NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO HẠT NANO CHITOSAN GẮN PEG BỌC INSULIN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

LÊ THỊ NỮ THANH NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO HẠT NANO CHITOSAN GẮN PEG BỌC INSULIN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô Chuyên ngành đào tạo thí điểm... T

LÊ THỊ NỮ THANH

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO HẠT NANO CHITOSAN GẮN PEG BỌC INSULIN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô

(Chuyên ngành đào tạo thí điểm)

Luận Văn Thạc Sĩ i CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2015

BẢN XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA CÁC THIẾU SÓT CỦA LUẬN VĂN

Trường Đại học Công nghệ đã có Quyết định số 399/QĐ-ĐT ngày 19 tháng 6 năm 2015 về việc thành lập Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ cho học viên Lê Thị Nữ Thanh, sinh ngày 29/05/1987, tại Bình Thuận, chuyên ngành Vật Liệu và Linh Kiện Nano, ngành ………

Ngày 26 tháng 6 năm 2015, Trường Đại học Công nghệ (ĐHCN) đã tổ chức cho học viên bảo vệ luận văn Thạc sĩ trước Hội đồng chấm (có biên bản kèm theo) Theo Quyết nghị của Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ, học viên phải bổ sung và sửa chữa các điểm sau đây trước khi nộp quyển luận văn cuối cùng cho Nhà trường để hoàn thiện hồ sơ sau bảo vệ:

Đề nghị Trường Đại học Công nghệ, ĐHQG HN cho phép học viên được làm các thủ tục khác để được công nhận và cấp bằng Thạc sĩ

Xin trân trọng cảm ơn!

XÁC NHẬN CỦA THÀNH VIÊN HỘI ĐỒNG/HỘI ĐỒNG

ĐỀ NGHỊ HỌC VIÊN SỬA CHỮA LUẬN VĂN

Luận Văn Thạc Sĩ ii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Luận Văn Thạc Sĩ iii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Luận Văn Thạc Sĩ iv CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Luận Văn Thạc Sĩ v CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Luận Văn Thạc Sĩ vi CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Lê Thị Nữ Thanh, học viên cao học chuyên ngành Vật liệu và Linh kiện Nano thuộc chương trình liên kết giữa Trường Đại học Công nghệ - ĐHQG Hà Nội và Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG TP HCM Tôi đã thực hiện đề tài thạc sĩ “Nghiên cứu và chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường” tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG

TP HCM với sự hướng dẫn của PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Tôi xin cam đoan những kết quả ghi nhận trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa có trong các công trình nào khác mà tôi không tham gia

Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 05 năm 2015

Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ vii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến Quý Thầy Cô giáo viên cho tôi những kiến thức khoa học quý giá trong quá trình giảng dạy suốt những năm học qua Tôi đặc biệt cảm ơn Thầy PGS.TS Ðặng Mậu Chiến - Giám đốc Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - đã quan tâm tiếp nhận và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi thực hiện Luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn ThS Hồ Thanh Hà đã luôn theo sát, hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình làm các thí nghiệm nghiên cứu, cho tôi những ý kiến đóng góp và cùng tôi thảo luận những vấn đề liên quan đến Luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn các anh, chị, em, bạn bè đồng nghiệp tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG TP HCM đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình tôi làm Luận văn

Sau cùng, xin cám ơn các bạn lớp Cao học “Vật liệu và Linh kiện Nano” Khóa 8 đã cùng tôi trao đổi và giải quyết những thắc mắc giúp tôi hoàn thành Luận văn

Xin trân trọng cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, 25 ngày tháng 05 năm 2015

Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ viii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN vii

MỤC LỤC viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH SÁCH CÁCHÌNH xii

DANH SÁCH CÁC BẢNG xiv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 4

1.1 Công nghệ nano dược 4

1.1.1 Các thuốc tạo bởi công nghệ nano 4

1.1.2 Hệ dẫn thuốc nano 4

1.2 Bệnh tiểu đường 5

1.2.1 Giới thiệu về bệnh tiểu đường 5

1.2.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 5

1.2.3 Điều trị bệnh ĐTĐ 6

1.3 Tổng quan về insulin 6

1.3.1 Sơ lược về ra đời của insulin 6

1.3.2 Cấu trúc insulin 7

1.3.3 Vai trò của insulin 8

1.4 Tính cấp thiết của đề tài 9

1.5 Hệ tải thuốc nano chitosan gắn mPEG 10

1.5.1 Giới thiệu về vật liệu chitosan 10

1.5.1.1 Cấu trúc của chitosan 10

1.5.1.2 Tính chất của chitosan 10

1.5.1.3 Ứng dụng của chitosan Error! Bookmark not defined.

1.5.2 Giới thiệu về nano chitosan Error! Bookmark not defined.

Luận Văn Thạc Sĩ ix CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

1.5.3 Giới thiệu về TPP Error! Bookmark not defined.

1.5.4 Giới thiệu về mPEG Error! Bookmark not defined.

1.5.5 Giới thiệu về chitosan gắn mPEG Error! Bookmark not defined.

1.6 Các phương pháp chế tạo nano chitosan Error! Bookmark not defined.

1.6.1 Phương pháp khâu mạch nhũ tương Error! Bookmark not defined.

1.6.2 Phương pháp giọt tụ/kết tủa Error! Bookmark not defined.

1.6.3 Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương Error! Bookmark not defined.

1.6.5 Phương pháp mixen đảo Error! Bookmark not defined.

1.7 Các thiết bị phân tích lý hóa[2] Error! Bookmark not defined.

1.7.1 Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM Error! Bookmark not defined.

1.7.2 Thiết bị đo phổ truyền qua UV-Vis Error! Bookmark not defined.

1.7.3 Máy đo phổ hồng ngoại(IR) Error! Bookmark not defined.

1.7.4 Máy phân tích kích thước hạt (particle size analysis)Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM Error! Bookmark not defined.

2.1 Hóa chất và dụng cụ- thiết bị Error! Bookmark not defined.

2.1.1 Hóa chất Error! Bookmark not defined.

2.1.2 Dụng cụ Error! Bookmark not defined.

2.2 Phương pháp Error! Bookmark not defined.

2.2.2 Quy trình tổng hợp gắn PEG lên chitosan Error! Bookmark not defined.

2.2.2.1 Giai đoạn 1 Error! Bookmark not defined.

2.2.2.2 Giai đoạn 2 Error! Bookmark not defined.

2.2.2.3 Giai đoạn 3 Error! Bookmark not defined.

2.2.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin Error! Bookmark not defined.

2.2.3.1 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG Error! Bookmark not defined.

2.2.3.2 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc InsulinError! Bookmark not defined.

2.2.4 Hiệu suất bao thuốc Error! Bookmark not defined.

Luận Văn Thạc Sĩ x CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

2.2.4.1 Dựng đường chuẩn nồng độ Insulin bằng UV-VisError! Bookmark not defined.

2.2.4.2 Xác định hiệu suất bao gói của hạt nano chitosan gắn PEG bọc

insulin bằng túi thẩm tách cellulose Error! Bookmark not defined.

2.2.4.3 Khả năng phóng thích Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.

3.1 Kết quả phản ứng tổng hợp gắn PEG lên chitosan Error! Bookmark not defined.

3.1.1 Phản ứng bảo vệ nhóm chức amin của chitosanError! Bookmark not defined.

3.1.2 Phản ứng gắn PEG lên chitosan Error! Bookmark not defined.

3.1.3 Phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin của chitosanError! Bookmark not defined.

3.2 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG Error! Bookmark not defined.

3.2.1 Kết quả chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG qua phổ hồng ngoại FTIRError! Bookmark not defined 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan gắn PEGError! Bookmark not defined.

3.2.3 Khảo sát độ ổn định của hạt nano chitosan Error! Bookmark not defined.

3.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin Error! Bookmark not defined.

3.4 Xác định hiệu suất bao gói và khả năng phóng thíchError! Bookmark not defined.

3.4.1 Xác định hiệu suất bao gói bằng túi thẩm tách celluloseError! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN Error! Bookmark not defined.

A Kết luận Error! Bookmark not defined.

A1 Những công việc đã thực hiện Error! Bookmark not defined.

A2.Những kết quả đã đạt được Error! Bookmark not defined.

B.Hướng phát triển Error! Bookmark not defined.

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

Phụ lục 1: Danh mục các công trình liên quan được công bốError! Bookmark not defined.

Phụ lục 2: Toàn văn các bài báo liên quan được công bốError! Bookmark not defined.

Luận Văn Thạc Sĩ xi CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐHQG TP HCM Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh

TEM Transmission Electron Microscope - Kính hiển vi điện tử truyền

qua

UV-Vis Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến

DLS Phương pháp phân tích kích thước hạtbằng pp tán xạ ánh sáng

(Dynamic Light Scattering)

FTIR Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

Luận Văn Thạc Sĩ xii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

DANH SÁCH CÁCHÌNH

Hình 1.1: Biến chứng của bệnh tiểu đường 5Hình 1.2: Loại thuốc điều trị bệnh tiểu đường được 2 nhà sinh lý học người Canada là Fred Bangting và Charles Best tìm ra năm 1922 7Hình 1.3: Cấu trúc phân tử insulin 8Hình 1.4: Cấu trúc của chitin và chitosan 10

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Sodium Tripolyphosphate và PGAError! Bookmark not defined.

Hình 1.6: Sự tương tác giữa chitosan và tác nhân liên kết ngangError! Bookmark not defined.

Hình 1.7: Cấu trúc mPEG Error! Bookmark not defined Hình 1.8: Một trong những cơ chế gắn mPEG lên chitosanError! Bookmark not defined.

Hình 1.9: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tươngError! Bookmark not defined.

Hình 1.10: Sơ đồ chế tạo bằng phương pháp giọt tụ Error! Bookmark not defined Hình 1.11: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương Error! Bookmark not defined.

Hình 1.12: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ionError! Bookmark not defined.

Hình 1.13: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp mixen đảoError! Bookmark not defined.

Hình 1.14: Máy TEM JEM 1010 Error! Bookmark not defined Hình 1.15: Máy đo phổ truyền qua UV-Vis, cary 100 ConcError! Bookmark not defined.

Hình 1.16: Máy đo phổ IR Tensor TM 37 Error! Bookmark not defined.

Hình 1.17:Dao động hoá trị và dao động biến dạng Error! Bookmark not defined Hình 1 18:Máy phân tích kích thước hạt Error! Bookmark not defined.

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng bảo vệ nhóm chức amin Error! Bookmark not defined Hình 2.2: Phản ứng bảo vệ gốc amin Error! Bookmark not defined.

Luận Văn Thạc Sĩ xiii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Hình 2.3: Sơ đồ phản ứng gắn PEG Error! Bookmark not defined Hình 2.4: Phản ứng gắn PEG Error! Bookmark not defined Hình 2.5: sơ đồ phản ứng hủy bảo vệ phản ứng gốc amin của chitosan Error! Bookmark not defined.

Hình 2.6: Phản ứng hủy bảo vệ gốc amin Error! Bookmark not defined Hình 2.7: Sơ đồ chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG Error! Bookmark not defined Hình 2.8: sơ đồ chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulinError! Bookmark not defined.

Hình 2.9: Phản ứng chế tạo hạt cts gắn PEG bọc insulinError! Bookmark not defined.

Hình 2.10: Phổ hấp thu UV-Vis của Insulin tại các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 75

µg/ml Error! Bookmark not defined Hình 2.11: Đồ thị đường chuẩn dung dịch insulin tại bước sóng 276nm Error! Bookmark not defined.

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan trước và sau khi bảo vệ nhóm chức

amin Error! Bookmark not defined Hình 3.2 : Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan trước và sau khi gắn PEG Error! Bookmark not defined.

Hình 3.3: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan, PEG và chitosan sau khi gắn PEG

Error! Bookmark not defined Hình 3.4: Phổ hồng ngoại FTIR của TPP và hạt chitosan gắn PEG-TPP Error! Bookmark not defined.

Hình 3.5: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 1:1 (w/w)

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 2:1 (w/w)

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.7: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 4:1 (w/w)

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.8: Ảnh của các dung dịch pha theo tỉ lệ chitosan gắn PEG:TPP lần lượt là 1:1,

2:1, 4:1 Error! Bookmark not defined.

Luận Văn Thạc Sĩ xiv CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến Hình 3.9: Ảnh kích thước hạt của hạt nano chitosan gắn PEG theo thời gian theo bảng

3.1 Error! Bookmark not defined Hình 3.10: Ảnh của mẫu pha theo tỉ lệ 1:1 (w/w) sau 4 tuầnError! Bookmark not defined.

Hình 3.11: Ảnh phổ DLS của hạt chitosan gắn PEG –TPP(a) và hạt chitosan gắn PEG

bọc insulin(b) Error! Bookmark not defined.

Hình 3.12: Ảnh TEM của hạt nano chitosao gắn PEG (a) và hạt chitosan gắn PEG bọc

insulin (b) Error! Bookmark not defined.

Hình 3.13: Phổ UV-Vis của dung dịch ngoài túi thẩm tách trước và sau khi hiệu chỉnh

nồng độ Error! Bookmark not defined.

Hình 3.14: Đồ thị nội suy giá trị nồng độ Insulin trong dung dịch mẫu sau khi hiệu

chỉnh Error! Bookmark not defined Hình 3.15: Khả năng phóng thích của insulin theo thời gianError! Bookmark not defined.

Luận Văn Thạc Sĩ xv CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 2.2: Phương pháp xây dựng đường chuẩn Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.1: Kết quả sự ổn định của kích thước hạt theo thời gianError! Bookmark not defined.

Luận Văn Thạc Sĩ 1 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

MỞ ĐẦU

Ngày nay, với sự phát triển trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khỏe con người, nhiều công nghệ mới đã được sử dụng rộng rãi mà tiêu biểu là ứng dụng của công nghệ nano vào quá trình tổng hợp những chất dẫn thuốc mới, tạo ra những sản phẩm tốt hơn, ngày càng đáp ứng được những yêu cầu cao trong lĩnh vực điều trị bệnh, sản phẩm tạo

ra có đặc tính phân hủy sinh học và không gây hại cho sức khỏe con người

Với sự phát triển như vũ bão về kinh tế làm cho chất lượng cuộc sống ở nước ta cải thiện rất nhiều Tuy vậy, chính sự phát triển nhanh chóng kéo theo sự tăng lên đột biến một số bệnh mang đặc thù của những nền kinh tế phát triển như: bệnh tiểu đường, bệnh gút, bệnh rối loạn chuyển hóa lipid… Trong đó bệnh tiểu đường nằm trong nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa đang trở nên phổ biến và là vấn đề y tế nhức nhối hiện nay Hiện nay, hầu hết việc điều trị bệnh đái tháo đường được thực hiện bằng cách tiêm insulin vào cơ thể mỗi ngày Việc tiêm insulin vào cơ thể được cho là gây nhiều đau đớn và nguy cơ nhiễm trùng Các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới đã tích cực nghiên cứu vấn đề này nhưng chưa đạt được kết quả như ý Insulin bản thân là một protein bị phân hủy nhanh chóng trong thành ruột bởi các men tiêu hóa và môi trường

pH thấp Điều này cản trở việc đưa insulin vào cơ thể bằng đường uống Viên uống insulin có thể giúp bệnh nhân tiểu đường uống thuốc dễ dàng mà không cần phải tiêm Nhờ lớp vỏ bọc, chất insulin được bảo vệ cho đến khi tiếp cận ruột non và được hấp thụ vào máu chứ không bị hủy hoại bởi axit ở miệng, họng và dạ dày Cho đến hiện tại chỉ có thuốc tiêm insulin, một số ít có dạng khác như hít, dán… Chính vì vậy, lĩnh vực thuốc uống insulin thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

Chitosan là một trong những polymer được ứng dụng rộng rãi trong quá trình truyền dẫn thuốc Việc dẫn truyền thành công những loại thuốc như protein, insulin,… là một trong những chủ đề được nhiều nghiên cứu nhiều năm nay trong ngành dược Trong số những phương pháp dẫn truyền khác nhau, dẫn truyền đường uống là cách dẫn truyền thuận tiện nhất, đặc biệt khi quá trình điều trị bệnh kéo dài Hơn nữa với hệ tải này, còn có khả năng giúp quá trình tải thuốc chậm hơn, tăng khả năng hấp thụ insulin vào trong máu, từ đó tăng khả năng trị bệnh tiểu đường của thuốc

Những hạt chitosan gắn mPEG (Methoxypolyethylene glycol amine), là một polymer