Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.). Kết quả đã phân lập được 55 chủng nấm men từ 20 mẫu trái giác thu thập ở 5 tỉnh vùng đất mặn ven biển vùng Đồng bằng Sông Cửu Long gồm Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre và Trà Vinh. Dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa, các chủng nấm men được phân loại sơ bộ thuộc ba giống bao gồm Saccharomyces, Pichia và Candida. Các chủng nấm men được khảo sát khả năng phát triển ở các mức nhiệt độ (30, 35, 37, 39, 41, 43, 45 và 47°C) và nồng độ ethanol (3, 6, 9, 12 và 15% v/v) khác nhau, qua đó đã sơ tuyển được 19 chủng nấm men có khả năng phát triển ở 37-45°C và chịu ethanol ở mức 9-12% (v/v). Kết quả thử nghiệm khả năng lên men rượu vang trái giác ở 37°C cho thấy chủng Saccharomyces sp. CM3.2 có khả năng lên men cao nhất với hàm lượng ethanol đạt 8,95% (v/v).
55 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN RƯỢU VANG TRÁI GIÁC (Cayratia trifolia L.) ISOLATION AND SELECTION OF THERMOTOLERANT YEASTS FOR WINE PRODUCTION FROM THREE-LEAF CAYRATIA (Cayratia trifolia L.) Đoàn Thị Kiều Tiên1,2, Lữ Hằng Nghi1, Nguyễn Ngọc Thạnh1, Huỳnh Xuân Phong1, Hà Thanh Tồn1, Ngơ Thị Phương Dung1 Trường Đại học Cần Thơ, Tp Cần Thơ Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Cần Thơ, Tp Cần Thơ Email: hxphong@ctu.edu.vn TÓM TẮT Nghiên cứu thực với mục tiêu phân lập tuyển chọn nấm men chịu nhiệt có khả lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.) Kết phân lập 55 chủng nấm men từ 20 mẫu trái giác thu thập tỉnh vùng đất mặn ven biển vùng Đồng Sơng Cửu Long gồm Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre Trà Vinh Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, chủng nấm men phân loại sơ thuộc ba giống bao gồm Saccharomyces, Pichia Candida Các chủng nấm men khảo sát khả phát triển mức nhiệt độ (30, 35, 37, 39, 41, 43, 45 47°C) nồng độ ethanol (3, 6, 9, 12 15% v/v) khác nhau, qua sơ tuyển 19 chủng nấm men có khả phát triển 37-45°C chịu ethanol mức 9-12% (v/v) Kết thử nghiệm khả lên men rượu vang trái giác 37°C cho thấy chủng Saccharomyces sp CM3.2 có khả lên men cao với hàm lượng ethanol đạt 8,95% (v/v) Từ khóa: Cayratia trifolia, khả chịu ethanol, nấm men chịu nhiệt, rượu vang trái giác, Saccharomyces sp CM3.2 ABSTRACT The aims of this study were to isolate and to evaluate the thermotolerant yeasts that have the fermentation ability for the production of three-leaf cayratia (Cayratia trifolia L.) wine Fiftyfive newly isolated yeasts were obtained from 20 samples of three-leaf cayratia collected from provinces in the coastal saline soil in Mekong Delta region, including Ca Mau, Bac Lieu, Soc Trang, Ben Tre, and Tra Vinh All isolated yeasts were grouped as follow: Sacccharomyces, Pichia, and Candida, based on their basically morphological, physiological, and biochemical characteristics These isolated yeasts were tested for their growth at diferent temperatures (30, 35, 37, 39, 41, 43, 45, and 47°C) and ethanol concentrations (3, 6, 9, 12, and 15% v/v) Nine-teen selected isolated yeasts that could grow at 37-45°C and tolerate 9-12% (v/v) ethanol were further evaluated for the fermentation ability of three-leaf cayratia at 37°C Saccharomyces sp. CM3.2 was the promising yeast for three-leaf cayratia wine production as this thermotolerant yeast could produce ethanol concentration of 8.95% (v/v) Keywords: Cayratia trifolia, ethanol tolerant ability, Saccharomyces sp CM3.2, thermotolerant yeast, three-leaf cayratia wine ĐẶT VẤN ĐỀ Rượu vang loại thức uống có độ cồn nhẹ, giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon đặc trưng có lợi cho sức khỏe biết sử dụng cách điều độ Một yếu tố quan trọng sản Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 xuất vang nguồn nấm men Đối với nấm men, nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men chuyển hóa đường thành ethanol (Lương Đức Phẩm, 2006) Hiện nay, nhiệt độ trái đất ấm dần lên tượng biến đổi khí hậu, đặc biệt nước nằm vùng nhiệt đới vào khoảng Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 56 thời gian mùa hè, có Việt Nam Nhiệt độ tăng cao ảnh hưởng đến khả lên men nấm men trình sản xuất ethanol phải tiêu tốn phần lượng để giữ ổn định nhiệt độ cho hệ thống lên men (Limtong ctv, 2007; Yuangsaard ctv, 2013) Vì vậy, việc lựa chọn nấm men chịu nhiệt để lên men rượu giải pháp hữu hiệu mang nhiều lợi ích đáng kể tận dụng nhiệt độ cao để lên men, làm cho trình lên men diễn nhanh, nguy nhiễm vi sinh vật giảm giảm chi phí đầu tư cho thiết bị làm mát mang lại nhiều lợi ích kinh tế sản xuất (Roehr, 2001; Limtong ctv, 2007) Theo truyền thống, rượu vang sản xuất từ nho chín, sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae để nâng cao hiệu lên men (Bùi Ái, 2005) Nhưng với nhu cầu ngày cao người giới nói chung Việt Nam nói riêng, ln có nhiều nghiên cứu thử nghiệm để tìm hương vị lạ nâng cao chất lượng cho loại thức uống ưa chuộng Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu lựa chọn trái giác làm ngun liệu lên men rượu vang, đặc biệt việc kết hợp sử dụng nấm men chịu nhiệt để hỗ trợ q trình lên men hạn chế Giác (Cayratia trifolia L.) là một loại dại thuộc họ nho (Vitaceae), sinh trưởng rất nhiều tại vùng ĐBSCL, nhất là các vùng đất nhiễm mặn vùng Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Bến Tre, Đặc biệt, là một loại trái đặc trưng mọc tự nhiên phong phú vùng rừng U Minh thuộc tỉnh Cà Mau Trong trái giác có chứa hợp chất flavonoid, resveratrol,… có khả ngăn chặn q trình oxy hóa, kháng virus, kháng khuẩn, chống ung thư hoạt động lợi tiểu,… (Gupta, 2007; Kumar ctv, 2011; Perumal ctv, 2015) Với lợi ích thiết thực mặt dinh dưỡng, sức khỏe dược tính mà trái giác mang lại với đặc điểm nguồn nguyên liệu dồi dễ tìm nói trái giác có tiềm để sản xuất rượu vang nước ta Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập tuyển chọn nấm men từ trái giác có khả chịu nhiệt, chịu ethanol lên men mạnh để ứng dụng lên men rượu vang trái giác Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu mơi trường Hai mươi mẫu trái giác chín thu thập 20 huyện thuộc tỉnh vùng đất mặn vùng Đồng Sông Cửu Long (Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre Trà Vinh) Trái giác sau thu thập giữ bọc kín vận chuyển phòng thí nghiệm Mẫu dùng ngày để phân lập nấm men trữ tủ lạnh (nhiệt độ 4ºC) Môi trường YPD agar (yeast extract 0,5%, peptone 0,5%, glucose 2,0%, agar 2%); môi trường Chistensen urea broth (urea 20 g, yeast extract 0,1 g, Na2HPO4 9,5 g, K2HPO4 9,1 g, phenol red 0,01 g, pH 6,7 ± 0,2); môi trường gelatine (peptone 8,3 g, yeast extract 5,0 g, gelatine 120 g, pH 7,7 ± 0,2) Môi trường chuẩn bị khử trùng nhiệt ướt 121°C 15 phút Phân lập chủng nấm men từ dịch Quy trình phân lập: Cho g trái giác chín vào mơi trường YPD lỏng (yeast extract g/L, peptone g/L, D-glucose 20 g/L, tetracycline 10%) khử trùng (121°C 15 phút) Tiến hành ủ lắc 150 vòng/phút 24 nhiệt độ 30°C Mẫu dịch tăng sinh (100 µL) cấy trải môi trường YPD agar (yeast extract g/L, peptone g/L, D-glucose 20 g/L, tetracycline 10%, agar 20 g/L) Chọn khuẩn lạc nấm men khác để tiếp tục cấy chuyền đến thu khuẩn lạc nấm men Kiểm tra độ tế bào nấm men kính hiển vi Phân loại sơ Phân loại sơ đến mức độ giống chủng nấm men phân lập dựa vào đặc điểm như: hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, kiểu nẩy chồi, đặc điểm bào tử, hoạt tính phân giải urea gelatin, khả đồng hóa đường (glucose, saccharose maltose) (Kurtzman ctv, 2011) Bào tử nấm men quan sát sau nấm men nuôi cấy môi trường thạch nước đến tuần (Lương Đức Phẩm, 2006) Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 57 Thử khả chịu nhiệt nấm men phân lập ngược thời điểm 12, 18, 24, 32, 36, 42 48 ủ (Nguyễn Hữu Tường ctv, 2013) Cấy ria chủng nấm men phân lập lên môi trường YPD agar ủ nhiệt độ khác (30, 35, 37, 39, 41, 43, 45 47ºC) 48 Quan sát tạo thành khuẩn lạc chủng nấm men khác đĩa thạch (Phong ctv, 2016; Techaparin ctv, 2017) Tuyển chọn chủng nấm men có khả phát triển mạnh môi trường nhiệt độ cao Thử nghiệm khả lên men rượu vang trái giác Thử khả chịu ethanol nấm men chịu nhiệt Cấy ria nấm men phân lập mơi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết (3, 6, 12 15% v/v) Ủ nhiệt độ 37ºC 24-48 quan sát tạo thành khuẩn lạc chủng nấm men (Dung ctv, 2012; Phong ctv, 2016) Tuyển chọn chủng nấm men có khả phát triển mạnh mơi trường có nồng độ ethanol cao Đánh giá sơ khả lên men ethanol chủng nấm men tuyển chọn Nuôi cấy nấm men môi trường YPD lỏng đến mật độ tế bào nấm men đạt 108 tế bào/mL Chủng mL nấm men nuôi cấy vào bình tam giác chứa 99 mL dịch trái giác điều chỉnh 22ºBrix, ủ lên men 5-7 ngày điều kiện kỵ khí 37ºC (Nguyễn Hữu Tường ctv, 2013) Thí nghiệm lặp lại lần Chưng cất đo nồng độ ethanol, quy nồng độ ethanol 20ºC (Nguyễn Đình Thưởng Nguyễn Thanh Hằng, 2005) Xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010 (Micrsoft Corporation, USA) Kết phân tích phương sai kiểm định LSD sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV (Manugistics Inc., USA) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập nấm men từ trái giác Nuôi sinh khối chủng nấm men tuyển Kết phân lập 55 chủng nấm men chọn môi trường YPD lỏng đến mật độ nấm men đạt 10 tế bào/mL (xác định chủng từ 20 mẫu nguyên liệu trái giác phương pháp đếm buồng đếm hồng cầu) thu 20 địa điểm thuộc tỉnh vùng Chủng mL dung dịch nấm men vào ống ĐBSCL (Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến nghiệm chứa mL dung dịch glucose 2% (w/v) Tre Trà Vinh) Nấm men phân lập từ trái chuông Durham úp ngược, thực lần giác có hình dạng bao gồm hình cầu nhỏ, hình lặp lại Ủ nhiệt độ 37°C ghi nhận chiều cao ovan lớn, hình ovan nhỏ, hình elip dài, hình elip cột khí CO2 sinh chng Durham úp ngắn hình elip nhọn thể Bảng Bảng Đặc điểm hình thái tế bào nấm men phân lập từ trái giác Nhóm Chủng nấm men Nhóm CM1.1, CM1.2, ST1.3 Nhóm CM2.2, CM3.1, CM4.2, BL1.2, BL2.2, ST1.2, BT1.3, BT2.1, BT3.2, BT3.3, TV1.2, TV4.4 Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 Tế bào nấm men Hình dạng, kích kính hiển vi vật kính thước (µm) tế bào X100 Hình cầu nhỏ; 3,71-3,98 Hình ovan lớn; (9,4-10,82) x (7,40-7,99) Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 58 Tế bào nấm men Hình dạng, kích Nhóm Chủng nấm men kính hiển vi vật kính thước (µm) tế bào X100 Nhóm CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.1, Hình ovan nhỏ; CM4.3, BL1.1, BL2.1, BL2.3, BL3.1 (3,71-4,20) x BL4.3, ST2.1 ST2.3, ST3.1, ST4.3, BT1.2 (2,86-3,42) BT3.1, TV2.1, TV2.2, TV3.2, TV4.2 Nhóm CM4.4, BL3.2, ST3.3, BT1.1, TV2.3, TV3.1, TV4.1 Hình elip dài; (6,84-10,77) x (3,93-4,57) Nhóm BL4.2, ST1.1, ST2.2, BT4.2 Hình elip ngắn; (2,86-3,13) x (1,15-1,42) Nhóm BL4.1, ST3.2, ST4.1, ST4.2, BT2.2, BT4.1, Hình elip nhọn; TV1.1, TV4.3 (4,28-4,57) x (1,71-2,27) Phân loại mức độ giống chủng nấm men phân lập Đặc điểm nẩy chồi: Quan sát hình thức tế bào nẩy chồi 55 chủng nấm men với đại diện nhóm hình dạng, kết có hai hình thức nẩy chồi nẩy chồi nhiều hướng nẩy chồi lưỡng cực Tế bào nẩy chồi nhiều hướng gồm hình dạng: nhóm nấm men có hình cầu nhỏ (CM1.1, CM1.2 ST1.3), nhóm nấm men có hình ovan lớn (CM2.2, CM3.1, CM4.2, BL1.2, BL2.2, ST1.2, BT1.3, BT2.1, BT3.2, BT3.3, TV1.2, TV4.4), nhóm nấm men có hình ovan nhỏ (CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.1, CM4.3, BL1.1, BL2.1, BL2.3, BL3.1 BL4.3, ST2.1 ST2.3, ST3.1, ST4.3, BT1.2 BT3.1, TV2.1, TV2.2, TV3.2, TV4.2), nhóm hình elip dài (CM4.4, BL3.2, ST3.3, BT1.1, TV2.3, TV3.1, TV4.1) nhóm hình elip ngắn (BL4.2, ST1.1, ST2.2, BT4.2) Tế bào nảy chồi lưỡng cực gồm nhóm nấm men nhóm nấm men hình elip nhọn (BL4.1, ST3.2, ST4.1, ST4.2, BT2.2, BT4.1, TV1.1 TV4.3) Khả tạo bào tử mơi trường thạch nước: Kết cho thấy nhóm nấm men hình thành bào tử mơi trường nghèo dinh dưỡng gồm: nhóm nấm men hình cầu nhỏ tế bào xuất 1-2 bào tử hình tròn, nhóm hình ovan lớn tế bào xuất 1-2 bào tử hình tròn, Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 nhóm hình ovan nhỏ tế bào xuất 1-2 bào tử hình tròn, nhóm hình elip dài tế bào xuất 1-3 bào tử hình tròn, nhóm hình elip ngắn tế bào xuất 1-3 bào tử hình tròn nhóm nấm men hình elip nhọn tế bào không xuất bào tử Khả lên men đường glucose, saccharose, maltose: Kết đánh giá khả lên men loại đường khác thơng qua hình thành bọt khí chng Durham cho thấy hầu hết chủng nấm men phân lập có khả lên men chuyển hóa glucose thành ethanol, số chủng có khả lên men đường saccharose có chủng có khả lên men đường maltose sau 48 Các chủng nấm men thuộc nhóm hình cầu hình ovan có khả chuyển hóa loại đường (glucose, saccharose maltose) thành ethanol Đối với chủng nấm men hình elip, đa số lên men chuyển hóa đường glucose không lên men loại đường lại Khả đồng hóa urea gelatin: Kết sau ngày ủ 30°C, tất chủng nấm men thuộc nhóm hình cầu nhỏ, nhóm hình ovan lớn, nhóm ovan nhỏ, nhóm hình elip nhọn số chủng nấm men nhóm hình elip dài (CM4.4, BL3.2, BT1.1, TV2.3 TV3.1) Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 59 khơng có khả phân giải urea (Bảng 2) Sáu chủng nấm men, chủng thuộc nhóm hình elip ngắn (BL4.2, ST1.1, ST2.2 BT4.2) chủng nấm men thuộc nhóm hình elip dài (ST3.3 TV4.1) có khả đồng hóa urea phân giải thành CO2 NH3 Bảng Tổng hợp đặc điểm hình thái sinh lý các chủng nấm men phân lập Đặc điểm hình thái Hình Kiểu Đặc Chủng nấm men dạng nẩy điểm nấm men chồi bào tử CM1.1, CM1.2 ST1.3 1-2 bào Nhiều Cầu nhỏ tử hình hướng tròn Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khả lên Phân Phân men đường giải giải Glu Sac Mal urea gelatin + + + - - Giống (phân loại sơ bộ) Saccharomyces CM2.2, CM3.1, CM4.2, BL1.2, 1-4 bào BL2.2, ST1.2, Nhiều Ovan lớn tử hình + + + Saccharomyces BT1.3, BT2.1, hướng tròn BT3.2, BT3.3, TV1.2, TV4.4 CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.1, CM4.3, BL1.1, BL2.1, BL2.3, BL3.1 1-2 bào Nhiều BL4.3, ST2.1 Ovan nhỏ tử hình + + + Saccharomyces hướng ST2.3, ST3.1, tròn ST4.3, BT1.2 BT3.1, TV2.1, TV2.2, TV3.2, TV4.2 CM4.4, BL3.2, 1-3 bào Nhiều BT1.1, TV2.3, Elip dài tử hình + Candida hướng TV3.1 tròn 1-3 bào Nhiều ST3.3, TV4.1 Elip dài tử hình + + Pichia hướng tròn 1-3 bào BL4.2, ST1.1, Nhiều Elip ngắn tử hình + + + Pichia ST2.2, BT4.2 hướng tròn BL4.1, ST3.2, Không ST4.1 ST4.2, Lưỡng Elip nhọn tạo bào + Candida BT2.2, BT4.1, cực tử TV1.1, TV4.3 Ghi chú: Glu, glucose; Sac, saccharose; Mal, maltose; “-”, âm tính “+” dương tính Có thể nói có chủng nấm men số chủng phân lập có chứa enzyme urease hầu hết chúng thuộc nhóm nấm men có dạng hình elip ngắn elip dài Nấm men khơng có Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 hoạt tính phân giải protein mạnh Tuy nhiên, mơi trường giàu gelatin, chủng nấm men có khả tiết enzyme gelatinase protease có khả phân giải gelatin Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 60 (Kurztman ctv, 2011) Những chủng nấm men cho có enzyme phân giải gelatin có phản ứng dương tính, làm mơi trường hóa lỏng 4°C Kết tổng hợp Bảng cho thấy có chủng nấm men có hoạt tính phân giải gelatin, chủng nấm men thuộc nhóm hình elip dài (ST3.3 TV4.1) nhóm hình elip ngắn (ST1.1, ST2.2 BT4.2) Các chủng nấm men lại khơng có khả phân giải gelatin Khả chịu nhiệt chủng nấm men Tất 55 chủng nấm men phân lập phát triển nhiệt độ 30 35°C sau 48 nuôi cấy (Hình 1) Ngoại trừ chủng ST3.3, BT4.1 TV1.1, 52 chủng nấm men lại có khả phát triển mức 37°C cao Ở 39°C, có 38 chủng có khả phát triển, nhiên tăng đến 41°C, có 20 chủng có khả phát triển Ở nhiệt độ 43°C, chủng có khả phát triển tăng đến nhiệt độ 45°C chủng BT2.1 phát triển thành CM3.2 BL2.1 BT2.1 TV4.4 BT2.1 Kết cho thấy chủng nấm men phân lập phần lớn có khả chịu nhiệt tốt (94,5% chủng nấm men phân lập chịu nhiệt độ từ 37°C trở lên) Trong số chủng nấm men có khả chịu nhiệt độ cao phần lớn thuộc giống Saccharomyces Các chủng nấm men chịu nhiệt phát triển mức nhiệt độ từ 35°C trở xuống chủ yếu thuộc nhóm Candida Pichia Kết chọn 52 chủng nấm men, ngoại trừ chủng ST3.3, BT4.1 TV1.1, có khả sinh trưởng nhiệt độ từ 37°C trở lên để đánh giá khả chịu ethanol BL2.1 CM3.2 CM3.2 30°C khuẩn lạc Đến mức nhiệt độ khảo sát 47°C khơng có chủng nấm men phân lập sống phát triển Khi nhiệt độ tăng cao làm ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng lên men nấm men Kết khả chịu nhiệt tương đồng với số cơng trình cơng bố gần nấm men chịu nhiệt phân lập từ đất, ca cao, trái cây, phụ phẩm nông nghiệp, (Dung ctv, 2012; Nuanpeng ctv, 2016; Phong ctv, 2016; Techaparin ctv, 2017) TV4.4 TV4.4 BT2.1 35°C BL2.1 CM3.2 BL2.1 CM3.2 BT2.1 TV4.4 BT2.1 TV4.4 43°C BT2.1 45°C BL2.1 TV4.4 BT2.1 37°C CM3.2 41°C BL2.1 CM3.2 39°C BL2.1 CM3.2 BL2.1 TV4.4 BT2.1 TV4.4 47°C Hình Khuẩn lạc nấm men phát triển môi trường YPD nhiệt độ khác Khả chịu ethanol chủng nấm men Năm mươi hai chủng nấm men chịu nhiệt nuôi cấy 48 37°C mơi trường có bổ sung ethanol 3, 6, 9, 12 15% kết Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 phát triển nồng độ ethanol minh họa Hình Ở mức 3% (v/v) ethanol, tất chủng nấm men khảo sát phát triển tốt; tăng nồng độ lên 6%, có 41 chủng nấm men phát triển thành khuẩn lạc Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 61 mức 9% có 19 chủng phát triển Tuy nhiên, tăng nồng độ ethanol lên 12%, có chủng phát triển hình thành khuẩn lạc mơi trường YPD, có chủng phát triển mạnh CM3.3 BT3.3, chủng TV4.2 phát triển yếu Ở mức 15% ethanol khơng có chủng nấm men sống phát triển thành khuẩn lạc Kết tương tự công bố Nguyễn Hữu Tường ctv (2013) Phong ctv (2016) đánh giá khả chịu ethanol nấm men chịu nhiệt Nhìn chung, chủng nấm men phân lập từ dịch trái giác có khả chịu cồn mức trung bình, có khoảng 34,5% (19 chủng) có khả chịu cồn mức 9% (v/v) ethanol Trong số chủng nấm men có khả chịu cồn tốt, hầu hết thuộc nhóm Saccharomyces Từ kết khảo sát khả chịu nhiệt chịu ethanol, tuyển chọn 19 chủng (CM1.1, CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.2, CM4.3, CM4.4, BL2.1, BL4.3, ST1.1, ST1.3, ST2.1, ST4.3, BT1.2, BT2.1, BT3.1, BT3.3 TV4.2) có khả chịu nhiệt từ 37°C chịu ethanol từ 9% (v/v) trở lên để đánh giá khả lên men dịch trái giác CM3.2 BL2.1 CM3.2 BL2.1 CM3.2 BL2.1 BT3.3 TV4.2 BT3.3 TV4.2 BT3.3 TV4.2 0% 3% CM3.2 BL2.1 CM3.2 BL2.1 BT3.3 TV4.2 BT3.3 TV4.2 9% 12% 6% CM3.2 BL2.1 BT3.3 TV4.2 15% Hình Khuẩn lạc nấm men phát triển môi trường YPD bổ sung ethanol nồng độ (% v/v) khác Đánh giá sơ khả lên men dịch trái giác Trong trình lên men rượu có hai sản phẩm ethanol CO2, để xác định hoạt lực lên men nấm men dựa khả khí CO2 trình lên men (Nguyễn Đức Lượng ctv, 2003) Chiều cao cột khí sinh ống Durham tăng theo thời gian, chủng nấm men khác có chiều cao cột khí CO2 sinh khác (Bảng 3) Cụ thể, sau lên men, có chủng làm đầy cột khí ống Durham nhanh CM2.1, CM3.2, CM4.2, BL2.1, BL4.3, ST2.1 BT1.2 Ba chủng CM1.1, CM2.1 ST1.3 có khả làm đầy cột khí (30,0 mm) sau 12 lên men Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 Sau 18 lên men, có thêm chủng làm cột khí (BT2.1 BT3.3) chủng CM1.3, CM3.3, CM4.3, BT3.1 TV4.2 24 để làm đầy cột khí ống Durham Sau 30 giờ, hầu hết chủng nấm men sinh khí chiếm đầy thể tích ống Durham (trừ chủng ST1.1) Chủng nấm men ST1.1 có thời gian làm đầy cột khí chậm, cụ thể thời gian từ 3648 chiều cao cột khí ST1.1 không thay đổi, sau 36 lên men chủng nấm men ngừng làm tăng lượng khí CO2 sinh Tuy nhiên, chiều cao ống Durham tối đa có 30 mm nên khơng thể đánh giá xác khả lên men chủng nấm men trung bình chiều cao cột khí Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 62 đạt mức tối đa Do đó, phải tiến hành lên men bình tam giác, chủng nấm men có thời gian lên men dài hơn, giúp cho việc đánh giá chủng nấm men có hoạt tính lên men tốt cách xác Từ kết thí nghiệm thí nghiệm trên, tuyển chọn chủng nấm men có khả chịu nhiệt từ 37oC trở lên, chịu ethanol từ 9% trở lên lên men tốt (có khả sinh khí chiếm đầy thể tích chuông Durham 30 mm 48 giờ) để tiến hành thử nghiệm khả lên men rượu vang trái giác Như vậy, 18 chủng nấm men (CM1.1, CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.2, CM4.3, CM4.4, BL2.1, BL4.3, ST1.3, ST2.1, ST4.3, BT1.2, BT2.1, BT3.1, BT3.3 TV4.2) chọn cho thử nghiệm này, chủng thuộc giống Saccharomyces Bảng Chiều cao cột khí CO2 (mm) chng Durham sau 48 lên men Thời gian lên men dịch trái giác (giờ) 12 18 24 30 36 42 48 CM1.1 13,0 30,0 CM1.3 9,33 23,3 29,3 30,0 CM2.1 17,3 30,0 CM3.2 30,00 CM3.3 9,33 15,7 19,0 30,0 CM4.2 30,0 CM4.3 2,33 4,67 25,3 30,0 CM4.4 0,0 5,67 7,33 15,7 19,0 30,0 BL2.1 30,0 10 BL4.3 30,0 11 ST1.1 5,00 10,0 11,7 16,7 19,3 23,3 23,3 23,3 12 ST1.3 27,3 30,0 13 ST2.1 30,0 14 ST4.3 1,33 4,00 7,33 17,7 30,0 15 BT1.2 30,0 16 BT2.1 7,33 10,0 30,0 17 BT3.1 6,00 10,3 15,0 30,0 18 BT3.3 8,00 18,7 30,0 19 TV4.2 5,33 11,3 28,3 30,0 Ghi chú: “-”: chiều cao cột khí chng Durham đạt mức tối đa 30 mm Giá trị ghi bảng giá trị trung bình lần lặp lại Stt Chủng nấm men Khả lên men rượu vang trái giác Khả lên men khảo sát với mật độ nấm men 107 tế bào/mL ngày 37oC, dịch ép điều chỉnh pH 4,5 22oBrix Kết khảo sát khả lên men 18 chủng nấm men 100 mL dịch trái giác thể Bảng Sau lên men, pH Brix nghiệm thức giảm nấm men sử dụng đường làm nguồn carbon Hàm lượng ethanol tiêu quan trọng để Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 đánh giá khả lên men rượu chủng nấm men Kết thống kê từ Bảng cho thấy, 18 chủng nấm men lên men rượu vang trái giác hàm lượng ethanol trung bình sau lên men cao chủng CM3.2 (8,95% v/v), chủng CM3.3 (7,01% v/v) BT1.2 (6,79% v/v) Các chủng nấm men (CM1.1, ST1.3 BT3.1) có độ rượu sinh thấp khoảng từ 3,19-3,79% (v/v) Kết hợp so sánh với kết đo chiều cao cột khí CO2 ống Durham (Bảng 3) dung Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 63 dịch đường glucose dịch trái giác, chủng CM1.1, CM4.3, BL4.3 ST1.3 có thời gian làm đầy cột khí ống Durham nhanh (sau 12-18 giờ) hàm lượng ethanol sau lên men lại thấp (chỉ từ 3,65-4,58% v/v), chủng CM3.3, CM4.4 BT2.2 thời gian làm đầy cột khí ống Durham lâu (2436 giờ) hàm lượng ethanol sau lên men lại cao nhiều (6,61-7,01% v/v) Có thể giải thích thời gian thí nghiệm ống Durham ngắn, chủng nấm men CM1.1, CM4.3, BL4.3 ST1.3 ban đầu tốc độ lên men nhanh tạo lượng CO2 trình lên men lại kết thúc sớm Ngược lại, số chủng nấm men (như CM3.3, CM4.4 BT2.2) lên men chậm thời gian lên men kéo dài nên có khả tạo lượng ethanol cao Bảng Kết khả lên men chủng nấm men Hàm lượng ethanol (% v/v 20oC) CM1.1 3,41 15,7 3,79 ± 0,24i CM1.3 3,44 16,3 4,88 ± 0,13fg CM2.1 3,43 16,0 5,02 ± 0,12f CM3.2 3,52 11,0 8,95 ± 0,40a CM3.3 3,35 15,0 7,01 ± 0,38b CM4.2 3,49 17,3 5,02 ± 0,12f CM4.3 3,34 14,7 4,50 ± 0,10h CM4.4 3,33 14,3 6,56 ± 0,01cd BL2.1 3,32 14,0 6,61 ± 0,11cd 10 BL4.3 3,46 16,3 4,58 ± 0,13gh 11 ST1.3 3,49 17,7 3,65 ± 0,13i 12 ST2.1 3,34 14,0 6,48 ± 0,27cd 13 ST4.3 3,40 16,7 4,65 ± 0,13gh 14 BT1.2 3,34 14,7 6,79 ± 0,02bc 15 BT2.1 3,35 14,7 6,09 ± 0,01e 16 BT3.1 3,46 17,7 3,19 ± 0,15j 17 BT3.3 3,38 15,0 6,09 ± 0,02e 18 TV4.2 3,40 16,0 6,32 ± 0,40de Các giá trị trung bình lần lặp lại Các ký hiệu số liệu giống khơng khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy 95% Stt Chủng nấm men pH sau lên men Độ Brix sau lên men Từ thí nghiệm trên, thấy chủng nấm men Saccharomyces sp CM3.2 có nhiều đặc điểm vượt trội khả chịu nhiệt cao (43°C), thời gian làm đầy cột khí ống Durham sớm đạt 30 mm (6 dịch đường glucose 2% (w/v) dịch trái giác 22°Brix) tạo hàm lượng ethanol cao (8,95% v/v) chủng nấm men phân lập Do đó, chủng nấm men Sacchromyces sp CM3.2 chủng có khả lên men cao tuyển chọn để thử nghiệm ứng dụng lên men men rượu vang trái giác Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 KẾT LUẬN Kết phân lập 55 chủng nấm men chủng từ 20 mẫu nguyên liệu trái giác thu thập tỉnh thuộc vùng đất mặn ven biển vùng Đồng Sông Cửu Long (Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre Trà Vinh) Các chủng nấm men phân lập phân loại thuộc giống bao gồm Saccharomyces, Pichia Candida Tuyển chọn 19 chủng nấm men (CM1.1, CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.2, CM4.3, CM4.4, BL2.1, BL4.3, ST1.1, ST1.3, ST2.1, ST4.3, BT1.2, BT2.1, BT3.1, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 64 BT3.3 TV4.2) có khả chịu nhiệt khoảng 37-45°C chịu ethanol mức 9-12% (v/v), chủng Saccharomyces sp CM3.2 tuyển chọn lên men dịch trái giác 37°C với hàm lượng ethanol đạt 8,95% (v/v) LỜI CẢM ƠN Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn hỗ trợ phần kinh phí từ Chương trình CCP (Core-to-Core Program, 2014-2019) TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Ái, 2005 Công nghệ lên men ứng dụng Công nghệ thực phẩm Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh: 220227 Dung N.T.P., Thanonkeo P., and Phong H.X., 2012 Screening useful isolated yeasts for ethanol fermentation at high temperature International Journal of Applied Science and Technology 2(4): 65-71 Gupta A.K., Shamar M., 2007 Review on Indian Medical Plant New Delhi: Indian Council of Medical Research 7: 879-882 Kumar D., Kumar S., Gupta J. Arya R., and Gupta A 2011 A review on chemical and biological properties of Cayratia trifolia Linn (Vitaceae) Pharmacognosy Reviews 10: 184-188 Kurtzman C.P., Fell J.W., Boekhout T., and Robert V., 2011 Methods for isolation, phenotypic characterization and maintenance of yeasts In C P Kurtzman, J W Fell, & T Boekhout (Eds.), The Yeasts, a Taxonomic Study (5th ed., Vol 1) San Diego: Elsevier B.V: 87-110 Limtong S., Sringiew C., and Yongmanitchai W., 2007 Production of fuel ethanol at high temperature from sugar cane juice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus Bioresource Technology 98: 3367-3374 Lương Đức Phẩm 2006 Nấm men công nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 9-18, 56-60 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 2-Thí nghiệm vi sinh vật hoc Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2018 Chí Minh: 260-291 Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng, 2005 Cơng nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 67-70 Nguyễn Hữu Tường, Phạm Hồng Quang, Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Minh Đời, 2013 Thử nghiệm lên men ethanol nhiệt độ cao nấm men chịu nhiệt Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 27: 17-23 Nuanpeng S., Thanonkeo S., Yamada M., and Thanonkeo P (2016) Ethanol production from sweet sorghum juice at high temperatures using a newly isolated thermotolerant yeast Saccharomyces cerevisiae DBKKU Y-53 Energies 9(4): 253 Perumal P.C., Sowmya S., Pratibha P., Vidya B., Anusooriya P., Starlin T., Ravi S., and Gopalakrishnan V.K., 2015 Isolation, structural characterization and in silico druglike properties prediction of a natural compound from the ethanolic extract of Cayratia trifolia (L.) Pharmacognosy Reviews 7(1): 121-125 Phong H X., Giang N.T.C., Nitiyon S., Yamada M., Thanonkeo P., & Dung N.T.P (2016) Ethanol production from molasses at high temperature by thermotolerant yeasts isolated from cocoa Can Tho University Journal of Science 3: 32-37 Roehr M., (2001) The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications Federal Republic of Germany: 203-210 Techaparin A., Thanonkeo P., & Klanrit P., 2017 High-temperature ethanol production using thermotolerant yeast newly isolated from Greater Mekong Subregion Brazilian Journal of Microbiology 48(3): 461-475 Yuangsaard N., Yongmanitchai W., Yamada M., & Limtong S., 2013 Selection and characterization of a newly isolated thermotolerant Pichia kudriavzevii strain for ethanol production at high temperature from cassava starch hydrolysate Antonie van Leeuwenhoek 103(3): 577-588 Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh ... trình nghiên cứu lựa chọn trái giác làm ngun liệu lên men rượu vang, đặc biệt việc kết hợp sử dụng nấm men chịu nhiệt để hỗ trợ q trình lên men hạn chế Giác (Cayratia trifolia L.) là một loại... BT2.1 Kết cho thấy chủng nấm men phân lập phần lớn có khả chịu nhiệt tốt (94,5% chủng nấm men phân lập chịu nhiệt độ từ 37°C trở lên) Trong số chủng nấm men có khả chịu nhiệt độ cao phần lớn thuộc... trái giác 22°Brix) tạo hàm lượng ethanol cao (8,95% v/v) chủng nấm men phân lập Do đó, chủng nấm men Sacchromyces sp CM3.2 chủng có khả lên men cao tuyển chọn để thử nghiệm ứng dụng lên men men