Đánh giá lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm

- Từ thực trạng trên đó cỏc nhà quản lý trong ngành Y tế, thỳ y đưa ra cỏc chớnh sỏch quản lý vĩ mụ, vi mụ trong việc sử dụng thuốc kớch thớch tăng trưởng; nghiờn cứu đưa ra cỏc tiờu chu

Bộ y tế Viện Dinh D−ỡng

Báo cáo tổng kết đề tài

đánh giá l−ợng tồn d− thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm

Chủ nhiệm đề tài: trần quang thủy

PHẦN A: TểM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1 KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

(a)- Đúng gúp mới của đề tài

- Xõy dựng quy trỡnh phõn tớch thuốc kớch thước tăng trưởng dạng khỏng sinh và hocmon cú

độ tin cậy và chớnh xỏc cao, ỏp dụng được tại cỏc phũng phõn tớch thực phẩm tại Trung ương, Thành phố và tuyến Tỉnh

- Nờu được thực trạng tỡnh sử dụng thuốc; cỏc dạng và loại thức ăn chăn nuụi gia sỳc gia cầm

cú bỏn trờn thị trường Hà nội; và tỉ lệ tồn dư thuốc khỏng sinh, hocmon trong thịt gia sỳc gia cầm tại cỏc chợ trọng điểm và một số cơ sở chăn nuụi của Hà Nội

- Từ thực trạng trên đó cỏc nhà quản lý trong ngành Y tế, thỳ y đưa ra cỏc chớnh sỏch quản lý

vĩ mụ, vi mụ trong việc sử dụng thuốc kớch thớch tăng trưởng; nghiờn cứu đưa ra cỏc tiờu chuẩn giới hạn tồn dư cho phộp cỏc loại thuốc kớch thớch tăng trưởng gia sỳc gia cầm chưa được ban hành trong ngành Nụng nghiệp và Y tế; đồng thời thỳc đẩy giỏm sỏt chặt chẽ hơn nữa cỏc cơ sở chăn nuụi trong nước, sản xuất thịt và sản phẩm gia sỳc gia cầm đạt tiờu chuẩn chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm (CLVSATTP)

(b)- Kết quả cụ thể (cỏc sản phẩm cụ thể)

- Quy trỡnh phõn tớch thuốc kớch thớch tăng trưởng trong thịt gia sỳc, gia cầm

- Số lượng và chủng loại thuốc kớch thớch thớch tăng trưởng (dạng khỏng sinh và hocmon) và thức ăn gia sỳc sử dụng trong chăn nuụi gia sỳc, gia cầm

- Giỳp cỏc nhà quản lý trong ngành Nụng nghiệp và Y tế thấy được tỡnh hỡnh sử dụng thuốc kớch thớch tăng trưởng trong thịt gia sỳc gia cầm tại địa bàn Hà Nội để đưa ra chớnh sỏch quản lý, giỏm sỏt, kiểm tra hữu hiệu từ khõu nguyờn liệu, chăn nuụi, phõn phối thịt gia sỳc trờn địa bàn Hà nội núi riờng và trong cả nước núi chung và nhanh chúng ban hành tiờu chuẩn lượng cho phộp lớn nhất đối với lượng tồn dư thuốc kớch thớch tăng trưởng trong thịt gia sỳc gia cầm và cỏc sản phẩm của chỳng

- Đưa ra cỏc tiờu chuẩn hiện hành của JECFA, WHO/FAO, JAPAN về lượng tồn dư cho phộp lớn nhất thuốc kớch thớch tăng trưởng trong thịt gia sỳc gia cầm để cỏc ban ngành nước

ta tham khảo

- Đưa ra tài liệu về thức ăn chăn nuụi gia sỳc gia cầm và vấn đề sử dụng thức ăn chăn nuụi an toàn cho người tiờu dựng

(c)- Hiệu quả về đào tạo

- Đào tạo cho cỏc phũng thử nghiệm thực phẩm tuyến Tỉnh kỹ thuật phõn tớch khỏng sinh và hocmon trong thực phẩm gia sỳc gia cầm, phự hợp với cỏc điều kiện trang thiết bị phõn tớch hiện cú của phũng thử nghiệm

- Hướng dẫn cho cỏc nhà quản lý, sản xuất đưa ra thị trường cỏc loại thức ăn chăn nuụi đỳng cụng thức phối trộn nguyờn liệu và thành phần thuốc, đỳng quy cỏch và quy định

- Hướng dẫn người chăn nuụi sử dụng thức ăn chăn nuụi gia sỳc gia cầm an toàn, nhằm đưa

ra thị trường sản phẩm thịt sạch, đảm bảo Vệ sinh an toàn thực phẩm

- Bổ sung kiến thức cho người tiờu dựng biết được về tồn dư thuốc kớch trưởng trong sản phẩm thịt gia sỳc, gia cầm cú bỏn trờn thị trường và tỏc hại của thuốc

(d)- Hiệu quả về kinh tế

- Hướng dẫn nhà sản suất sản xuất cỏc loại thức ăn chăn nuụi cú sử dụng cỏc loại thuốc kớch thớch tăng trưởng cú hiệu quả theo từng giai đoạn chăn nuụi; nhằm tăng sản lượng thịt gia sỳc gia cầm sạch, từng bước đỏp ứng được nhu cần tiờu thụ của người dõn

- Chi phớ kiểm nghiệm cho chỉ tiờu thuốc kớch thớch tăng trưởng (khỏng sinh và hocmon) tại cỏc phũng thớ nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm ớt tốn kộm, vẫn đạt độ chớnh xỏc và tin cậy cao

(e)- Hiệu qủa về xó hội

- Nõng cao nhận thức của cỏc nhà quản lý, sản xuất và người tiờu dựng về vai trũ, tỏc dụng, tỏc hại của thuốc kớch thớch tăng trưởng trong trong chăn nuụi và tồn dư thuốc trong thịt và sản phẩm của gia sỳc gia cầm trong sản xuất và đời sống xó hội

- Người tiờu dựng thụng thỏi hơn, biết chọn sản phẩm thịt gia sỳc gia cầm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, ngăn ngừa được cỏc bệnh cú liờn quan đến thuốc kớch thớch tăng trưởng cú thể dẫn đến cỏc bệnh tiềm ẩn và hiểm nghốo gỏnh nặng cho xó hội như bộo phỡ giả tạo, biến đổi giới tớnh do sử dụng thịt gia cầm gia sỳc cú dư lượng khỏng sinh và hocmon cao vượt quỏ mức quy định cho phộp

(f)- Cỏc hiệu quả khỏc

2 áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống x∙ hội

- Ap dụng Quy trình phân tích đề tài xây dựng để phân tích dư lượng thuốc kích thích tăng trưởng trong thực phẩm tại các Phòng Thử nghiệm phân tích Trung ương, Tỉnh, Thành phố

- Đề tài nêu ra các loại thuốc kháng sinh, hocmon và các dạng công thức thức ăn chăn nuôi

3 đánh giá thực tiễn đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đ∙ được phê duyệt

(a) Tiến độ

- Do ảnh hưởng của dịch cúm gia cầm, hiện tượng nở mồm long móng ở gia súc gia cầm nên việc mua mẫu gặp nhiều khó khăn, bị trễ về thời gián tiến độ đề tài nghiên cứu

(b)- Thực hiện mục tiêu nghiên cứu

- Đảm bảo thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu đề ra của đề tài

(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương

- Sản phẩm tạo ra của đề tài đáp ứng đủ các dự kiến của đề cương

(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí

- Khối lượng đề tài lớn, tập trung vào xây dựng quy trình phân tích, và kinh phí cho kiểm nghiệm chỉ tiêu kháng sinh và hocmon khá cao; nhưng vẫn đảm bảo các mục tiêu nghiên cứu

đề ra Do vậy đạt hiệu quả cao trong việc sử dụng kinh phí được cấp

4 Các ý kiến đề xuất

- Cần có sự phối hợp liên ngành trong quản lý thuốc và các cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi

có sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng, thịt và sản phẩm gia súc gia cầm bán trên thị trường tiêu thụ như siêu thị và bán lẻ

- Xây dựng và ban hành tiêu chuẩn các về thuốc kích thích tăng trưởng trong thức ăn chăn nuôi và thịt gia súc gia cầm

- Xây dựng các Phòng thử nghiệm trọng điểm tại tỉnh thành có năng lực cao trong kiểm soát

được chất lượng và VSATTP Từng bước đa dạng hóa khả năng phân tích các chỉ tiêu chất lượng và VSATTP của các PTN thuộc ngành Y tế, tỉnh thành đặc biệt đối với hàng hóa thực phẩm xuất nhập khẩu trong và ngoài nước

Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết quả

nghiên cứu đề tài cấp Bộ

1 Đặt vấn đề 1.1 Tóm lược những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài Tính cấp thiết cần nghiên cứu của

đề tài

Nhờ những tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật mà ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi đã ngày một phong phú và không ngừng phát triển Các chủng loại thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm chế biến sẵn trên thị trường hiện nay rất đa dạng Ngoài các thành phần cơ bản cung cấp năng lượng như protein, lipid, glucid, người ta còn bổ sung chất khoáng, vitamin, kháng sinh và chất tăng trọng giúp cho con vật vừa lớn nhanh vừa có khả năng chống đỡ bệnh tật Những lợi ích của thức ăn đóng gói sẵn rất

dễ nhận thấy, người chăn nuôi vừa không mất nhiều thời gian tìm nguồn nguyên liệu, chế biến phù hợp với từng thời kỳ sinh trưởng của con vật mà lại cho năng suất rất cao nhưng nếu buông lỏng quản lý chất lượng các loại thức ăn chăn nuôi và chạy theo lợi nhuận sẽ có thể dẫn tới những sai sót khó lường trong sản xuất, sử dụng thức ăn chăn nuôi chế biến sẵn, gây hậu quả nghiêm trọng đến chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, ảnh hưởng lớn tới sức khỏe người tiêu dùng

Một số nghiên cứu đã đề cập đến những tác dụng ngoài ý muốn của kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong thức ăn chăn nuôi chế biến sẵn đến chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Người tiêu dùng ngày nay đã cảnh giác với những thực phẩm có liên quan đến công nghệ sinh học, các loại phụ gia thực phẩm và việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị bệnh tật cho người và gia cầm, gia súc Việc lạm dụng các chất kháng sinh và hocmon bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gần đây đã được cảnh báo, tuy nhiên lượng tồn dư trong thịt gia cầm, gia súc vẫn chưa được xác định cụ thể Do vậy, để cung cấp số liệu có tính khoa học, Khoa Hóa Thực phẩm và Vệ sinh an toàn thực phẩm-Viện Dinh dưỡng đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Đánh giá lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm”

Hy vọng kết quả của đề tài sẽ góp phần đề xuất biện pháp tăng cường công tác quản lý việc sản xuất và sử dụng một cách có hiệu quả thức ăn chế biến sẵn nhằm thúc đẩy sự phát triển

có của phòng thử nghiệm; tiến hành thẩm định kỹ thuật đạt; tiêu chuẩn áp dụng thử nghiệm tại Phòng thử nghiệm

- áp dụng quy trình phân tích đã xây dựng xác định lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt và phủ tạng gia súc gia cầm tại các chợ trọng điểm và 2 cơ sở chăn nuôi của

Hà Nội

- Khảo sát, tìm hiểu, ghi chép các loại thuốc kích thích tăng trưởng dạng kháng sinh và hocmon và các loại thức ăn gia súc gia cầm có bán trên thị trường Hà Nội

- Tham khảo và nghiên cứu trong và ngoài nước đưa ra tài liệu về thức ăn gia súc của ; vấn đề

an toàn trong sử dụng

- Xử lý thống kê kết quả phân tích

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong mẫu thịt lợn và thịt gà trên thị trường Hà Nội

- Thu thập các loại thuốc kích thích tăng trọng dùng cho gia súc gia cầm trên địa bàn

Hà Nội, danh mục được phép theo khuyên cáo của FAO/WHO và bị cấm

- Khảo sát thị trường bán thức ăn gia súc có sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng Tài liệu về thức ăn tăng trọng và an toàn trong sử dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Địa điểm, thời gian phân tích mẫu

- Khoa Hóa-Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm và Phòng Hóa Độc Thực phẩm/Trung Tâm

Kiểm Nghiệm VSATTP, Viện Dinh Dưỡng

- Thời gian tiến hành 2004 - 2006

2 Tổng quan của đề tài:

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài

Tình hình nghiên cứu ngoài nước đối với thuốc kích thích tăng trưởng dạng kháng sinh và hocmon đối với thực phẩm phát triển mạnh mẽ tại nhiều nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản từ đầu những năm 1960 về phương pháp phân tích trên các thiết bị như Sắc ký lỏng, Sắc ký khí, Elysa và đến đầu 1970 các kỹ thuật khối phổ ra đời có thể phân tích tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng dưới dạng vết siêu nhỏ Có nhiều khảo sát tại tại các nước phát triển cũng như các nước kém phát triển tại Châu Phi và gần đây tại Trung Quốc, cho thấy dư lượng thuốc kháng sinh và hocmon trong thực phẩm và đặc biệt trong thịt gia súc gia cầm khá cao đáng báo động với tỉ lệ cao Do vậy việc nghiên cứu tình hình sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng trong sản xuât, chăn nuôi và đến sản phẩm thực phẩm, thủy sản xuất nhập khẩu được đặc biệt chú trên thế giới trong thời gian qua

Các phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh và hocmon trong thực phẩm

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phân tích tồn dư kháng sinh và hocmon trong thịt cũng như phủ tạng động vật, phần lớn các phương pháp đều sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao [7; 8; 9; 10; 11; 12 ; và 18; 19; 20; 21; 22; và 24; 25; 26; 27; 28; 29]

tetracyclin được chiết và làm sạch bằng chiết pha rắn, sau đó định lượng trên sắc ký lỏng sử dụng các detector UV hoặc PDA Đối với các mẫu có dư lượng rất nhỏ, người ta sử dụng sắc

ký lỏng khối phổ để định lượng [19]

Phân tích olaquindox và cacbadox

Olaquindox và carbadox là hai chất thuộc nhóm quinoxaline 1,4-dioxide, được dùng ở một số nước để kích thích tăng trưởng và điều trị ỉa chảy trên gia súc Do những nguy cơ về khả năng gây đột biến gen và gây ung thư của các chất này và một số chất chuyển hóa của chúng, EU đã cấm sử dụng hai loại hóa chất này từ năm 1998 Để giám sát việc sử dụng các chất olaquindox và carbadox trong chăn nuôi, các phương pháp phân tích cũng đã được phát triển và áp dụng để phân tích trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm từ gia súc, gia cầm Các phương pháp được áp dụng để xác định tồn dư olaquindox, carbadox và các chất chuyển hóa chính là sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ UV hoặc DAD [9, 10]

Phân tích các hocmon steroid

Các hocmon steroid có thể có mặt trong thịt các loại gia súc, gia cầm với hàm lượng rất thấp vài àg/kg (ppb) Bản thân động vật cũng tự tổng hợp các loại hocmon này trong quá trình chuyển hóa tự nhiên các protein và chất béo Vì vậy các hocmon này được biết là có thể

ảnh hưởng đến sự phát triển và phân bố của các mô mỡ và cơ Mức độ và tỷ lệ các loại hocmon, các chất tiền thân và các chất chuyển hóa phụ thuộc vào các điều kiện sinh lý, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của môi trường, trong đó có điều kiện và thức ăn chăn nuôi Vì vậy, việc giám sát hàm lượng các hocmon steroid là rất quan trọng để đánh giá chất lượng thịt gia súc, gia cầm Tuy nhiên thực tế rất khó có thể phân biệt được đâu là hocmon nội sinh và

đâu là lượng hocmon được đưa vào qua quá tình chăn nuôi Vì vậy thông thường người ta phải xác định tỷ lệ giữa các loại hocmon, tỷ lệ các chất tiền thân và các chất chuyển hóa Nhiều phương pháp phân tích đã được phát triển để xác định hàm lượng hocmon trong thịt như phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp miễn dịch, phương pháp sắc ký khí khối phổ và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ [22, 28] Để đạt độ chính xác cao hơn, người ta có thể kết hợp nhiều phương pháp với nhau, chẳng hạn kết hợp phương pháp miễn dịch và phương pháp sắc ký khí khối phổ Phương pháp phân tích miễn dịch đặc biệt phù hợp để phân tích sàng lọc nhiều mẫu với độ nhạy rất cao

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài

Ơ Việt Nam kháng sinh được dùng rộng rãi để chữa bệnh cho người và gia súc, người

ta đã phát hiện ra rằng nếu đưa một lượng nhỏ kháng sinh vào thức ăn gia súc gia cầm thì không những hạn chế nhiều bệnh truyền nhiễm mà còn làm con vật lớn nhanh, cho nhiều thịt

và nhiều trứng Sau đó, kháng sinh ngày càng được dùng phổ biến trong chăn nuôi Người ta

đã trộn kháng sinh vào thức ăn gia súc với liều lượng thích hợp nhằm kích thích sinh trưởng

đối với gia súc còn non và mang lại hiệu quả trong trường hợp thức ăn kém chất lượng, chuồng trại ẩm ướt mất vệ sinh và những vùng có dịch bệnh thường xuyên xẩy ra ở những

con vật mới vào giai đoạn phát triển thì kháng sinh có hiệu quả mạnh hơn con vật trưởng thành Đối với gia súc tiết sữa như bò sữa, lợn nái đang tiết sữa, kháng sinh có tác dụng không rõ ràng, có thể kháng sinh tiết qua sữa gây ảnh hưởng đến chất lượng sữa, không nên

bổ sung kháng sinh vào thức ăn nếu không vì mục đích chữa bệnh cho con vật [1, 2]

Bên cạnh những lợi ích dễ nhận thấy của thức ăn chăn nuôi có bổ sung kháng sinh, những tác dụng không mong muốn của kháng sinh ngày càng thể hiện rõ rệt Dùng kháng sinh với liều lượng thấp và liên tục đã làm xuất hiện vi khuẩn kháng lại kháng sinh Kháng sinh không những loại bỏ những vi khuẩn có hại mà còn tiêu diệt các vi khuẩn có ích như vi khuẩn tạo vitamin nhóm B trong đường tiêu hoá Do vậy, đã có những khuyến cáo hạn chế hoặc không dùng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, chỉ sử dụng tập trung vào những giai

đoạn gia súc dễ bị khủng hoảng như cai sữa sớm và tránh các loại kháng sinh thường dùng để chữa bệnh cho con người

Một số kháng sinh khi sử dụng với hàm lượng cao gây ra tình trạng kháng kháng sinh, gây khó khăn cho công tác phòng chống bệnh tật cho gia cầm, gia súc Lượng tồn dư vượt mức cho phép kháng sinh trong thực phẩm vừa ảnh hưởng tới giá trị cảm quan của món ăn lại vừa có hại tới sức khoẻ người tiêu dùng Tại phiên họp của Hội đồng chuyên gia JECFA của FAO/WHO được tổ chức năm 1999 tại Rome, Italia nhằm đánh gía tồn dư một số thuốc thú y trong thực phẩm đã đưa ra giới hạn lượng ăn vào hàng ngày có thể chấp nhận và giới hạn tối

đa cho phép của một số kháng sinh Với Dihydrostreptomycin/streptomicin lượng ăn vào hàng ngày có thể chấp nhận là 0-50 ppb theo trọng lượng và giới hạn tồn dư tối đa cho phép trong thịt lợn, thịt gà, thịt bò (thịt bắp) kể cả gan là 600 ppb, còn trong thận là 1000 ppb Lượng ăn vào hàng ngày có thể chấp nhận đối với Neomycin là 0-60 ppb theo trọng lượng và giới hạn tồn dư tối đa cho phép trong thịt bò, lợn, gà là 500 ppb, lượng tồn dư cho phép trong gan, thận cao hơn 3-4 lần so với thịt bắp [3, 14, 16]

Gần đây ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã đề cập đến vấn đề dư lượng kháng sinh nhóm tetracycline trong thịt và phủ tạng [15] Kết quả khảo sát cho thấy rằng, khi sử dụng thức ăn nuôi lợn chứa chlortetracyclin với hàm lượng 110 ppm hoặc 330 ppm trong khoảng thời gian liên tục 31 và 98 ngày tương ứng thì dư lượng chlortetracyclin trong gan và thận cao gấp 10 lần dư lượng trong phần thịt mỡ Nghiên cứu tương tự ở gà cũng cho thấy khi cho gà

ăn thức ăn chứa 220 ppm chlortetracyclin, lượng tồn dư, sau khi ngừng cho ăn, ở gan và thận

là 0,66 và 0,42 (ppm) tương ứng, trong khi tồn dư ở phần da có dính mỡ chỉ là 0,02 ppm Những nghiên cứu này cũng cho thấy sau một ngày ngừng cho ăn thức ăn có chứa

nhau ở các loại vật nuôi Chất này được hấp thu nhanh chóng ở đường ruột và thải trừ qua

đường nước tiểu ở lợn, khi bổ sung olaquindox vào thức ăn với hàm lượng 60 ppm, sau 28 ngày tồn dư olaquindox còn dưới 0,005 ppm ở phần thịt và dưới 0,01 ppm trong thận

Trong nhiều năm qua, một số loại hocmon và các dẫn suất của nó đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trưởng cho gia cầm, gia súc [8,9,10] Khi trộn thyroxin vào thức ăn với lượng nhỏ 40-60 (ppm) có tác dụng tăng trưởng rõ rệt đối với gia cầm, gia súc đang ở trong tình trạng thiếu hụt iod hoặc khẩu phần ăn hàng ngày không cân

đối các chất dinh dưỡng Nếu kéo dài thời gian sử dụng thức ăn chăn nuôi có bổ sung thyroxin và không đủ thời gian cách ly trước khi giết mổ 10 ngày thì lượng tồn dư thyroxin có thể vượt mức cho phép, vi phạm các quy định về chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm [23]

Một số loại nội tiết tố sinh dục progesteron, testosteron, 17β-estradiol cũng đã được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mục đích tăng trọng và nâng cao hiệu quả của thức ăn Tuy nhiên, trong những năm 50-60 của thập kỷ trước do thiếu thận trọng khi đưa hocmon vào thức ăn chăn nuôi nên hàng chục năm sau tại một số nước phát triển như Thuỵ

điển, Anh, Pháp, Scotland người ta đã nhận thấy hậu quả rõ rệt của nó đến tình trạng vệ sinh

an toàn thực phẩm có liên quan đến sức khoẻ cộng đồng Hiện tượng đồng tính luyến ái tăng, giảm mật độ tinh trùng, tinh hoàn lệch, ẩn ở trẻ em trai và tuổi dậy thì ở trẻ em gái sớm hơn

Đến năm 1989, các nước này chỉ cho phép sử dụng testosteron, estradiol trong điều trị bệnh

Đến năm 1999, người ta đã thông báo nguy cơ gây ung thư của 17β- estradiol nên cũng không dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mục đích tăng trọng [1,2]

Phương pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao hiện nay đã được áp dụng tại một số phòng phân tích thực phẩm, để xác định nhiều loại chất kích thích tăng trưởng, trong đó có các hocmon steroid [22, 28] Để phân tích bằng sắc ký, mẫu sau khi chiết xuất, được làm sạch

và làm giàu trước khi tạo dẫn xuất dễ bay hơi, thông thường là silyl hóa Quá trình làm sạch thường rất phức tạp, tốn thời gian và dung môi, vì vậy nhiều tác giả đã nghiên cứu để cải tiến quy trình làm sạch như áp dụng các vật liệu chiết pha rắn để giảm thời gian phân tích và lượng hóa chất sử dụng Việc phân tích các hocmon trong thịt động vật còn phức tạp hơn nhiều, vì vậy thường phải kết hợp phương pháp chiết xuất lỏng lỏng và chiết xuất pha rắn, một số tác giả còn kết hợp chiết pha rắn với làm sạch qua sắc ký lỏng trước khi dẫn xuất và phân tích

Qua khảo sát các loại thức ăn trên thị trường và các điều kiện chăm sóc, đề phòng dịch bệnh cho gia cầm, gia súc ở nước ta hiện nay [1,2,5], đề tài đã tập trung phân tích tồn dư

các kháng sinh nhóm tetracyclin, olaquindox, carbadox; các hocmon steroid và tổng hợp bao

gồm testosteron, progesteron, oestradiol, trenbolon, dexamethason

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1 Thiết kế nghiên cứu

- Tham khảo các tài liệu phân tích Quốc tế về thuốc thích thích tăng trưởng (kháng sinh và hocmon) trong thực phẩm; áp dụng xây dựng Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm tối ưu phù hợp dựa vào điều kiện, trang thiết bị hiện có của Phòng Thử nghiệm Viện Dinh dưỡng; và sau khi tiến hành thẩm định phương pháp nếu đạt độ tin cậy và chính xác; áp dụng phân tích 150 mẫu thịt gia súc gia cầm tại các chợ trong điểm và cơ sở chăn nuôi tại Hà Nội

- Khảo sát các loại thuốc kích thích tăng trưởng và thức ăn gia súc gia cầm có bán trên thị trường Hà nội thuộc thuộc Nhà nước, doanh nghiệp, thị trường tự do và tham khảo tham chiếu tiêu chuẩn về hàm lượng cho phép lơn nhất tồn dư thuốc trong thịt và sản phẩm thịt của gia súc gia cầm theo tiêu chuẩn Quốc tế, tiến tới từng bước xây dựng tiêu chuẩn của Việt nam

- Dựa vào các tài liệu trước đây và hiện có trong và ngoài nước, đưa ra tài liệu về thức ăn chăn nuôi và an toàn cho người sử dụng thịt gia súc gia cầm về Vệ sinh an toàn thực phẩm

- Tư vấn về quản lý, kiểm soát chất lượng và VSATP đối với thức ăn chăn nuôi và thịt gia súc gia cầm

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu

*Đối tượng nghiên cứu

Mua mẫu thịt và phủ tạng gia súc gia cầm tươi sống ngay sau giết mổ tại các chợ trọng điểm phân phối thực phẩm lớn (Chợ Hàng Bè, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định, chợ Thanh Xuân) và tại các cơ sở chăn nuôi (Sóc Sơn, Từ Liêm)

*Cỡ mẫu

- 20 mẫu gia súc, gia cầm x 05 chợ = 100 mẫu

- 25 mẫu gia súc, gia cầm x 02 cơ sở chăn nuôi = 50 mẫu

Cỡ mẫu được tính theo công thức sau:

n = -

Thay các số đã biết vào công thức trên ta tính được cỡ mẫu là:

1,96)2 x 0,1 x (1- 0,1)

n = - = 138 (0,05)2

Đề phòng sơ suất làm hỏng mẫu 8-10% là 12 mẫu, vậy cỡ mẫu phải thu thập là: n =

138 mẫu + 12 mẫu = 150 mẫu

* Chọn mẫu và kỹ thuật lấy mẫu theo (TCVN 4833-1:2002)

Mẫu thịt, gan của gà và lợn được thu thập đại diện ở các chợ nội thành gian từ 8-10 giờ sáng và 2 cơ sở chăn nuôi tại Sóc sơn và Từ liêm, Hà Nội trong ngày Mỗi mẫu thịt gà (thịt đùi và thịt lườn), mẫu thịt lợn (thịt vai và thịt lạc) được lấy tối thiểu là 500g, mẫu gan tối thiểu là 300g, đựng vào túi polyetylen sạch, bảo quản lạnh trong hộp xốp, đưa ngay về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá 3 giờ Tại phòng thí nghiệm, mẫu được tiến hành xử lý sơ bộ và cân lấy lượng mẫu phân tích ngay trong ngày, mẫu còn lại được lưu giữ trong hộp nhựa kín có lắp và được bảo quản ở nhiệt độ -200C tủ lạnh đông [3]

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chỉ tiêu nghiên cứu

- Xây dựng quy trình phân tích chỉ tiêu hàm lượng thuốc kháng sinh, hocmon

- Đánh giá thực trạng tồn dư thuốc trong thịt gia súc gia cầm trên địa bàn Hà Nội

- Xác định danh mục thuốc kích thích tăng trưởng và các loại thức ăn gia súc gia cầm (nguyên liệu, thuốc phối trộn, phụ gia)

- Quản lý sử dụng thuốc trong chăn nuôi và an toàn cho người tiêu dùng

3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

Tham chiếu các tài liệu phân tích trong và ngoài nước, để xây dựng quy trình phân

tích thuốc kích thích tăng trưởng với điều kiện hiện tại của Phòng kiểm nghiệm thực Viện Dinh dưỡng có đánh giá các thông số thẩm định của phương pháp Sau đó áp dụng Quy trình phân tích lượng tồn dư thuốc kháng sinh và hocmon trong thịt gia súc, gia cầm

phẩm-3.3.2.1 Phương pháp phân tích tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin

a) Nguyên lý

Mẫu được chiết với đệm McIlvaine và TCA và làm sạch bằng chiết pha rắn RP-C18- Supelco Xác định tetracyclin trong gia súc gia cầm bằng Hệ thống sắc ký lỏng với detectơ PDA ở bước sóng 365nm Pha động 0,01M axít oxalic-axetonitri-metanol (80:13:7,v:v:v), cột sắc ký lỏng pha ngược RP-C18 (250 x 4,6mm x 5àm)

b) Phạm vi áp dụng

Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật

c) Tài liệu tham chiếu

A.L Cinquina, F Longo, G Anastasi, L Giannetti, R Cozzani (2003) Validation of a performance liquid chromatography method for the determination of oxytetracycline,

high-tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in bovine milk and meat Journal of

Chromatography A, 987: 227-233[11].

d) Dụng cụ, thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng Breeze/Water với các detecto UV 2487 và bơm 1525

Hệ thống sắc ký lỏng Empower bơm mẫu tự động, với detecto PDA 2996 và detecto huỳnh quang 2487

Cột Symmetry C18 (Waters -Mỹ), 5àm x 4,6mm x 150mm, kèm bảo vệ cột Symmetry Guard C18

d) Hóa chất, dung môi, dung dịch đệm

Các hóa chất và dung môi thuộc loại tinh khiết phân tích:

Etanol (Prolabo - Pháp) Metanol, axetonitril (J.T Baker - Mỹ) n-hexan và axít clohydric (Merck - Đức)

Chất chuẩn tetracyclin C22H24N208/444,43; oxytetracyclin C22H24N209/460,44; và chlortetracyclin C22H23ClN208/470,84 (Sigma-Mỹ)

Dung dịch đệm :

Đệm McIlvaine pH 4±0.05: Cân 28,4 g Na2HPO4 cho vào bình định mức 1l và hoà tan bằng nước cất rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp Cân 21,0 g axít xitric monohydrat vào bình định mức 1l khác, hoà tan bằng nước cất và định mức tới vạch, lắc kỹ Lấy 1l axít xitric

ở trên trộn với 625 ml Na2HPO4 trong bình 2l Điều chỉnh pH tới 4±0,05 bằng cách thêm từng giọt HCl 0,1M (8,3ml HCl đặc/l) hoặc NaOH 0,1M (4g/l) Dung dịch này sử dụng được trong

1 tuần

tránh ánh sáng trực tiếp và bảo quản trong bình màu nâu

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: cân 100 ± 0,1mg các chất chuẩn tetracyclin,

oxytetracyclin và chlortetracyclin vào từng cốc 50ml, hoà tan và chuyển vào bình định mức 100ml, định mức bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở

40C có thể sử dụng được trong 3 tháng

Hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc 100 ppm: lấy 10ml mỗi dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm ở trên cho vào 1 bình định mức 100ml, pha loãng tới vạch mức bằng metanol ở nhiệt độ

phòng và lắc kỹ hỗn hợp Bảo quản ở 40C

Dung dịch chuẩn làm việc các kháng sinh nhóm tetracyclin 25 ppm: lấy 2,5ml dung

dịch chuẩn hỗn hợp gốc hàm lượng 100 ppm vào trong bình định mức 10ml, định mức tới vạch bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc đều hỗn hợp Bảo quản ở 40C, pha mới dung dịch này hàng tuần

Dung dịch chuẩn các kháng sinh nhóm tetracyclin chạy sắc ký 0,05; 0,1; 0,25; 0,5

và 1,0 (ppm): lấy 20; 40; 100; 200 và 400 (àl) chuẩn hỗn hợp tetracycline làm việc cho vào

các bình định mức 10ml Thêm 6ml axít oxalic trong metanol vào mỗi bình Định mức tới vạch bằng nước cất ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hỗn hợp Bảo quản ở 40C, pha mới hàng ngày

f) Xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn các kháng sinh tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin được xây dựng bằng cách phân tích dãy chuẩn kháng sinh có nồng độ từ 0,05 đến 1 (ppm) Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính đối với từng loại kháng sinh được xác định ở các hình dưới đây

Đường chuẩn oxytetracycline

y = 83716x + 121.76

R 2 = 0.9998

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ppm Diện tích

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ppm Diện tích

Đường chuẩn chlortetracycline

y = 31515x + 29.08

R 2 = 0.9981

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ppm Diện tích

g) Các bước tiến hành

Chiết và làm sạch mẫu:

Cân 5,00 ± 0,05g mẫu vào bình nón có nút mài 50ml, thêm 20ml dung dịch đệm McIlvaine EDTAvà siêu âm lạnh trong 30 phút (hoặc lắc mạnh bằng máy lắc ngang trong 30 phút) Gạn lấy dịch trong vào bình nón khác, bã được chiết 2 lần như trên mỗi lần bằng 5ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA, gộp dịch trong vào bình nón, thêm 3ml axít tricloaxetic 0,5g/ml vừa cho vừa lắc nhẹ trong khoảng 1 phút Để bình nón vào nước đá 15 phút, lọc thu lấy dịch trong vào bình nón 30ml Dịch lọc sau đó được cho qua cột SPE-C18 (hoạt hoá bằng 6ml MeOH, 6ml nước cất: 2 lần) Rửa cột SPE bằng 10ml nước cất, hút chân không đến khô Rửa giải bằng 2ml MeOH Dịch rửa giải được bơm vào cột tách sắc ký lỏng để xác định tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin Quy trình phân tích được tóm tắt như sau:

6ml MeOH

6ml nước cất

hoạt hoá

Rửa bã 5ml đệm McIlvaine x 2 lần và Lặp lại chiết như trên

Siêu âm trong 30 phút (hoặc lắc mạnh bằng máy lắc ngang)

Gộp dịch lọc qua phễu lọc vào bình nón hoặc ly tâm lạnh 4000v/p, 4oC trong 15p

3ml axít tricloaxetic 0,5g/ml và lắc nhẹ trong 1 phút; để lạnh 15 phút và lọc Lọc dịch mẫu qua phễu lọc vào bình nón 30ml hoặc ly tâm lạnh 4000v/p, 4oC trong 15p

Làm sạch qua cột SPE-C18

Rửa giải bằng 2 ml axít oxalic trong etanol, cho vào lọ/vial 2 ml

Cho 5 g mẫu vào bình nón

20ml đệm McIlvaine

3ml dịch lọc mẫu

Rửa tạp: 3ml H2O cất x 3 lần, sau đó hút chân không đến khô

Am: Diện tích pic mẫu

Ac: Diện tích pic chuẩn

Vd: Thể tích dịch cuối (ml) m: khối l−ợng mẫu phân tích (kg)

* Quy trình phân tích nhóm tetracyclin có độ đúng và độ chính xác:

- Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,9997

- Hệ số thu hồi: đối với oxytetracyclin ở nồng độ 25 ((ppm)) là 84%; tetracyclin 87%; chlortetracyclin 92%

- Giới hạn phất hiện (LOD): đối với oxytetracyclin 0,027 ppm; với tetracyclin 0,036

ppm, chlortetracyclin 0,055ppm.

- Giới hạn định l−ợng (LOQ): đối với oxytetracyclin 0,09 ppm; tetracyclin 0,12 ppm;

với trenbolone, chlortetracyclin 0,18 ppm

đ−ợc minh hoạ ở phần thẩm định (phụ lục 1)

3.3.2.2 Phương pháp phân tích cacbadox

a) Nguyên lý

Cacbadox được chiết từ mẫu thịt bằng etanol, sau đó loại tạp bằng cách chiết lỏng - lỏng với dung dịch đệm và n-hexan, làm sạch qua cột oxýt nhôm và phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ UV ở bước sóng 350nm

b) Phạm vi áp dụng

Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật

c) Tài liệu tham chiếu

MacIntosh AI, Neville GA (1984) Liquid chromatographic determination of carbadox, desoxycarbadox, and nitrofurazones in pork tissues J Assoc Off Anal Chem Sep-Oct; 67(5):958-62 [23]

d) Dụng cụ, thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng Breeze với các detectơ UV 2487 và bơm 1525

Hệ thống sắc ký lỏng Empower bơm mẫu tự động, với detectơ PDA 2996 và detecto huỳnh quang 2487

Cột Symmetry/Water - C18, (150mm x 4,6mm x 5àm), cột bảo vệ Symmetry Guard

e) Hóa chất, dung môi

Các hóa chất và dung môi thuộc loại tinh khiết phân tích:

Etanol, etyl axetat (Prolabo-Pháp) Metanol, axetonitri (Merck) n-hexan và axít clohydric, bột oxýt nhôm-Al203, celit (Merck-Đức)

Chuẩn carbadox C11H10N404/263,25 (Sigma-Mỹ)

Axít metaphotphoric 3.6%, amoni axetat (Prolabo-Pháp)

Đệm kali dihydrogen photphat (KH2PO4) 0.2 M, pH = 3.5

f) Pha dung dịch chuẩn

Đường chuẩn cacbadox được xây dựng bằng cách phân tích dãy chuẩn có nồng độ từ 0,05 đến 0,5 (ppm) Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính đối carbadox được thể hiện ở hình dưới đây

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

ppm Diện tích

h) Các bước tiến hành: Quy trình phân tích cacbadox:

Cân 10 g mẫu đã đồng nhất

100 ml etanol Chiết bằng máy xay trong 10 phút

Lọc qua một lớp Celit 545, thu lấy dịch lọc

Thêm vào dịch lọc 25 ml axít metaphotphoric 3,6%

Lắc đều, cô quay chân không đến khoảng 25 ml

Thêm 5 ml hexan, lắc đều, ly tâm

Thêm 10 ml KH2PO4 0,2 M

Trộn đều, thêm nước đến 100ml, chuyển sang bình gạn Chiết 3 lần, mỗi lần bằng 50 ml etyl axetat Gộp dịch chiết hữu cơ, loại nước bằng Na2SO4

Am: Diện tích pic mẫu

Ac: Diện tích pic chuẩn

Vd: Thể tích dịch cuối (ml)

m: khối l−ợng mẫu phân tích (kg)

* Quy trình phân tích cacbadox có độ đúng và độ chính xác:

- Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,9987

- Hệ số thu hồi: với mẫu nạp chuẩn nồng độ 0,1 (ppm) là 68%

Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật

c) Tài liệu tham chiếu

Spierenburg, T.J., H Van Lenthe, G DeGraff, and L.P Jagen (1988) Liquid chromatographic determination of olaquindox in medicated feeds and in contents of porcine gastrointestinal tract J Assoc Off Anal Chem Nov-Dec; 71(6):1106-9 [29]

d) Dụng cụ, thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng Breeze với các detecto UV 2487 và bơm 1525

Hệ thống sắc ký lỏng Empower bơm mẫu tự động, với detecto PDA 2996 và detecto huỳnh quang 2487

Cột Symmetry C18 (Waters-Mỹ), 150mm x 5àm x 4,6; cột bảo vệ Symmetry Guard

Cột chiết pha rắn loại phenyl (100mg, 1.5ml), Alltech, Mỹ

e) Hóa chất, dung môi

Các hóa chất và dung môi thuộc loại tinh khiết phân tích:

Etanol (Prolabo - Pháp) Metanol, axetonitril (J.T Baker - Mỹ) n-hexan, amoni axetat (Merck - Đức)

Chuẩn olaquindox C10H10N304 (JAPAN)

f) Pha dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc olaquindox: 100 ppm pha trong metanol Bảo quản tránh ánh sáng và ở 4oC

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ppm Diện tích

h) Các bước tiến hành quy trình phân tích olaquindox:

5 g mẫu đồng nhất

Thêm 20 ml nước cất

Lắc ngang 2 giờ

Ly tâm 15 phút, tốc độ 4500 vòng/ phút

Thu lấy dịch chiết

Làm sạch qua SPE, loại phenyl (5ml)

Điều kiện chạy sắc ký

- Pha động: axetonitril : amoni axetat 0,01M : etanol (25:70:5; v/v/v), pH= 6,8

5 ml ACN: H2O (7,5: 92,5)

Tiến hành sắc ký

Am: DiÖn tÝch pic mÉu

Ac: DiÖn tÝch pic chuÈn

3.3.2.4 Phương pháp phân tích testosteron, progesteron, 17β-estradiol, trenbolon, dexamethason

a) Nguyên lý

Mẫu thịt, gan được chiết bằng đệm axetate (0,2M; pH 5,2) và dung môi MeOH Dịch lọc sau ly tâm được làm sạch chất béo qua cột SPE-C18, rửa giải bằng MeOH đem cô quay, hoà tan cặn bằng hỗn hợp dung môi n-hexan/diclometan (60/40; v/v) Dịch mẫu tiếp tục được làm sạch qua cột SPE-Si và rửa giải bằng hỗn hợp dung môi n-hexan/etyl axetat (25/75; v/v), cô quay chân không hoà cặn bằng axetonitril và tiến hành chạy sắc ký bằng Sắc

ký lỏng với detectơ PDA ở bước sóng 242 và 260nm

b) Phạm vi áp dụng

Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật

c) Tài liệu tham chiếu

1 Jungju Seo, Hye-Young Kim, Bong Chul Chung, Jongki Hong (2005) Simultaneous determination of anabolic steroids and synthetic hocmones in meat by freezing-lipid filtration, solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry

Journal of Chromatography A , 1067: 303-309 [22]

2 Tomoyuki Miyazaki, Takeo Sasamoto, Tsuneo Hashomoto and Yataro Kokubo Determination of Anabolic Agents in beef and milk by HPLC with Photodiode Array Detector Vol.36, No 6 (1995) [28]

d) Dụng cụ, thiết bị

- Hệ thống HPLC Shimadzu; cột Lichrospher pha ngược RP-18 (250mm x 4,6mm x 5àm)

- Máy đồng nhất Ultra – Turrax T25

- Máy ly tâm Mikro 22R-Hettich

- Máy siêu âm đuổi khí Ultrasonic LC30

- Cột làm sạch chiết pha rắn SPE-Si và cột SPE-C18 loại 3ml/Supelco

e) Hoá chất, dung môi, tinh khiết phân tích sắc ký

- Hoá chất, dung môi (Merck) Axetonitril, diclometan, metanol, n-hexan,

- Đệm axetat (0,2M; pH 5,2): hoà tan 27,126g natri axetat trihydrat trong bình

định mức 1l, pha loãng dung dịch tới vạch mức bằng nước cất 2 lần và trộn đều hỗn hợp Dung dịch được sử dụng trong 1ngày

- Thuốc thử độ tinh khiết 98 - 99%

17β-estradiol/C18H24O2/272,4-khối lượng phân tử (Hanvet)

Progesteron/C21H30O2/314,5 (SIGMA)

Testosteron/C19H28O2/288,4 (Acros organics)

Dexamethason/C22H30FO5/392,5 (SIGMA) Trenbolon/C18H2202/270,4 (SIGMA)

f) Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp

Pha dung dịch chuẩn ở điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp và bảo quản trong bình màu nâu:

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: cân 100±0,1mg các chất chuẩn testosteron, progesteron, 17β-estradiol, trenbolon, dexamethason vào từng cốc 50ml, hoà tan và chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng axetonitrill ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 40C có thể sử dụng được trong 3 tháng

Hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc 100 ppm: lấy 10ml mỗi dung dịch chuẩn gốc 1000 àg/ml ở trên cho vào 1 bình định mức 100ml, pha loãng tới vạch mức bằng axetonitrill, lắc kỹ hỗn hợp Bảo quản 4oC

Dung dịch chuẩn làm việc các hocmon 25 ppm: lấy 2,5ml dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc hàm lượng 100àg/ml vào trong bình định mức 10ml, định mức tới vạch bằng axetonitril ở nhiệt độ phòng, lắc đều hỗn hợp Bảo quản ở 4oC Pha mới dung dịch này hàng tuần

Dung dịch chuẩn các hocmon chạy sắc ký 0,0025; 0,005; 0,05; 0,5; 1,0; 2,5 (ppm): hút 1,0; 2,0; 20,0; 200; 400; 1000 (àl) chuẩn hỗn hợp hocmon 25ppm làm việc cho vào các bình định mức 10ml Định mức tới vạch bằng axetonitril ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hỗn hợp Bảo quản ở 4oC, sử dụng được trong 1 tuần

g) Xây dựng đường chuẩn

Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau bằng HPLC thu được các pic có diện tích khác nhau Dựa trên nồng độ các dung dịch chuẩn và diện tích các pic thu

được xác định đường chuẩn cho từng loại hocmon

Duong chuan_Trenbolon

0.5 1

2.5

0.05 0.005 0.025

y = 71919x - 1234.3

-50000 0 50000 100000 150000 200000

2.5

0.05 0.005 0.0025

y = 32036x + 114.42

0 20000 40000 60000 80000 100000

2.5

0.005 0.05

y = 40515x + 62.657

R2 = 0.9998

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000

2.5

0.005 0.05

y = 41969x + 705.83

R 2 = 0.9996

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000

Thịt và gan gà, lợn được xay nhuyễn, cân lấy 10g cho vào ống ly tâm, thêm 10ml

đệm axetat 0,2M (pH-5,2) và 50ml MeOH, nghiền kỹ bằng máy có đầu nghiền dạng thanh, siêu âm 10 phút ở nhiệt độ 60oC, ly tâm trong 15 phút với tốc độ 8000 vòng/phút ở nhiệt độ

40C Sau đó giữ ở nhiệt độ 40C trong 1h để gạn chất béo và lọc Khi cần thiết làm sạch chất béo thêm, hút 5ml dịch chiết thêm cho qua cột SPE-C18 (đã hoạt hóa bằng 6 ml MeOH và 6

ml nước cất), rửa tạp bằng 6ml nước cất và 6ml hỗn hợp dung môi MeOH/nước (40/60; v/v), rửa giải bằng 6ml MeOH Dịch chiết đem cô quay bốc hơi dung môi đến khô ở nhiệt độ

450C Cặn còn lại được hoà tan bằng 3ml hỗn hợp dung môi n-hexan/diclometan (60/40; v/v) Dịch tiếp tục được cho qua cột làm sạch SPE-Si (đã hoạt hoá cột bằng 6ml n-hexan), rửa tạp bằng 6ml hỗn hợp dung môi n-hexan/etyl axetat (75/25; v/v) rồi rửa giải bằng 6ml hỗn hợp dung môi n-hexan/etyl axetat (25/75; v/v) Dịch chiết đem cô quay chân không đến khô, cặn được hoà tan bằng 2ml ACN

*Điều kiện chạy HPLC:

Nhóm hocmon testosteron, dexamethason, progesteron và trenbolon :

- Cột LiChrospher /Supelco RP18 (250mm x 4,6mm x 5àm)

- Pha động: ACN/ MeOH/ H2O (45/10/45, v/v/v), tốc độ dòng 1ml/phút,

- Nhiệt độ cột 300C

- Lượng bơm mẫu 50àl

- Xác định bằng PDA, dải sóng 200 - 400nm, độ phân giải là 8nm, thời gian tích phân là 1,6 sec, bước sóng định lượng là 242nm đối với testosteron, dexamethason, progesteron và trenbolon

là 1,6 giây, bước sóng định lượng là 210 nm, kiểm tra lại ở bước sóng 230nm và 260nm

Quy trình chiết hocmon: 10g mẫu

10ml đệm axetat (0,2M; pH 5,2)

ống ly tâm (100ml), nghiền bằng máy đến đồng nhất kỹ (3 phút) 50ml MeOH (quấy hoặc lắc kỹ)

- Ac: Diện tích pic chuẩn

- Vd: Thể tích dịch cuối (ml)

- m: khối l−ợng mẫu cân (kg)

* Quy trình phân tích hocmon có độ đúng và độ chính xác:

- Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,9996

- Hệ số thu hồi: đối với testosteron, progesteron, oestradiol ở 0,05 (ppm) là 78,6%; ở 0,5 (ppm) - 86,6%; và 2,5 (ppm) - 93,8% Với trenbolon, dexamethason ở 0,005 (ppm) là

74,6%; ở 0,05 (ppm) - 88,4%; và 1,0 (ppm) - 95,1%

- Hệ số biến thiên (C V): đối với testosteron, progesteron, oestradiol ở 0,05 (ppm) là 0,006;

ở 0,5 (ppm) - 0,062; và 2,5 (ppm) - 0,303 Với trenboloe, dexamethason ở 0,005 (ppm) là

3.3.3 Các công cụ nghiên cứu cụ thể

- Trang thiết bị hiện có của Phòng Thử nghiêm:

+ Sắc ký lỏng và khí thường, khối phổ cùng các thiết bị thông thường khác của phòng phân tích thực phẩm

+ Dụng cụ, hóa chất, chuẩn, thuốc thử tinh khiết Sắc ký

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Phần mềm xử lý số liệu kết quả phân của các thiết bị phân tích hiện đại

- Lý thuyết Toán thống kê để thẩm định độ đúng và độ chính xác của Quy trình phân tích (hệ

số biến động, độ lặp lại, sai số thô phép đo )

4 Kết quả nghiên cứu 4.1 Kết quả phân tích kháng sinh tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin

Bảng 4.1: Kết quả phân tích tetracyclin trên 150 mẫu thịt và phủ tạng

TT Loại mẫu Số l−ợng mẫu

phân tích

Số mẫu có phát hiện tetracyclin Tỷ lệ %

Đối với oxytetracyclin chỉ có 2/35 mẫu thịt lợn bị nhiễm, không có mẫu thịt gà và mẫu gan nào phát hiện loại kháng sinh này

Đối với các mẫu phát hiện có kháng sinh, l−ợng tồn d− đã đ−ợc xác định trên thiết bị

sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả thể hiện tại Bảng 4.2 và Bảng 4.3

Bảng 4.2: Tồn d− kháng sinh trong thịt và gan lợn (ppb)

B¶ng 4.3: Tån d− kh¸ng sinh trong thÞt vµ gan gµ (ppb)

TT Tªn mÉu N¬i lÊy mÉu Tetracyclin Oxytetracyclin

H×nh 4.1 : MÉu thÞt n¹p chuÈn hçn hîp tetracyclin (TC), oxytetracyclin (OTC) vµ

chlortetracyclin (CTC)

H×nh 4.2: MÉu thÞt lîn (thêi gian lưu cña

pÝc oxytetracyclin t r = 4.687)

H×nh 4.2: MÉu thÞt gµ (thêi gian lưu cña

pÝc tetracyclin t r = 6.192)

4.2 KÕt qu¶ ph©n tÝch Carbadox vµ olaquindox

H×nh 4.5: ChuÈn carbadox H×nh 4.6: ChuÈn olaquindox

Ph©n tÝch c¸c mÉu thÞt, gan cña gµ vµ lîn thu thËp t¹i Hµ Néi trªn thiÕt bÞ s¾c ký láng

B¶ng 4.4: KÕt qu¶ ph©n tÝch hocmon trªn 150 mÉu thÞt vµ phñ t¹ng

TT Lo¹i mÉu Sè l−îng mÉu

B¶ng 4.5: Tån d− hocmon trong thÞt vµ gan lîn (ppb)

TT Tªn mÉu N¬i lÊy mÉu

Testos-terone

Proges -terone

Oestra -diol

Trenbo- lone

Dexame- thasone

10 Gan lîn Chî Hµng BÌ 21,50

Testos- terone

Proges- diol

Oestra-Trenbo- lone

Dexame- thasone

Bảng 4.7: Bảng tổng hợp mẫu tồn dư 2 loại hocmon và kháng sinh (ppb)

TT Tên

mẫu

Nơi lấy mẫu (Chợ)

17β-estradiol Dexamethason Oxytetracyclin Tetracyclin

2 4 6 8 10 12 14

Te sto ste rol

Pro ges

De xam eth

* Có 43 mẫu phát hiện tồn dư hocmon chiếm 28,67% trên tổng số 150 mẫu phân tích (Bảng 4.4); trong số 43 mẫu nhiễm có 27 mẫu mua tại các chợ (18%) và 16 mẫu lấy tại cơ sở (10,67%):

- Trong đó 30 mẫu lợn/ 70 mẫu phân tích; 13 mẫu gà / 80 mẫu phân tích, phát hiện tồn dư hocmon tương ứng 20,0% và 8,67% - Hình 4.8

* Tỉ lệ % số mẫu gà và lợn phát hiện tồn d− trên 43 mẫu:

30 mẫu lợn (9 thịt, 21 gan) - 69,77% và 13 mẫu gà (3 thịt, 10 gan) - 30,23% Hình 4.9

* 11 mẫu trên tổng số 150 mẫu phân tích phát hiện thấy tồn d− hai loại hocmon trên cùng một mẫu (Bảng 4.5 và 4.6)

- Trong đó Lợn : 7 mẫu/30 mẫu phát hiện; và gà: 4 mẫu/13 mẫu phát hiện

* Số mẫu phát hiện hocmon tổng hợp v−ợt quá giới hạn tồn d− cho phép 8% (12 mẫu/150

Hình 4.9: Tỉ lệ mẫu gà và lợn phát hiện tồn d− trên 43 mẫu

16.3 4.7

7 0

5 10 15 20 25

* Có 4/150 mẫu phân tích tồn d− cả kháng sinh và hocmon - 2,7% (bảng 4.7)

* Sắc ký đồ chuẩn, mẫu và thiết bị phân tích:

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn hocmon Sắc ký đồ của mẫu có Trenbolon

Retention Time Area

Testosterone

* Tiêu chuẩn đánh giá hàm lượng thuốc kích thích tăng trưởng trong gia súc gia cầm dựa

trên Giới hạn tồn dư cho phép lớn nhất (MRL)

- Nhóm 17β- estradiol, progesteron, testosteron Trong thịt và gan: không xác định (not specified) có nghĩa rằng số liệu có giá trị về nhận biết và hàm lượng tồn dư của thuốc thú y trong gia súc, gia cầm biểu thị một khoảng rộng an toàn cho tiêu thụ trong thực phẩm khi thuốc được sử dụng theo cách an toàn Vì lý do đó, và các nghiên cứu trong đánh giá riêng, Hội đồng chuyên gia về phụ gia thực phẩm JECFA của FAO/WHO đã kết luận sự có mặt của dư lượng thuốc trong sản phẩm gia súc gia cầm đã không lo ngại cho sức khoẻ và không cần đưa ra mức giới hạn tồn dư cho phép lớn nhất bằng

số cho ba loại hocmon trên

- Nhóm hocmon tổng hợp theo tiêu chuẩn JECFA và FAO + Trenbolone: thịt 2 ppb; gan 10 ppb

+ Dexamethasone: thịt 0,5 ppb; gan 2,5 ppb

- Theo TCVN 7046:2002 thịt tươi– quy định kỹ thuật (2) dựa trên luật định giữa Việt Nam

và Liên bang Nga về việc xuất khẩu thịt của VN sang Nga; đã được Tổng Cục TCĐLCL ban

hành đưa ra giới hạn tồn dư 3 loại hocmon sau trong thịt; ngoài ra các loại hocmon khác

chưa có trong TCVN + Ostrogen : 0,5ppb + Testosteron: 15ppb + Diethylsthylbestrol (hocmon tổng hợp đã bị cấm) không được có tồn dư

-Theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực thực phẩm 867/1998/QĐ-BYT, giới hạn dư lượng thuốc thú y tối đa cho phép trong sản phẩm thịt quy định cho 05 nhóm thuốc (09 loại thuốc ) trong đó nhóm kháng sinh có 04 thuốc là cloramphenicol, flumequin, olaquindox đều không xác định dư lượng; còn spectinomycin và sunfadimidin đưa ra các giới hạn dư lượng cho phép trong thịt, gan, thận, mỡ, sữa[4]

- Nhóm kháng sinh tetracyclin (OTC, TC, CTC) theo tiêu chuẩn JECFA + Thịt gà, lợn: 100 ppb

+ Gan gà, lợn: 300 ppb

4.4 Danh sách các loại thuốc kích thích tăng trọng dùng cho gia súc gia cầm trên địa bàn Hà Nội, danh mục được phép theo khuyên cáo của FAO/WHO

Chúng tôi thu thập các loại thuốc kích thích tăng trưởng và thức ăn gia súc bán trên thị trường Hà nội Đồng thời tìm hiểu các tài liệu Quốc tế về thuốc kích thích tăng trưởng trong gia súc gia cầm

4.4.1 Danh sách các loại thuốc kích thích tăng trọng dùng cho gia súc gia

cầm trên địa bàn Hà Nội (kháng sinh và hocmon kích thích tăng trưởng)

Bảng 4.8: Danh mục thuốc kháng sinh dùng cho gia súc gia cầm

TT Tên thuốc Nhà

sản xuất

Thành phần Tác dụng Quy cách

đóng gói & hàm lượng

cổ phần thuốc thú

y Nam Hải

Trong 100 g:

Ampicillin trihydrate- 8000

mg Colistin sunphate-

17500000 UI

Đặc trị tiêu chảy do thương hàn, ecoli gây phù thũng sau cai sữa, những bệnh

ở gia súc sơ sinh, tụ huyết trùng

20g/ gói

Kanamycin

Phổ tác dụng rộng, tăng tính năng diệt khuẩn, giảm khả

năng kháng thuốc của vi khuẩn

Thuốc bột pha tiêm,đóng trong lọ thuỷ tinh trung tính Hộp 20

lọ

Tylosin Oxytetracyclin Dexamethason

Tác dụng đặc biệt mạnh và hơn hẳn các chế phẩm khác

đối với xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh nghệ ở lợn, chó, mèo nhất là khi bệnh kết hợp nhiễm khuẩn các loại tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn…

Thuốc tiêm,

đóng ống lọ

5 ml, 20ml, 100ml

cổ phần thuốc thú

y trung

ương I

2 ml có 500 mg analginum

Giảm đau, chống phong thấp và hạ sốt, giảm cơn co thắt đường ruột, chướng bụng, giảm nhu động ruột, hạ sốt

Thuốc tiêm 25%-2ml Hộp 100 ống 32ml

TNHH thương mại sản

Norfloxacine- HCl: 2g

Phòng chống tất cả

các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram (+) và Gram

Dung dịch tiêm vô trùng

20 ml