26

c Xác định hoạt tính gelatinase

Mục đích

Xác định khả năng sinh enzyme gelatinase của các chủng nấm men

Phương pháp

− Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào môi trường có chứa gelatine (dạng lỏng)

và ủ ở nhiệt độ 30C trong 48 giờ

− Làm lạnh ở 4 – 8C trong 6 – 8 giờ

− Nấm men có khả năng sinh enzyme gelatinase sẽ khiến môi trường không đông đặc lại được (do gelatin bị phân hủy)

Cách tiến hành

 Chuẩn bị môi trường chứa gelatine

 Công thức môi trường chứa gelatine cho 1000 mL môi trường:

Gelatine 120 g

Yeast extract 3 g

 Hút 3 mL môi trường chứa gelatine cho vào mỗi ống nghiệm

 Khử trùng các ống môi trường chứa gelatine ở 121oC trong 20 phút

 Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường atine đã được khử trùng, ủ các ống nghiệm ở 30oC trong 48 giờ

gel- Sau đó cho vào tủ trữ lạnh ở 4 – 8°C trong 6 – 8 giờ

 Kết quả dương tính khi môi trường trong ống nghiệm không bị đông đặc lại

d Xác định khả năng lên men saccharose

Mục đích

Xác định khả năng lên men saccharose của các chủng nấm men

Trang 27

− Chủng 1 mL dung dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa 9 mL môi trường rose 2% có chứa sẵn chuông Durham đã khử trùng

saccha-− Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Xác định chiều cao cột khí sinh ra trong chuông Durham

− Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men của nấm men: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong chuông Durham trong 48 giờ, mỗi lần đo cách nhau 6 giờ, bắt đầu đo sau

12 giờ từ lúc bắt đầu thí nghiệm

− Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

e Khả năng lên men maltose

Trang 28

3.2.3 Khảo sát sơ bộ hoạt tính lên men của nấm men

− Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

− Thống kê số liệu theo từng mốc thời gian bởi phương pháp phân tích phương sai

1 nhân tố bằng phần mềm minitab version 16.2.1 (Minitab Inc, USA) Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men glucose mạnh nhất

3.2.4 Khảo sát khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men

Mục đích

Xác định khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men trên môi trường YPG rắn có bổ sung ethanol ở các nồng độ khác nhau

Trang 29

Phương pháp

− Chủng các chủng nấm men lên trên bề mặt môi trường YPG agar có chứa nồng

độ ethanol lần lượt là: 0%, 3%, 6%, 9% và 12% (v/v), và ủ trong 24 – 48 giờ

Cách thực hiện

 Cấy ria các chủng nấm men trên các đĩa petri chứa môi trường YPG agar có bổ sung ethanol theo các nồng độ: 0%, 3%, 6%, 9% và 12%

 Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ 30C

 Quan sát và ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc của các chủng nấm men

3.2.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men

 Cấy ria các chủng nấm men trên các đĩa petri chứa môi trường YPG agar

 Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ: 30, 35, 37, 40 và 43C trong 24 – 48 giờ

 Quan sát và ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc của các chủng nấm men

3.2.6 Khảo sát khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men được chọn

Thông qua các kết quả thí nghiệm thử khả năng chịu ethanol (3.2.4), chịu nhiệt (3.2.5) và thử nghiệm khả năng lên men glucose (3.2.3), tuyển chọn các chủng nấm men

có đặc tính tốt nhất tiến hành khảo sát khả năng lên men trong dịch rỉ đường ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

Trang 30

Mục đích

Xác định khả năng tạo enthanol của các chủng nấm men đã được tuyển chọn trong dịch rỉ đường ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

Phương pháp

− Chủng các chủng nấm men được chọn vào môi trường dịch rỉ đường 22o Brix, ủ

ở các nhiệt độ 30, 35, 37 và 39°C trong 5 – 7 ngày Xác định pH, Brix trước và sau khi lên men, chưng cất xác định nồng độ ethanol thu được

Phương pháp tiến hành:

 Nuôi tăng sinh các chủng nấm men được chọn trong môi trường tăng sinh YPG (mật số đạt 108 tế bào/mL)

 Chuẩn bị dịch rỉ đường 22Brix, thanh trùng rỉ đường bằng NaHSO3 (liều lượng

146 mg/L) trong 2 giờ (Nguyễn Thành Tâm, 2013) Xác định độ pH của dung dịch rỉ đường

 Chủng 1 mL dịch tăng sinh vào bình tam giác 250 mL, mỗi bình có chứa 99 mL dung dịch rỉ đường 22oBrix

 Đậy kín bằng waterlock và ủ từ 5 – 7 ngày ở các nhiệt độ: 30, 35, 37 và 39°C

 Xác định pH và độ Brix, xác định nồng độ ethanol thu được (quy về 20°C) bằng phương pháp chưng cất

 Dùng phương pháp thống kê phân tích phương sai 1 nhân tố và 2 nhân tố bằng phần mềm thống kê Minitab version 16.2.1 (Minitab Inc, USA) để xử lý số liệu thu được

Trang 31

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập các chủng nấm men từ thực phẩm lên men

Từ các mẫu thực phẩm lên men có nguồn gốc khác nhau, 30 chủng nấm men đã được phân lập, trong đó có 17 chủng được phân lập từ 12 mẫu dưa cải, 9 chủng được phân lập từ 8 mẫu giấm, 4 chủng được phân lập từ 2 mẫu chao Ký hiệu và nguồn phân lập tương ứng của các chủng nấm men được trình bày trong Bảng 4

Bảng 4: Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu và ký hiệu các chủng nấm men

phân lập

STT Chủng

nấm men

Nguồn nguyên liệu

Địa điểm thu mẫu

1 AD1 Dưa cải Hậu Giang

7 AG1 Giấm Hậu Giang

9 AG3.1 Giấm Hậu Giang

10 AG4.2 Giấm Hậu Giang

12 BD1 Dưa cải Sóc Trăng

24 CD2 Dưa cải Vĩnh Long

25 CD3.1 Dưa cải Vĩnh Long

*Chú thích: Quy tắc ký hiệu:

− Chữ cái thứ nhất (địa điểm thu mẫu): A: Hậu Giang, B: Sóc Trăng, C: Vĩnh Long

− Chữ cái thứ 2 (tên mẫu): D: dưa cải, G: Giấm, C: chao

− Phần số: thể hiện số thứ tự và số chủng từ 1 mẫu

Trang 32

4.2 Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của nấm men

4.2.1 Đặc điểm hình thái

Các chủng nấm men phân lập được có dạng tế bào hình ovan và elip, một số ít có hình cầu Khuẩn lạc chủ yếu là dạng tròn, bìa rễ cây và độ nổi mô Kích thước khuẩn lạc từ 0,5 – 3,0 mm sau 2 ngày ủ ở 30C trên môi trường YPG agar (Bảng 5)

Bảng 5: Đặc điểm hình thái của 30 chủng nấm men phân lập được

AD1

Khuẩn lạc: tròn, trơn láng, màu trắng sữa, bìa gợn sóng, độ nổi mô, kích thước 2,0 – 3,0 mm

Tế bào: hình cầu

AD3

Khuẩn lạc: tròn, trơn láng, màu trắng sữa, bìa nguyên,

độ nổi phẳnng, kích thước 2,5 – 3,0 mm

AD4

Khuẩn lạc: tròn, , bìa hình

rễ cây, màu trắng đục, độ nổi mô, kích thước 0,8 – 1,5

mm

Tế bào: hình elip dài

AD6

Khuẩn lạc: tròn, trơn láng, màu trắng đục, đổ nổi mô, kích thước 2,5 – 3,0 mm

Tế bào: hình ovan

AD7

Khuẩn lạc: tròn, trơn láng, màu trắng sữa, bìa gợn song, độ nổi phẵng, kích thước 2,0 – 2,5 mm

Trang 33

AD8

Khuẩn lạc: Tròn, màu trắng đục, bìa dạng rễ cây,

độ nổi cầu chồng, kích thước 0,5 – 1,0 mm

AG1

độ nổ hố, kích thước 1,0 – 1,5 mm

AG2

Khuẩn lạc: Tròn, màu trắng sữa, bìa dạng rễ cây,

độ nổi cầu chồng, kích thước 1,0 – 1,5 mm

AG3.1

Khuẩn lạc: Tròn, trơn láng, màu trắng sữa, bìa nguyên, độ nổi mô, kích thước 1,5 – 2,5 mm

AG4.2

Khuẩn lạc: Tròn, trơn láng, màu trắng đục, bìa nguyên, độ nổi mô, kích thước 1,0 – 1,5 mm

AG5

độ nổi hố, kích thước 0,5 – 1,0 mm

Trang 34

BD1

Khuẩn lạc: tròn, màu trắng sữa, bìa dạng rễ cây, độ nổi mô, kích thước 0,5 – 1,0 mm

BD2

Khuẩn lạc: tròn, màu trắng sữa, bìa dạng rễ cây, độ nổi mô, kích thước 0,5 – 1,0 mm

BD3

Khuẩn lạc: tròn, màu trắng đục, bìa dạng rễ cây, độ nổi hố, kích thước 1,5 – 2,5 mm

BD4

Khuẩn lạc: tròn màu trắng đục, bìa rang cưa, độ nổi

BG2

Khuẩn lạc: tròn, màu trắng đục, bìa dạng rễ cây, độ nổi mô, kích thước 1,0 – 1,5 mm

Định dạng
Số trang	69
Dung lượng	3,37 MB