Đề tài ỨNG DỤNG ISNULIN TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Header Page of 113 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA: MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN BÀI TIỂU LUẬN Chuyên đề: GVHD:Th.S Nguyễn Ngọc Tâm Huyên Tên nhóm: Trần Thị Kim Ngân MSV 10149122 Nguyễn Thị Hồng Nhung MSV 10149137 Trịnh Bửu Hồng Phương MSV 10149152 Cao Thị Thanh Thảo MSV 10149176 Đinh Thị Cẩm Thu MSV 10149190 Phan Thị Ngọc Tuyền MSV 10149236 TP.HCM, tháng năm 2011 Footer Page of 113 Header Page of 113 MỤC LỤC Khái quát 1.1 Sơ lược bệnh tiểu đường 1.2 Sơ lược Insulin 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Cấu tạo 1.2.3 Phân loại 1.2.4 Cơ chế Quy trình sản xuất Insulin 2.1 Quy trình sản xuất Insulin trước 2.1.1 Đặc điểm 2.1.2 Nhược điểm 2.2 Quy trình sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để sản xuất Insulin 2.2.1 Khái quát quy trình công nghệ ADN tái tổ hợp 2.2.1.1 Phân lập 2.2.1.2 Tạo vector tái tổ hợp 2.2.1.3 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào 2.2.1.4 Chọn lọc, tạo dòng biểu gen 10 2.2.2 Ý nghĩa sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp sản xuất Insulin 11 2.2.3 Quy trình sản xuất Insulin công nghệ ADN 11 2.2.3.1 Phương pháp 11 2.2.3.2 Phương pháp 14 2.2.4 Các phương pháp sản xuất Insulin khác 15 Ưu nhược điểm Insulin 17 Nguyên tắc dử dụng bảo quản Insulin 19 4.1 Nguyên tắc sử dụng 19 4.2 Bảo quản Insulin 19 5.Kết luận kiến nghị 20 Tài liệu tham khảo 21 Footer Page of 113 Header Page of 113 Như bạn biết vi sinh vật sinh vật vô nhỏ bé trông thấy mắt thường Tuy nhỏ, chúng lại có ảnh hưởng vô to lớn đến đời sống Với phát triển bước ngành vi sinh vật học, sinh học phân tử di truyền học, nhà vi sinh vật học y học nghiên cứu, nuôi sống giữ gìn vi sinh vật có ích điều kiện tối ưu, nhằm lợi dụng hoạt động có ý nghĩa để tạo chế phẩm có ích như: vacxin, kháng sinh, hoocmon,…giúp phòng điều trị bệnh cho người Ngày xưa ngày nay,có bệnh có lịch sử lâu đời, phổ biến gây khó khăn,trở ngại cho việc điều trị dược phẩm hoá học, có bệnh tiểu đường.Vậy có biện pháp khác giúp đỡ bệnh nhân này? Câu trả lời vi sinh vật Đối với bệnh tiểu đường, người ta dùng loại vi sinh vật để điều trị Insulin.Câu hỏi đặt Insulin co tác dụng gì, với ưu nhược điểm Sau đây,chúng ta bước vào tìm hiểu vấn đề nha!  Footer Page of 113 Header Page of 113 GIỚI THIỆU CHUNG Insulin nhà sinh lý học người Canada Fred Banting Charles Best tìm năm 1921 Quá trình nghiên cứu sản xuất insulin có đóng góp quan trọng chó Banting Best cắt bỏ tuyến tụy chó hậu chúng bị đái tháo đường Họ cố gắng tinh chiết hormone hóa học từ tụy chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan Sau đó, chất tiêm vào chó bị đái tháo đường để thử nghiệm họ nhận thấy bệnh đái tháo đường bị đẩy lùi Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất thường gây tai biến nguy hiểm, đội ngũ nhà khoa học phối hợp nghiên cứu tạo tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết để thử nghiệm người bệnh Vào 11 tháng năm 1922, Leonard Thomson-14 tuổi điều trị thành công bệnh viện Toronto tinh chất (insulin) Ông sống đến ngày 20 tháng năm 1935, thọ 27 tuổi (sau 13 năm tháng tiêm insulin) Collip MacLeod người dùng chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan (Insulin) để tiêm cho Leonard Thomson Toronto (Canada) sau Banting Best chiết suất vài ngày Năm 1928, Oskar Wintersteiner chứng minh insulin protein Năm 1955, Frederick Sanger-người đoạt giải Nobel tìm chuỗi axit amin insulin người Điều cho phép nhà khoa học tạo gene insulin, dùng để tạo chủng vi khuẩn biến đổi di truyền có khả sinh số lượng lớn insulin với độ tinh khiết cao Insulin người sản xuất kỹ thuật di truyền Công ty Genetech (Hoa Kỳ) sản phẩm đưa thị trường vào năm 1982 Trong lịch sử, lần nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công Footer Page of 113 Header Page of 113 MỘT SỐ VI SINH VẬT TRONG ĐỜI SỐNG KHÁI QUÁT: 1.1 Sơ lược bệnh tiểu đường: -Tiểu đường dạng bệnh rối loạn chuyển hóa carbon hydrate hormone insulin tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu cao -Bệnh tiểu đường bệnh chính: bệnh tiểu đường loại tụy không tiết insulin, loại tiết giảm insulin đề kháng insulin -Biểu hiện: gia đoạn phát sinh, người bệnh thường tiểu nhiều, tiểu vào ban đêm kèm theo chứng khô miệng, khát nước -Nguyên nhân phát sinh bệnh: insulin tiết thiếu không đủ tế bào có tính mẫn cảm với insulin giảm thấp, dẫn tới rối loạn trình trao đổi đường, nước, chất béo chất điện giảm thể 1.2 Sơ lược Insulin: 1.2.1 Nguồn gốc: - Insulin hormon quan trọng, giúp thể hấp thu glucose - thành phần cung cấp lượng cho người - Nguồn gốc insulin: Từ nguồn gốc động vật  Từ tụy bò hay lợn Ngày nay, insulin tinh chế phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa cao  Insulin người - Được sản xuất từ insulin động vật qua phương pháp: Bán tổng hợp từ insulin lợn Tái tổ hợp gen: loại insulin trung tính đơn thành phần, sản xuất kỹ thuật tái tổ hợp DNA, sử dụng nấm men làm thể sinh sản đạt đến độ tinh khiết hóa chất lượng cao nhất, có cấu trúc giống hệt insulin tự nhiên người, tạo kháng thể thời gian tác dụng ngắn Footer Page of 113 Header Page of 113 1.2.2 Cấu tạo: - Là protein gồm 51 aa tạo thành chuỗi polypeptid Ở hầu hết loài, chuỗi A gồm 21 aa, chuỗi B gồm 30 aa nối cầu nối SS(disulfua) - Trọng lượng phân tử khoảng :5800-6000 Dalton Cấu trúc phân tử insulin Hình Cấu trúc phân tử insulin Mặc dù trình tự aaxitamin khác loài số đoạn định phân tử có tính bảo tồn cao, đoạn có chứa cầu nối disulfua, hai đầu chuỗi A nhánh bên đầu COOH chuỗi B Sự tương đồng tình tự axitamin dẫn đến cấu trúc chiều Insulin loài khác giống Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao loài khác Footer Page of 113 Header Page of 113 CẤU TRÚC KHÔNG GIAN CỦA INSULIN 1.2.3 Phân loại: -Có loại insulin: Insulin có tác dung nhanh Insulin tác dụng bán chậm (trung bình) Insulin tác dụng chậm Insulin hốn hợp 1.2.4 Cơ chế: - Thời gian bán hủy 3-5 phút - Bị phá hủy đường tiêu hóa enzym proteinase dày - Hấp thu tốt đường tiêm Mức độ phụ thuộc vào nồng độ insulin, vị trí tiêm, độ sâu mũi tiêm, vận động - Insulin bị chuyển hóa gan, thận, Trong 50% gan - Đào thải qua thận QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN: 2.1 Quy trình sản xuất Insulin trước đây: 2.1.1 Đặc điểm quy trình: Sau hai nhà khoa học người Canada ( Frederick G Bantingvà Charles H Best )phát insulin vai trò chúng từ thí nghiệm chó, từ thập niên 1920 năm đầu thập niên 1980, insulin tạo cách cô lập từ tuyến tụy động vật heo bò Tuy nhiên, insulin người có khác biệt thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí chuỗi A vị trí chuỗi B) insulin heo (một vị trí chuỗi B) Do gây tác dụng không mong muốn (như dị ứng) sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo Footer Page of 113 Header Page of 113 hay bò Ngoài ra, trình sản xuất tinh insulin từ động vật gặp nhiều khó khăn Sau đó, phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo bò phát triển sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin Nhược điểm việc sản xuất Insulin dùng lâm sàng chủ yếu có nguồn gốc động vật ( bò lợn) Tụy động vật dùng để tách chiết insulin , cần lượng lớn tụy sản xuất lượng nhỏ insulin Việc insulin sản xuất trực tiếp từ tụy động vật thường có cấu trúc không hoàn toàn giống với insulin người, hoạt động chức thể so với insulin người , khả hấp thụ kém, gây phản ứng phụ Mặt khác trình tách chiết, loại bỏ hết đươc tác nhân gây bệnh động vật, trình tách chiết đòi hỏi kỷ thuật cao, chi phí đắt, sản xuất với qui mô rộng lớn, giá thành cao 2.1.2 Nhược điểm quy trình sản xuất Insulin chiết xuất từ động vật: - Insulin động vật (bò lợn) có cấu trúc không hoàn toàn giống cấu trúc Insulin người - Hoạt động chức thể so với insulin người’ - Khả hấp thụ - Có thể gây phản ứng miễn dịch thể người( gây dị ứng) - Trong trình tách chiết, không loại bỏ hết tác nhân gây bệnh từ đông vật - Quá trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao - Chi phí đắt (do cần lượng lớn tụy để sản xuất insulin) -Không thể sản xuất lượng lớn quy mô lớn -Giá thành cao 2.2 Quy trình sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất Insulin: 2.2.1 Khái quát công nghệ AND tái tổ hợp: - Kỹ thuật AND tái tổ hợp tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo gen hệ gen ; cải biến cấu trúc gen, nhằm tạo gen chuyển chúng vào tế bào, thể chủ nhằm mục đích sản xuất sản phẩm ( protein, enzym,…), tế bào, thể có tính trạng theo mong muốn Footer Page of 113 Header Page of 113 - Những hiểu biết sâu sắc đại phân tử sinh học sở khoa học kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu kỹ thuật AND tái tổ hợp - Kỹ thuật AND tái tổ hợp gồm bước sau: Tách chiết tạo AND, ARN theo mong muốn ( phân lập gen) Tạo vector tái tổ hợp ( chuẩn bị vector tách dòng, enzym cắt giới hạn enzym nối) Chuyển ( biến nạp) AND tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng gen Sàng lọc theo dõi hoạt động gen chuyển vào tế bào chủ, tạo số lượng lớn đoạn AND theo mong muốn để sử dụng vào mục đích khác 2.2.1.1 Phân lập gen: * Tách chiết AND:tùy theo nguồn axit nucleic,có kiểu tách chiết khác nhau: - Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ màng, loại bỏ protein enzim, kết tủa tinh AND hóa chất, dung môi, dịch chiết thích hợp - Đối với mô, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết AND Tuy nhiên trực tiếp lấy mẫu sinh phẩm lông, tóc, thịt, máu, nước bọt., mô thân , rễ, lá… * Tách chiết ARN: quy trình tương tự tách chiết AND, dịch chiết sau làm protein, sử dụng enzim phân hủy AND, kết tủa thu ARN * Định lượng AND, ARN: sản phẩm sau tách chiết cần có độ tinh hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định số hấp phụ, tù đánh giá độ tinh hàm lượng cần thiết Hoặc dùng phương pháp điện di gel thạch xác định băng AND, ARN, suy độ tinh hàm lượng cần thiết cho nghiên cứu 2.2.1.2 Tạo vector tái tổ hợp: ► Vector tách dòng: phân tử AND có kích thước nhỏ, có khả gắn gen cần thiết, tự tái bản, tồn tế bào chủ đặc biệt phải mang tín hiệu nhận biết tế bào chủ mang vector tái tổ hợp Footer Page of 113 Header Page 10 of 113 -Các loại vector tách dòng thường dùng :  Plasmid : phân tử AND dạng vòng, xoắn kép, có tế bào chất vi khuẩn  Phagơ : phần lớn phagơ Lamda, có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài gen khác nhau, giúp gen dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn có khả có khả chép nhanh  Virut tế bào nhân thực : virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut herpes…được sử dụng tách dòng chuyển gen tế bào động vật, thực vật ► Enzym cắt giới hạn: enzym có khả nhận biết đoạn trình tự phân tử AND cắt AND điểm đặc hiệu Đồng thời cắt gen từ hệ gen đó, cắt vector tách dòng vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn đoạn gen cần thiết ► Enzym nối Ligasa: enzym quan trọng tế bào, chúng xúc tác hình thành liên kết photphodieste để nối đoạn axit nucleic với -Có loại enzym nối quan trọng Công nghệ di truyền: enzym E.Coli AND tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T4 AND enzym T4 ARN tách chiết từ phage T4 Ngoài ra, ngày người ta sử dụng đoạn nối (đầu dính - adaptor ) cho enzym đầu Adaptor xúc tác nối đoạn ADN enzym cắt đầu từ tạo nên đầu sol Các adaptor đặc trưng riêng cho loại enzym Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn AND khác nhau, qua khâu nối trộn lẫn tạo sản phẩm AND tái tổ hợp 2.2.1.3 Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng gen: - Đưa AND tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuyển trực tiếp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế bào chủ vi khuẩn, tế bào động vật, tế bào thực vật; nhờ máy di truyền tế bào chủ nhân AND tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn - Những tế bào chủ thường dùng:  Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, tốn kém, sinh sản nhanh, tạo dòng AND tái tổ hợp nhanh Footer Page 10 of 113 Header Page 11 of 113  Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro; loại tế bào thường dùng vào mục đích cụ thể; nghiên cứu điều hòa hoạt động gen, đột biến gen… - Những phương pháp chủ yếu dùng để đưa AND tái tổ hợp vào tế bào nhận:  Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( thành Xelulose) môi trường thích hợp  Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm) tạo lỗ thủng nhỏ tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệ gen tế bào chủ  Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ AND vào tế bào chủ tế bào trứng thụ tinh giai đoạn phôi 4-8 tế bào  Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển ( súng bắn gen) vào hệ gen tế bào chủ Vi đạn hạt Volfram vàng trộn với gen cần chuyển phụ gia, vi đạn bắn vào viên đạn lớn hơn, bắn, viên đạn lớn giữ lại, vi đạn bắn vào tế bào nhận với gia tốc lớn 2.2.1.4 Chọn lọc, tạo dòng biểu gen: Việc chọn lọc dòng tế bào ý không đơn giản tốn nhiều công sức Khi xác nhận ADN tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào mang gen cần thiết chúng sinh sản để tạo dòng tạo điều kiện cho gen biểu  Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau biến nạp ADN vào tế bào nhận, tạo nhiều dòng tế bào vi khuẩn khác Chúng nuôi thành dòng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dòng tế bào vi khuẩn không nhận plasmit, dòng nhận plasmit gen lạ dòng nhận plasmit tái tổ hợp) Do muốn nhận tách dòng gen từ thư viện ADN, người ta sử dụng phương pháp: - Lai axit nucleic: làm tan chỗ khuẩn lạc vi khuẩn giấy lọc nitrocellulose ADN thoát gắn với mẫu thử axit nucleic có mang Footer Page 11 of 113 10 Header Page 12 of 113 dấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu Nếu tượng bắt cặp bổ sung xảy có nghĩa gen chuyển vào tế bào nhận - Phát kiểu hình: đòi hỏi dòng mục tiêu phải có biểu dạng protein dễ phát phép thử - Phản ứng miễn nhiễm: tế bào nhận plasmit có gắn đoạn ADN lạ tế bào vi khuẩn hoạt tính kháng tetracyclin, khuẩn lạc mọc môi trường có ampicilin, không mọc môi trường có tetrecyclin Đây dòng tế bào cần chọn  Sự biểu gen tạo dòng: nói chung gen lạ sau đưa vào tế bào nhận, muốn gen có biểu tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ yếu tố phiên mã dịch mã phù hợp sở chế điều hòa biểu biểu gen Các vector gọi vector biểu 2.2.2 Ý nghĩa sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất insulin: Sản xuất Insulin công nghệ tái tổ hợp bước nhảy vọt việc chữa trị bệnh tiểu đường Ngoài ý nghĩa quan sử dụng công nghệ để sản xuất Insulin, hiệu kinh tế, sử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ nhiều mà chất lượng sản phẩm bảo đảm, nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao tế bào nhân tham gia quy trình nghệ ADN tái tổ hợp 2.2.3 Quy trình sản xuất Insulin công nghệ AND tái tổ hợp: Tổng hợp Insulin người trình sinh hóa gồm nhiều bước, gồm hai phương pháp 2.2.3.1 Phương pháp 1: Tạo chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học tạo tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh  Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử tách gen mã hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết mARN người có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA Footer Page 12 of 113 11 Header Page 13 of 113 Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho trình dịch mã; lại loại bỏ ADN ARN khác Cắt bỏ cầu nối A - T thu mARN H8 Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người  Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp - Cắt gen mã hoá proinsulin plasmit loại enzym giới hạn Nối ADN ligase phageT4 Trong thành phần vector biểu phải có promoter mạnh giúp gen biểu vi khuẩn -Thiết kế trình tự mã hoá cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin tế bào chất Nếu sử dụng mARN tách từ tiến hành sau: - Sao mARN tinh khiết thành ADN (cADN) nhờ enzym phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT - PCR) - Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli  Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca tạo lỗ xung điện Footer Page 13 of 113 12 Header Page 14 of 113 H9 Tách biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli Sau trình biến nạp, cần chọn lọc dòng vi khuẩn mang gen mong muốn Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy trình gen đánh dấu vector sử dụng Thông thường sử dụng laoij gan kháng sinh Ampixilin Tetraxilin để chọn lọc Sau kiểm tra dòng chọn lọc theo nhiều cách khác cách giải đoạn trình tự nucleotic đoạn gen cài vào vector tái tổ hợp so sánh với trình tự gốc Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào nồi lên men Nuôi chúng nồi lên men với điều kiện tối ưu Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, theo chất dinh dưỡng liên tục bổ sung để đảm bảo tăng trưởng vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ nhân lên qua nguyên phân Như vậy, sau thời gian ngắn, sinh khối tăng H10- Qúa trình lên men  Bước 5: Tiền tinh Sau lên men cần tách tế bào khử trùng nhiệt - Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit  Bước 6: Hoạt hoá Footer Page 14 of 113 13 Header Page 15 of 113 Do hệ thống E.coli có khả biểu gen insulin khả hoạt hoá insulin Hoạt hoá proinsulin invitro cách xử lý dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết Hình 11:Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh  Bước 7: Hỗn hợp tinh có insulin Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzym Độ tinh insulin đánh giá qua giai đoạn trung gian trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá Cuối insulin tinh thể hoá Hình 12: Các tinh thể insulin 2.2.3.2 Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B Phương pháp tránh việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin Footer Page 15 of 113 14 Header Page 16 of 113 Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A B Xác định trình tự ADN để qua tổng hợp tách hai dòng gen Mỗi ADN chèn vào plasmit Sau sản xuất tương tự sản xuất proinsulin Cuối hai chuỗi A B trộn với hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ chất oxi hoá định Hình 13.Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt Hình 14: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B 2.2.4 Các phương pháp sản xuất khác:  Ngày nay, nấm men sử dụng thay cho vi khuẩn E.Coli để sản xuất insulin Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người gần hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo Điều làm giảm tối đa tính phức Footer Page 16 of 113 15 Header Page 17 of 113 tạp giá thành giai đoạn tinh Sản xuất insulin dựa công nghệ gene công nghệ sinh học mang lại nhiều lợi ích tính vượt trội so với việc thu nhận từ động vật Insulin sản xuất nhiều hệ thống khác tế bào E coli, tế bào Saccharomyces tế bào thực vật, có thành công đáng kể Tuy nhiên tạo insulin hệ thống gặp số hạn chế Novo Nordisk công ty hàng đầu giới bán insulin với chất lượng đáng tin cậy, công ty sản xuất insulin thương mại hệ thống tế bào Saccharomyces Nhóm nghiên cứu Novo Nordisk tạo insulin hệ thống tế bào nấm men Pichia cho thấy hệ thống có nhiều ưu điểm so với hệ thống Saccharomyces Hiện Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu tạo insulin theo phương pháp Đối tượng chọn để sản xuất insulin tế bào nấm men Pichia Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, nhóm thực tổng hợp gene mã hóa cho insulin Hiện nhóm tiến hành nhân dòng gene mã hóa cho insulin plasmid mang pBluescript Plasmid pBluescript mang gene mã hóa cho insulin chuyển nạp vào E coli Khi thành công trình nhân dòng gene mã hóa cho insulin, gene mã hóa cho insulin biểu tế bào Pichia Kiểm tra trình biểu protein kháng thể chuyên biệt Tiến hành thu nhận tinh protein tái tổ hợp Bước đầu kiểm tra hoạt tính insulin chuột thí nghiệm  Giả insulin : Cải tiến phương thức hoạt động insulin thể người cách thay đổi trình tự axitamin tạo chất tương tự Insulin giả kết dính với khuếch tán vào máu dễ dàng Quy trình sản xuất Insulin giả tương tự quy trình sản xuất insulin  phương pháp sản xuất Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất biểu chuỗi A chuỗi B riêng biệt cách sử dụng Escherichia coli, sau thu chuỗi A chuỗi B, trộn với in vitro tạo cầu nối disulfur Phương pháp có hiệu sản xuất thấp Do đó, Eli Lilly phát triển phương pháp cải tiến hơn, phương pháp biểu proinsulin thay biểu chuỗi A B riêng biệt phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A B trypsin carboxypeptidase, tạo thành insulin Footer Page 17 of 113 16 Header Page 18 of 113  Một phương pháp khác phát triển tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp biểu miniproinsulin bao gồm chuỗi B chuỗi A nối với acid amin, biểu nấm men, sau xử lý miniproinsulin in vitro trypsin tạo thành insulin Phương pháp có nhiều thuận lợi cầu nối disulfur hình thành trình biểu trình tiết miniproinsulin, miniproinsulin tách chiết tinh dễ dàng tiết thẳng môi trường nuôi cấy  Mới nhất, Công ty Bio-Technology General đưa phương pháp Trong phương pháp này, dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin biểu tế bào E.coli Bằng cách này, hiệu suất trình biểu protein hiệu trình hình thành cầu nốii Sau đó, proinsulin chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin carboxypeptidase B  Các nhà khoa học Anh Mỹ cho biết họ sử dụng tế bào gốc lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh để giúp bệnh nhân tiểu đường loại khôi phục khả sản xuất insulin thể  Ưu phương pháp Insulin tạo gần hoàn chỉnh với cấu trúc Insulin người Tạo số lượng lớn Insulin thời gian ngắn Năng suất cao Nguồn nguyên liệu dễ tìm ,không nguy hại đến môi trường Trong trình tách chiết: dễ thao tác kĩ thuật chuẩn hóa phòng thí nghiệm Ít tốn chi phí Giá thành rẻ ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA INSULIN: Insulin tác dụng nhanh Ưu điểm: Footer Page 18 of 113 17 Header Page 19 of 113 - Là loại dùng cấp cứu tác dụng hạ đường huyết nhanh chóng - Có thể trộn lẫn với insulin chậm tùy theo mục đích nhu cầu điều trị - Có thời gian tác dụng ngắn mạnh để làm giảm đường huyết sau ăn Nhược điểm : Thời gian tác dụng ngắn nên phải tiêm nhiều lần ngày (4 mũi tiêm da, thực tế không dùng riêng insulin tác dụng nhanh để điều trị mà phải kết hợp thêm insulin tác dụng bán chậm chậm) Insulin tác dụng bán chậm (dịch tiêm đục sữa) Để làm giảm bớt số lần tiêm ngày, người ta sản xuất loại insulin có tác dụng dài gồm loại insulin NPH (Neutral Protamine Hagedorn) hay IZS (Insulin Zinc Suspension) hay lent để sử dụng chế độ điều trị với hay mũi tiêm ngày Ưu điểm: loại insulin tác dụng trung bình có nhiều loại với thời gian tác dụng khác tùy thuộc vào yêu cầu điều trị thuận lợi bệnh nhân Nhược điểm: gây đau trộn với insulin nhanh Insulin trộn sẵn (dịch tiêm đục sữa) Là loại insulin trộn lẫn loại nhanh trung bình theo tỷ lệ định - Có tỷ lệ 30% insulin nhanh 70% insulin trung bình - Có tỷ lệ 50% insulin nhanh 50% insulin trung bình Ngoài tiến hành trộn theo tỷ lệ khác mà loại nhanh chiếm 10- 20- 40% Ưu điểm: tiện dùng, phù hợp với sinh lý mà không đòi hỏi phải tự trộn lấy liều dùng riêng loại nhanh chậm Nhược điểm: tỷ lệ pha trộn cố định nên khó điều chỉnh cho phù hợp với tình cụ thể: ăn bữa no tăng liều insulin nhanh chậm gây hạ đường huyết muộn Trong lẽ tăng từ đến đơn vị loại insulin nhanh Insulin tác dụng chậm (dịch tiêm đục sữa) Ưu điểm: Chỉ cần mũi tiêm có tác dụng 24 ngày Footer Page 19 of 113 18 Header Page 20 of 113 Có thể dùng kỹ thuật mũi tiêm/ ngày, mũi nhanh vào trước bữa ăn mũi vào lúc ngủ (22 giờ) Nhược điểm: Tại chỗ: đỏ, đau nơi tiêm Hạ đường huyết không lường trước tác dụng kéo dài chồng chéo với mũi tiêm khác Thường không làm giảm đường máu sau ăn thời gian hấp thu vào máu chậm 4.NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN INSULIN: 4.1 Nguyên tắc sử dụng: Đối với người mắc bệnh tiểu đường loại chọn dùng insulin có hiệu trung bình, trước bữa ăn sáng khoảng 30 phút tiêm da (1 lần ngày, lượng thuốc bắt đầu khoảng 4-8u) sử dụng hỗn hợp insulin hiệu trung bình kết hợp với insulin hiệu nhanh trước bữa ăn sáng, cách ngày lại điều chỉnh lượng thuốc Đối với người mắc bệnh tiểu đường loại 1: dùng phương pháp thường không đạt mục đích khống chế bệnh cần phải dùng phương pháp trị liệu cường hóa insulin 4.2 Bảo quản: •Giữ lọ hay ống bút insulin nguyên nắp tủ lạnh Không để insulin kết đông •Sau mở, insulin giữ nhiệt độ nhà (dưới 300) tháng sau loại bỏ •Insulin di chuyển an toàn túi hay túi xách •Insulin bị hư nhiệt độ cao Không để nơi nhiệt độ 30 o ánh sáng mặt trời Không dùng insulin nếu: •Insulin màu chuyển sang đục •Quá hạn sử dụng •Insulin đông cứng tiếp xúc với nhiệt độ cao •Có đóng cục hay lợn cợn insulin Footer Page 20 of 113 19 Header Page 21 of 113 •Thấy có cặn insulin bên lọ không tan lắc (tròn) nhẹ lọ •Lọ mở tháng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: KẾT LUẬN: Khả ứng dụng vi sinh vật y tế vô vô tận.những khám phá người vi sinh vật mang lại lợi ích to lớn, tạo chế phẩm hỗ trợ đặc biệt cải thiện sức khoẻ người.Từ cho thấy nhu cầu sản xuất Insulin vi sinh vật ngày tăng,nó thay cho cách tổng hợp Insullin truyền thống lấy từ tế bào động vật.Biện pháp làm giảm chi phí nhiều so với phương pháp cũ, đồng thời lại thân thiện với môi trường KIẾN NGHỊ: Khuyến khích ứng dụng,phát triển công nghệ sản xuất insulin vi sinh vật: 1.Nhà nước nên đầu tư hợp lý chi phí cho công trình nghiên cứu 2.Thường xuyên mở hội thảo để thảo luận đưa ý kiến phương phap hiệu 3.Truyền thông để người biết đến để có cách thực điều trị phù hợp 4.ngày tự hoàn thiện chất lượng giá thành để tầng lớp sử dụng 5.Tăng cường hợp tác với quan nước để áp dụng chuyển giao nhanh công nghệ kết nghên cứu Footer Page 21 of 113 20 Header Page 22 of 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1-http://d.violet.vn/uploads/resources/562/1075370/preview.swf 2http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?file=article&name=News&sid=1 149 3-http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=487936 4-http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/2659-insulinva-cong-nghe-san-xuat-insulin-tren-the-gioi 5-http://vi.wikipedia.org/wiki/Insulin Footer Page 22 of 113 21 ... đái tháo đường Họ cố gắng tinh chiết hormone hóa học từ tụy chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan Sau đó, chất tiêm vào chó bị đái tháo đường để thử nghiệm họ nhận thấy bệnh đái tháo. .. điều trị - Có thời gian tác dụng ngắn mạnh để làm giảm đường huyết sau ăn Nhược điểm : Thời gian tác dụng ngắn nên phải tiêm nhiều lần ngày (4 mũi tiêm da, thực tế không dùng riêng insulin tác dụng. .. Suspension) hay lent để sử dụng chế độ điều trị với hay mũi tiêm ngày Ưu điểm: loại insulin tác dụng trung bình có nhiều loại với thời gian tác dụng khác tùy thuộc vào yêu cầu điều trị thuận lợi bệnh