Nghiêng cứu chế tạo nano sắt từ oxit gắn kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt viêm gan b ứng dụng tìm kháng nguyên bề mặt viêm gan b trong huyết thanh bệnh nhân

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO Fe3O4 GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIÊM GAN B (Anti-HBS) – ỨNG DỤNG TÌM KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIÊM GAN B (HBsAg) TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN Thực hiện: Bùi Trung Thành Tháng / Năm 2017 Mở đầu Thực nghiệm Kết bàn luận Kết luận hướng phát triển J Gao, et al., Acc Chem Res 2009 42:1097 33R23R  Ứng dụng y sinh: hạt nano phải gắn kết với phân tử sinh học Chế tạo hạt nano Chức hóa Cố định phân tử sinh học Và, ứng dụng Phân tử sinh học : nhiều cấu trúc, giá thành  Streptavidin (SA) giải pháp SA có giá thành thấp có bốn vị trí liên kết biotin Sự tương tác SA-biotin [www://streptavidin-biotin] + Hạt nano gắn với kháng thể thông qua cầu nối SA-Biotin Gắn kháng thể lên hạt nano Xét nghiệm miễn dịch dùng hạt nano a) [http://blog.leinco.com/, Leinco Technologies 2010] Tổng hợp hạt nano Fe3O4 – Anti-HBs Phương pháp solvothermal (Fe3O4) Chức hóa bề mặt (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO) Gắn kháng thể anti-HBs biotin (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA/Anti-HBs) Gắn streptavidin (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA) Thực nghiệm tổng hợp hạt nano gắn kháng thể Xét nghiệm tìm HBsAg - Cho vào tube Eppendorf 100 µL Fe3O4/anti-HBs - Mẫu huyết - 25 µL dung dịch anti-HBs/HRPO - Trộn ủ hỗn hợp dung dịch 30 phút 37 o C - Rửa hỗn hợp dung dịch hai lần tách nam châm - 100 µL dung dịch TMB - Sau phút thêm 100 µL dung dịch dừng phản ứng - Dùng nam châm tách hạt nano - Lấy dịch đo độ hấp thu (OD) Vật liệu - gắn streptavidin XRD: Fe3O4 TEM: Fe3O4 TEM: Fe3O4/SiO2 100 80 60 a) Fe3O4 b) Fe3O4/SiO2 40 -20 -40 VSM -60 -80 b) a) -100 -15000 -10000 -5000 5000 10000 15000 H, Oe c) Fe3O4/SiO2/NH2 2875 1627 1402 2933 3384 Sự phát huỳnh quang 801 956 572 471 Transmittance M, emu/g 20 1095 b) Fe3O4/SiO2 Chế tạo hạt nano Fe3O4 Gắn streptavidin a) Fe3O4 FTIR 4000 3500 3000 2500 2000 1500 Wave number, cm-1 1000 500 Hạt nano tóm bắt anti-HBs [C Louis, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 1964 106:1 SA11] Hạt nano tóm bắt anti-HBs Xét nghiệm miễn dịch Độ hấp thu lượng mẫu với nhiều nồng độ HBsAg Lượng mẫu khác lượng HBsAg - Lượng mẫu tăng lần, độ hấp thu tăng lần - Đã làm giàu, tăng độ nhạy Xét nghiệm miễn dịch Giá trị cắt [J.R Crowther, Humana Press 2009.E4B\] Ngưỡng phát mẫu dương âm tính với HBsAg [SAG1ULTRA.CE, DIA.PRO Diagnostic Bioprobes Srl (Italy) 2012.1HBsAg Elisa kit] Xét nghiệm miễn dịch Kết xét nghiệm HBsAg phương pháp dùng hạt nano Độ nhạy: 199/203 = 98 % Độ đặc hiệu: 188/194 = 97 % Độ phù hợp: (199 + 188)/(203 + 194) = 97.5 % Xây dựng tảng kỹ thuật mới: - Có thể làm giàu kháng nguyên đặc hiệu - Thời gian xét nghiệm rút ngắn - Hạt nano gắn kháng thể dễ bảo quản giếng ELISA - Mở rộng cho phát vi sinh vật khác Tài liệu tham khảo 1.Bozza C., Cinausero M., Iacono D., and Puglisi F (2016) Hepatitis B and cancer: A practical guide for the oncologist Critical reviews in oncology/hematology, 98: 137-146 2.Brechot C., Kremsdorf D., Soussan P., Pineau P., et al (2010) Hepatitis B virus (HBV)-related hepatocellular carcinoma (HCC): molecular mechanisms and novel paradigms Pathologie-biologie, 58: 278-287 3.Chaleawlert-umpon S and Pimpha N (2012) Preparation of magnetic polymer microspheres with reactive epoxide functional groups for direct immobilization of antibody Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 414: 66-74 4.Crowther J.R (2009) The ELISA Guidebook Humana Press 5.Deng H., Li X., Peng Q., Wang X., et al (2005) Monodisperse Magnetic Single-Crystal Ferrite Microspheres Angewandte Chemie, 117: 2842-2845 6.Girginova P.I., Daniel-da-Silva A.L., Lopes C.B., Figueira P., et al (2010) Silica coated magnetite particles for magnetic removal of Hg 2+ from water Journal of colloid and interface science, 345: 234-240 7.Häfeli U., Schütt W., Teller J., and Zborowski M (1997) Scientific and clinical applications of magnetic carriers Plenum Press, New York 8.Hou Y., Han X., Chen J., Li Z., et al (2013) Isolation of PCR-ready genomic DNA from aspergillus niger cells with Fe3O4/SiO2 microspheres Separation and Purification Technology, 116: 101-106 9.Hu B., Pan J., Yu H.-L., Liu J.-W., et al (2009) Immobilization of Serratia marcescens lipase onto amino-functionalized magnetic nanoparticles for repeated use in enzymatic synthesis of Diltiazem intermediate Process Biochemistry, 44: 1019-1024 10.Jamin N., Dumas P., Moncuit J., Fridman W.-H., et al (1998) Highly resolved chemical imaging of living cells by using synchrotron infrared microspectrometry Proc Natl Acad Sci., 95: 4837–4840 11.Khatiri R., Reyhani A., Mortazavi S.Z., and Hossainalipour M (2013) Immobilization of serum albumin on the synthesized three layers core–shell structures of super-paramagnetic iron oxide nanoparticles Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 19: 1642-1647 12.Liu X., Ma Z., Xing J., and Liu H (2004) Preparation and characterization of amino–silane modified superparamagnetic silica nanospheres Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 270: 1-6 13.Louis C and Prank J.W (1964) The Properties of Streptavidin, a Biotin-Binding Protein Produced by Streptomycefes Archives of Biochemistry and Biophysics, 106: 1-5 14.Lubbe A.S., Alexiou C., and Bergemann C (2001) Clinical applications of magnetic drug targeting The Journal of surgical research, 95: 200-206 15.SAG1ULTRA.CE (2012) HBsAgone Version ULTRA DIA.PRO Diagnostic Bioprobes Srl (Italy): 1-9 16.Stober W and Fink A (1968) Controlled Growth of Monodisperse Silica Spheres in the Micron Size Range Journal of colloid and interface science, 26: 62-69 17.Wang B., Wei Q., and Qu S (2013) Synthesis and Characterization of Uniform and Crystalline Magnetite Nanoparticles via Oxidationprecipitation and Modified co-precipitation Methods Int J Electrochem Sci., 8: 3786 - 3793 18.Wu F.Y., Liao Y.W., Wu J.F., Chen H.L., et al (2016) A Simple and Rapid Test-card Method to Detect Hepatitis B Surface Antigen and Antibody: Potential Application in Young Children and Infants Pediatrics and neonatology, 57: 219-224 19.Yuen M.-F., Kato T., Mizokami M., Chan A.O.-O., et al (2003) Clinical outcome and virologic profiles of severe hepatitis B exacerbation due to YMDD mutations Journal of Hepatology, 39: 850-855  ... + Hạt nano gắn với kháng thể thông qua cầu nối SA-Biotin Gắn kháng thể lên hạt nano Xét nghiệm miễn dịch dùng hạt nano a) [http://blog.leinco.com/, Leinco Technologies 2010] Tổng hợp hạt nano. .. hợp hạt nano Fe3O4 – Anti-HBs Phương pháp solvothermal (Fe3O4) Chức hóa b mặt (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO) Gắn kháng thể anti-HBs biotin (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA/Anti-HBs) Gắn streptavidin (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA)... (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA) Thực nghiệm tổng hợp hạt nano gắn kháng thể Xét nghiệm tìm HBsAg - Cho vào tube Eppendorf 100 µL Fe3O4/anti-HBs - Mẫu huyết - 25 µL dung dịch anti-HBs/HRPO - Trộn ủ hỗn hợp dung dịch