Biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin để ứng dụng điều trị bệnh tháo đường type 2

Trong đề tài này được thực hiện nhằm nghiên cứu này nhằm phân lập, nuôi cấy, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc (TBG) từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin giống tế bào beta. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số * 2014 BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN ĐỂ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH THÁO ĐƯỜNG TYPE Trần Đặng Xuân Tùng*, Đặng Vạn Phước**, Lê Thị Bích Phượng*, Phạm Văn Phúc*** TĨM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu nhằm phân lập, nuôi cấy, tăng sinh biệt hóa tế bào gốc (TBG) từ mơ mỡ thành tế bào tiết insulin giống tế bào beta Đối tượng phương pháp: mô mỡ thu nhận từ người tình nguyện Sau đó, tế bào gốc từ mô mỡ phân tách kit ADSC extraction kit nuôi cấy môi trường MSCult kit để làm giàu tế bào gốc ứng viên Các tế bào gốc khẳng định đặc điểm tế bào gốc trung mô cách xác định marker bề mặt Cuối tế bào gốc biệt hóa thành tế bào tiết insulin môi trường chuyên biệt bổ sung chất nicotinamide, exendin-4, B27 Kết quả: qui trình thu nhận 1,01 x 106 tế bào gram mỡ , có 78,3 ± 5,7% tế bào sống tỷ lệ tế bào gốc 7,15 ± 2,22%, qui trình biệt hóa thành công tế bào gốc thành tế bào tiết insulin Kết luận: số lượng tế bào gốc thu đủ dùng nghiên cứu nhân lên ứng dụng điều trị, qui trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin hoàn toàn khả thi Từ khóa: Tế bào gốc, tế bào gốc từ mơ mỡ, tế bào tiết insulin, biệt hóa ABSTRACT DIFFERENTIATION THE ADIPOSE DEVIRED STEM CELL TO INSULINE PRODUCING CELL FOR DIABETTES MELLITUS TREATMENT Tran Dang Xuan Tung, Dang Van Phuoc, Le Thi Bich Phuong, Pham Van Phuc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - No - 2014: 50 - 54 Purposes: This research is carried out in order to subdivide, culture, multiple and differentiate adipose derived stem cell (ADSC) to insulin producing cells, which similar to beta cells Subjects and Methods: Adipose tissue was obtained from healthy volunteer Adipose derived cells is isolated by ADSC extraction kit and cultured in MSCult kit to enrich stem cell candidate These cells are identified as stem cells by defining surface markers following the definition of Mesenchymal stem cells Finally, ADSC is differentiated to insulin producing cells in specific medium supplemented with nicotinamide, exendin-4, B27 Results: we can obtain1,01 x 106 cells in gram of adipose tissue with stem cell percentage be 7,15± 2,22%, it is 78,3 ± 5,7% life cells and 7,15 ± 2,22% stem cells ADSC is differentiated successfully to Insulin producing cells Conclusion: the quality of stem cell have been derived, that is enough for research and culture to clinical treatment The process for differentiation stem cell to insulin producing cell is realizable Key words: stem cell, adipose devised stem cell (ADSC), insulin producing cell, differentiation đối thể Đặc trưng bệnh tình trạng GIỚI THIỆU đường huyết tăng cao, kèm theo rối loạn Đái tháo đường bệnh mãn tính, gây quan trọng chuyển hóa carbohydrate, protein, tình trạng thiếu insulin tuyệt đối tương lipid chất khoáng Các rối loạn dẫn đến * *Bệnh viện đa khoa Vạn Hạnh **Đại Học Y Dược TpHCM ***Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM Tác giả liên lạc: ThS Trần Đặng Xuân Tùng ĐT: 0903120280 Email: dr_xuantung@yahoo.com 50 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số * 2014 Nghiên cứu Y học nhiều biến chứng cấp tính mạn tính HCV thông qua xét nghiệm PCR Lượng mỡ Nhằm ngăn ngừa biến chứng tử vong từ bệnh đái tháo đường, bệnh nhân cần phải kiểm soát đường huyết chặt chẽ tùy theo mục tiêu đối tượng Khi tiềm to lớn tế bào gốc khám phá, mang lại hi vọng sử dụng tế bào gốc phương pháp điều trị hứa hẹn cho bệnh nhân đái tháo đường Trong vòng hai thập niên qua, nhiều nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh đái tháo đường tiến hành Các nghiên cứu điều trị nguyên nhân gây bệnh mang lại kết ổn định lâu dài(3,8) thu nhận tối thiểu 100ml (kể chất gây tê) Tại Việt Nam, nhiều tác giả thành cơng việc biệt hóa tế bào gốc thu nhận từ máu cuống rốn tủy xương thành tế bào tiết insulin thử nghiệm thành công mơ hình động vật(7) Tuy nhiên, phương pháp có hạn chế định tính xâm lấn việc thu nhận tế bào gốc từ tủy xương hay người bệnh khơng có nguồn lưu trữ máu cuống rốn hay dây rốn… Do đó, việc phát tế bào gốc từ mô mỡ mở tương lai việc ứng dụng tế bào gốc điều trị đái tháo đường ưu điểm: mô mỡ dễ phân tách, thủ thuật thu nhận xâm lấn(9) Với kết trên, tiến hành nghiên cứu nhằm (1) xây dựng quy trình thu nhận tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ, (2) biệt hóa tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin, (3) đánh giá chất lượng tế bào biệt hóa để ứng dụng vào điều trị bệnh đái tháo đường type 2, đồng thời thử nghiệm với số liệu ban đầu mang tính chất tham khảo cho nghiên cứu lớn sau VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp nghiên cứu: In vitro Sinh phẩm nghiên cứu Mơ mỡ người tình nguyện lấy Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh TP.Hồ Chí Minh Tiêu chuẩn chọn mẫu Mơ mỡ có kết âm tính với HIV, HBV, Tiêu chuẩn loại mẫu Mô mỡ lấy người tình nguyện có bệnh lý gây viêm có dấu hiệu nhiễm trùng vùng lấy mẫu Các quy trình thao tác thực Phòng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng Tế bào gốc Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.Hồ Chí Minh Qui trình nghiên cứu gồm giai đoạn sau: Thu nhận mỡ Thu nhận SVF nuôi cấy TBG từ mô mỡ Định lượng, định danh TBG sau phân tách Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin Kiểm tra nhiễm khuẩn, nhiễm nấm NST tế bào tiết insulin Đánh giá biệt hóa thành tế bào tiết insulin Giai đoạn 1: Thu nhận mỡ bụng Bệnh nhân gây mê mask quản phối hợp tê chỗ lidocaine Thu mỡ da vùng bụng rốn, hút hai bên đối xứng qua đường trắng bụng Bơm vào mô mỡ 100ml nước muối sinh lí với hỗn hợp nồng độ Lidocain 1% adrenaline 1/1000000 Hút mỡ tay nhẹ nhàng tránh tổn thương tế bào Số lượng hút 100ml hỗn hợp mô mỡ nước muối sinh lý tình nguyện viên Giai đoạn 2: Thu nhận phân đoạn mạch (SVF) nuôi cấy tế bào gốc từ mơ mỡ: Bước 1: Xử lí sơ mẫu Bước 2: Rửa mẫu Washing buffer Bước 3: Lặp lại bước Bước 4: Rửa mẫu Washing buffer Bước 5: Lặp lại bước Bước 6: Phân tách mẫu Bước 7: Thu nhận tế bào Bước 8: Rửa tế bào Bước 9: Sử dụng hay nuôi cấy tế bào 51 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số * 2014 Nghiên cứu Y học Huyền phù cặn môi trường DMEM/F12 10% FBS nuôi điều kiện 370C, 5% CO2 Thay môi trường ngày/lần đến tế bào phát triển 70% bề mặt flask cấy chuyền dùng hóa chất trypsin 0,25% Giai đoạn 3: Định lượng, định danh tế bào gốc sau phân tách: Tế bào gốc có mẫu phân tích kĩ thuật flow cytometry máy FACS calibur (BD Bioscience) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tế bào gốc trung mô phải có kết marker sau: (+) với marker CD13, CD44, CD73, CD90, CD105 (-) với marker CD14, CD34, CD45, HLA-DR Giai đoạn 4: Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết Insulin Bước 1: Tế bào nuôi tăng sinh MSCCult tách trypsin/EDTA 0,25% cấy vào đĩa giếng, giếng 100.000 tế bào Nuôi tế bào môi trường IPC-M1 5-7 ngày 370 C, với chế độ thay môi trường ngày/lần Bước 2: Thay môi trường nuôi tế bào thành IPC-M2 nuôi ngày Bước 3: Thay môi trường nuôi tế bào thành IPC-M3 Tiếp tục nuôi bước 1, ngày Sau tách tế bào trypsin/EDTA 0,25% nuôi lại giếng đĩa Tế bào tiếp tục nuôi 4-5 ngày Tất môi trường cung cấp công ty GeneWorld, HCM, VN Giai đoạn 5: Đánh giá nhiễm khuẩn, nhiễm nấm NST tế bào tiết insulin: tiêu chí sau: Bảng Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng TBG Tiêu chí Nhiễm vi khuẩn Nhiễm nấm Nhiễm sắc thể (NST)đồ 52 Phương pháp phát Cấy khuẩn đĩa petri Cấy nấm đĩa petri Tiến hành NST đồ Giai đoạn 6: Đánh giá biệt hóa tế bào tiết insulin: Tiến hành chạy Realtime RT-PCR Với Gen: Pdx-1, Ngn3, Insulin Dùng phương pháp 2-∆∆Ct Livak để định lượng biểu gen nghiên cứu gen tham chiếu (GAPDH) Dùng phương pháp nhuộm Dithizone (DTZ) để nhận biết tiết insulin tiểu đảo tụy tuyến tụy hay cụm tế bào giống tiểu đảo tụy Đánh giá khả tiết insulin tế bào sau biệt hóa phụ thuộc vào nồng độ glucose môi trường nuôi Cho tế bào vào giếng A B có mơi trường IPC-M3 với nồng độ glucose 5.5mmol/L 23mmol/L Ủ tế bào điều kiện ni 24 Sau đó, định lượng diện insulin dịch nuôi tế bào kĩ thuật HPLC Phân tích thống kê Nghiên cứu thực mẫu Số liệu nghiên cứu xử lí phần mềm Excel 2010 với độ tin cậy 95% KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ, tăng sinh in vitro biểu marker đặc trưng sau vài lần cấy chuyền Chúng thành công với tỷ lệ 100% (7/7) việc tác chiết SVF từ mô mỡ Tổng số tế bào thu nhận 1.0126 ± 0.0933 × 106 tế bào, tỷ lệ sống đạt 78,3 ± 5,7% (n=7) Sử dụng kĩ thuật flow cytometry với marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô, kết đánh giá cho thấy cho 7,12± 2,22% tế bào phân đoạn SVF tế bào gốc trung mô Số lượng đủ để dùng nghiên cứu nhân lên ứng dụng điều trị Bảng 2: Kết định lượng tế bào SVF tế bào gốc mơ mỡ lần thí nghiệm Tế bào có nhân Tế bào/gam (x Phần trăm tế Phần trăm 6 SVF (x 10 ) 10 ) bào sống (%) TBG (%) 103,6 1,036 78 7,123 82,4 0,97 82 9,562 72,8 1,103 70 9,457 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số * 2014 Tế bào có nhân Tế bào/gam (x Phần trăm tế Phần trăm 6 SVF (x 10 ) 10 ) bào sống (%) TBG (%) 45,2 1,0511 74 7,983 65 0,8228 77 6,786 89,8 1,0322 69 5,994 98,8 1,0739 84 3,124 Mean 1,0126 78,2857 7,147 SD 0,0933 5,6779 2,2178 Kết tương đương với nghiên cứu khác giới(1) SVF chứng minh có chứa đến 3% tế bào gốc tổng số tế bào, gấp 2.500 lần so với tần số tế bào gốc tuỷ xương ngươ,i(4) Như SVF nguồn tế bào gốc phong phú, an toàn hiệu Kết nuôi cấy ADSC Nghiên cứu Y học nuôi cấy Theo kết bước đầu chứng minh khả tách triết ADSC mơ mỡ tình nguyện viên Biệt hóa thành cơng tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin Sau 12 ngày biệt hóa, có co cụm rút ngắn tế bào dồn chúng lại vị trí hình thành nhóm tế bào ngày nén chặt Từ số cụm tế bào giống đảo tụy bắt đầu xuất vào khoảng ngày thứ 14 Khi nhuộm với dithizone, 100% cụm tế bào giống đảo tụy bắt màu đỏ với thuốc nhuộm Sau ngày nuôi, tế bào tăng sinh mạnh bắt đầu hợp dòng Khi tế bào chiếm 70-80% diện tích bề mặt nuôi, tiến hành cấy chuyền theo tỷ lệ 1:3 Tốc độ phát triển tế bào tương đối lần cấy chuyền cao nuôi cấy sơ cấp Hình Các tế bào sau co cụm lại thành tụy đảo bắt màu với thuốc nhuộm Dithizone (20x) Các tế bào kiểm tra gen chuyên biệt tế bào β tụy đảo so với tế bào chưa biệt hóa (đối chứng), bình thường hóa gen đối chứng nội GAPDH theo cơng thức Lavik Hình Tế bào ứng viên gốc trung mơ có hình thoi, trải dài bề mặt nuôi cấy (20x) Các tế bào gốc trung mô ứng viên biểu marker tế bào gốc trung mô Biểu đồ 1: Kết biểu marker tế bào sau Bảng Mức độ biểu Gen chuyên biệt tế bào β tụy đảo Gen Insulin Pdx-1 Ngn-3 Mẫu 552 2702 1640 GAPDH 97 487 13 15 Kết đánh giá tiết insulin kỹ thuật HPLC lơ thí nghiệm đạt 100% dương tính với insulin Điều chứng tỏ tế bào sau biệt hóa thành cơng khơng có khả biểu gen liên quan đến kiểu hình tế bào β tụy đảo mà có khả dịch mã thành công insulin tiết Insulin sản phẩm cuối suốt trình chuyển biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành tế bào tiết insulin Sự 53 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số * 2014 Nghiên cứu Y học xuất insulin phát HPLC chứng tỏ chúng tơi biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin Để đánh giá tính tồn vẹn tính tế bào β tụy đảo, tiến hành đánh giá khả tiết insulin phụ thuộc vào nồng độ đường kích thích Kết 6/6 (tỷ lệ 100%) mẫu tế bào biệt hóa có khả đáp ứng tốt với lượng đường Cụ thể, lượng đường cao lượng insulin tiết nhiều Bảng Mức dộ đáp ứng tiết Insuline theo nồng độ đường Mẫu Mẫu Mẩu Mẫu Mẫu Mẫu Nồng độ mmol/l 91,4 ng/ml 210,7 ng/ml 560 ng/ml 310 ng/ml 790 ng/ml 430 ng/ml Nồng độ 23 mmol/l 166,6 ng/ml 417,9 ng/ml 650 ng/ml 410 ng/ml 930 ng/ml 460 ng/ml Trong kết nghiên cứu Kim cộng (5) sự , họ cho ră,ng có tế bào gốc ở màng xương mới có khả biệt hóa thành tế bào tiết insulin mà đáp ứng được với lượng đươ,ng Tuy nhiên kết nhiều nhóm nghiên cứu khác lại cho thấy tế bào tiết insulin biệt hóa tư, mơ mỡ có khả đáp ứng với lượng đươ,ng, kết tương đương với nghiên cứu Chardar(2), Mohamad Buang(6) Kết nghiên cứu cho thấy sự sản xuất Insulin tế bào gốc trung mơ tư, mơ mỡ sau biệt hóa thành tế bào tiết insulin có khả được điều hòa bởi sự thay đổi nồng độ glucose Tế bào sau biệt hóa có chất lượng tốt Các tế bào biệt hóa khơng phát nhiễm nấm hay vi khuẩn quan sát kính hiển vi Kết nhuộm G-banding cho thấy NST tế bào ổn định số lượng cấu trúc sau nhiều lần cấy chuyền biệt hóa thành tế bào tiết insulin 100% (3/3) mẫu tế bào lấy ngẫu nhiên không quan sát thấy đột biến NST 54 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, bước đầu xây dựng qui trình thu nhận tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ, đồng thời chứng minh khả biệt hóa ADSC thành bào tiết insuline Các tế bào sau biệt hóa có khả tiết insuline có khả thay đổi nồng độ insuline tiết theo nồng độ đường TÀI LIỆU THAM KHẢO Arakawa M, Ebato C, Mita T, Hirose T, Kawamori R, Fujitani Y, Watada H (2009), "Effects of exendin-4 on glucose tolerance, insulin secretion, and beta-cell proliferation depend on treatment dose, treatment duration and meal contents", Biochem Biophys Res Commun, 390(3), p 809-814 Chandra V, Muthyala S, Jaiswal AK, Bellare JR, Nair PD, Bhonde RR (2011), "Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice", PLoS One, 6(6) p 20615 Figlinzzi M et al (2009), "Bone marrow derived mesenchymal stem cells improve islet graft function in diabetic rats", Transplant Proceeding, 41(5) p 1797-1800 Gronthos S, F.D., Leddy HA, Robey PG, Storms RW, Gimble JM (2001), "Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells", J Cell Physiol, 189, p.54-63 Kim SJ, Ko ES, Lim SM, Lee CW, Kim DI (2012), "Glucosestimulated insulin secretion of various mesenchymal stem cells after insulin-producing cell differentiation", J Biosci Bioeng, 113(6) p 771-777 Mohamad Buang ML, S.H., Chung LH, Saim AB, Idrus RB (2012), "In vitro generation of functional insulin-producing cells from lipoaspirated human adipose tissue-derived stem cells", Arch Med Res, 43(1) p 83-88 Phan Kim Ngọc, Dương Thanh Thủy, Phạm Lê Bửu Trúc, Phạm V©n Phúc (2010), "So sánh hiệu điều trị bệnh đái tháo đường cách cấy ghép tế bào gốc trung mô tủy xương tế bào tiết insulin mơ hình chuột", Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học: khu vực miền trung tây nguyên Phạm Lê Bửu Trúc, Dương Thanh Thủy, Phạm V©n Phúc, Phan Kim Ngọc (2009), "Đánh giá hiệu điều trị bệnh đái tháo đường cách ghép tế bào tiết insulin mơ hình chuột", Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam, p 23-24 Trần Thị Như Mai, Vương Gia Tuệ, Khổng Hiệp, Phạm V©n Phúc, Phan Kim Ngọc (2008), "Thu nhận biệt hóa tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ người", Hội nghị khoa học lần thứ 6: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Ngày nhận báo: Ngày phản biện đánh giá báo: Ngày báo đăng: 28/02/2014 10/03/2014 20/03/2014 ... ADSC mơ mỡ tình nguyện viên Biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin Sau 12 ngày biệt hóa, có co cụm rút ngắn tế bào dồn chúng lại vị trí hình thành nhóm tế bào. .. phân tách Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin Kiểm tra nhiễm khuẩn, nhiễm nấm NST tế bào tiết insulin Đánh giá biệt hóa thành tế bào tiết insulin Giai đoạn 1: Thu nhận mỡ bụng Bệnh nhân... 18 * Số * 20 14 Nghiên cứu Y học xuất insulin phát HPLC chứng tỏ chúng tơi biệt hóa thành cơng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin Để đánh giá tính tồn vẹn tính tế bào β tụy