NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUSL.) VÀ CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.)

Header Page of 148 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI: CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUS L.) VÀ CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.) Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 62440114 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2016 Footer Page of 148 Header Page of 148 Công trình hoàn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thượng Quảng TS Nguyễn Tiến Đạt Phản biện 1: GS TS Phạm Quốc Long Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Hải Nam Phản biện 3: GS.TSKH Phan Tống Sơn Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam Footer Page of 148 Header Page of 148 I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Mở đầu Việt Nam quốc gia có y học cổ truyền lâu đời với việc sử dụng loại thảo dược phòng chữa bệnh, tăng cường sức khoẻ Một dược liệu sử dụng rộng rãi vị thuốc Hương phụ Dược liệu Hương phụ chế biến từ thân rễ loài củ gấu (Cyperus rotundus L.) Nhưng nay, để phục vụ cho nhu cầu sử dụng nước xuất khẩu, vị thuốc có tên “hương phụ” Việt Nam, chủ yếu khai thác từ loài củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) Tổ chức Y tế Thế giới Bộ Y tế nước ta có quy định việc nhận dạng dược liệu cổ truyền từ nguyên liệu thực vật với việc xây dựng tiêu chuẩn từ nhận dạng cây, phận sử dụng đến việc đảm bảo chất lượng trình chuẩn bị nguyên liệu hay sản phẩm cuối Nếu không xác định hoạt chất cần phải có dấu vân tay sắc ký để xác định chất hỗn hợp chất Chính tác giả lựa chọn loài thực vật làm đối tượng nghiên cứu luận án: Nhiệm vụ luận án - Nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập hợp chất từ hai loài củ gấu củ gấu biển phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học chất tách phương pháp phổ kết hợp - Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng liệu vân tay sắc ký củ gấu, củ gấu biển sở thị hóa học, xác định hàm lượng số hoạt chất mẫu củ gấu, củ gấu biển dược liệu Hương phụ thu thập địa điểm khác Ý nghĩa khoa học đóng góp luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học Luận án đóng góp hiểu biết thành phần hóa học sắc ký dấu vân tay loài thực vật: củ gấu, củ gấu biển Việt Nam Ứng dụng phương pháp vật lý đại nghiên cứu cấu trúc hóa học hợp chất hữu 3.2 Những đóng góp luận án Hai loài củ gấu củ gấu biển Việt Nam lần đầu nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hóa học dấu vân tay sắc ký 3.2.1 Về thành phần hóa học Footer Page of 148 Header Page of 148 ● Từ củ gấu (Cyperus rotundus L.) phân lập xác định cấu trúc hóa học 15 hợp chất ()-3,5,6,7,8,4hexahydroxyflavane (CR1), (+)-Catechin (CR2), Eriodictyol (CR3), Luteolin (CR4), 7,4-dihydroxy-5,3-dimethoxyflavone (CR5), Hovetrichoside C (CR6), Piceatannol (CR7), Resveratrol (CR8), trans-Scirpusin A (CR9), trans-Scirpusin B (CR10), Cassigarol E (CR11), Cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesman-11ene) (CR12), 1 ,4-dihydroxyeudesman-11-ene (CR13), 5,7dihydroxychromone (CR14), (+)-lyoniresinol 3a-O- -D-glucoside (CR15) Trong đó, hợp chất ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CR1) hợp chất ● Từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) phân lập xác định cấu trúc hóa học 12 hợp chất, (S)-5,5,7trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone (CS1), Rengasin (CS2), -Mangostin (CS3), ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CS4), (+)-Catechin (CS5), Eriodictyol (CS6), Luteolin (CS7), Piceatannol (CS8), Resveratrol (CS9), trans-Scirpusin A (CS10), trans-Scirpusin B (CS10), Cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesman11-ene) (CS12) Trong số 12 hợp chất hợp chất CS1 ((S)5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone) hợp chất  Trong số 12 chất phân lập từ củ gấu biển có hợp chất trùng với chất phân lập từ củ gấu 3.2.2 Về sắc ký dấu vân tay: - So sánh thành phần hoá học loài C rotundus C stoloniferus dựa theo kết phân lập xác định cấu trúc hợp chất kết hợp với phân tích hệ thống sắc ký HPTLC HPLC - Thiết lập điều kiện phân tích dấu vân tay sắc ký HPLC Đánh giá độ tương đồng mẫu nghiên cứu kỹ thuật HPLC Kết cho thấy có độ tương đồng cao mẫu thân rễ củ gấu biển lấy từ địa phương khác (từ 0,9424 đến 0,9903) Xác định vùng sắc ký đồ (từ phút thứ đến phút thứ 20) cho việc nhận dạng dấu vân tay sắc ký để phân biệt hai loài - Xây dựng điều kiện định lượng thành phần hoạt chất đối tượng nghiên cứu hệ thống HPLC việc sử dụng chất phân lập làm chất đối chứng Footer Page of 148 Header Page of 148 Bố cục luận án Luận án dày 146 trang với 34 bảng số liệu, 101 hình 174 tài liệu tham khảo trình bày sau: Mục lục, Danh mục kí hiệu chữ viết tắt, Danh mục bảng, Danh mục hình ảnh, đồ thị Mở đầu (2 trang) Chương 1: Tổng quan (33 trang) Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (4 trang) Chương 3: Thực nghiệm Kết (17 trang) Chương 4: Kết Bàn luận (72 trang) Kết luận kiến nghị (2 trang) Danh mục công trình liên quan đến luận án (1 trang) phần tài liệu tham khảo (15 trang), luận án có phần phụ lục gồm phổ hợp chất phân lập được, kết phân tích sắc ký dấu vân tay II NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng nhiệm vụ nghiên cứu luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN Giới thiệu sơ lược thực vật họ Cói (Cyperaceae) Giới thiệu chi Cyperus L., nghiên cứu công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học sắc ký dấu vân tay chi Cyperus L Giới thiệu sơ lược củ gấu củ gấu biển Các nghiên cứu công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học sắc ký dấu vân tay Việt Nam giới củ gấu củ gấu biển CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Củ gấu (Cyperus rotundus L.) thu hái Đông Anh, Hà Nội củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) thu hái Tiền Hải, Thái Bình Các mẫu giám định PGS.TS.Trần Huy Thái Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký bao gồm 06 mẫu củ gấu, 06 mẫu củ gấu biển 04 mẫu dược liệu Hương phụ thu thập vào tháng năm 2015 từ địa điểm khác 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất Mẫu thân rễ củ gấu củ gấu biển sơ chế, phơi khô bóng râm, xay nhỏ, chiết siêu âm với methanol Dịch chiết cô cạn áp suất giảm thu cặn chiết methanol Hòa cặn chiết với nước, chiết phân bố cặn chiết thân rễ củ gấu n-hexane, cặn chiết thân rễ củ gấu biển chloroform sau ethyl acetate thu Footer Page of 148 Header Page of 148 cặn chiết n-hexane, chloroform tương ứng, cặn chiết ethyl acetate cặn nước Sắc ký cột tiến hành với pha tĩnh Silica gel 60 pha đảo RP-18, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20, Sephadex LH-20 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Sử dụng phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESIMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), hai chiều (HSQC, HMBC, NOESY) 2.4 Phương pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng phân tích sắc ký lỏng hiệu cao CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chiết phân lập chất từ thân rễ củ gấu Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu Footer Page of 148 Header Page of 148 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập cặn chiết n-hexane thân rễ củ gấu Hình 3.3 Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate thân rễ củ gấu Footer Page of 148 Header Page of 148 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập cặn nước thân rễ củ gấu Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ củ gấu Hợp chất CR1: ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (Hợp chất mới) Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 5:1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% [] 25 D = 0,0 (c 0,1, MeOH) IR max(KBr): 3400, 1620, 1530, 1470, 1150 cm-1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,23 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2',6'), 6,80 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3',5'), 4,60 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2), 3,99 (1H, m, H-3), 2,89 (1H, dd, J = 5,5, 16,5 Hz, Hb-4), 2,52 (1H, dd, J = 8,0, 16,5 Hz, Ha-4) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  82,8 (C-2), 68,8 (C-3), 28,8 (C-4), 158,3 (C-5), 157,7 (C-6), 158,3 (C-7), 157,4 (C-8), 156,9 (C-9), 100,9 (C-10), 131,5 (C-1'), 129,6 (C-2'), 116,0 (C-3'), 156,9 (C-4'), 116,0 (C-5'), 129,6 (C-6') HR-ESI-MS m/z: 307,0810 [M + H]+ (calcd 307,0818 cho C15H15O7) Footer Page of 148 Header Page of 148 Hợp chất CR2: (+)-catechin Tinh thể màu trắng, mp 173-175oC SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 5:1:0,01 v/v), vết UV 254 nm thuốc thử H2SO4 10% [] 25 D = +17 (c 0,1, CH3COCH3) H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  6,72 (1H,br s, H-2'), 6,68 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6'), 5,89 (1H, br s, H6), 5,70 (1H, br s, H-8), 4,48 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), 3,83 (1H, m, H-3), 2,64 (1H, dd, J = 5,0, 16,0 Hz, Ha-4), 2,35 (1H, dd, J = 8,0, 16,0 Hz, Hb-4) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  81,1 (C-2), 66,5 (C-3), 27,9 (C4), 156,3 (C-5), 95,3 (C-6), 156,6 (C-7), 94,1 (C-8), 155,5 (C-9), 99,3 (C-10), 130,8 (C-1'), 114,6 (C-2'), 145,0 (C-3'), 145,0 (C-4'), 115,3 (C-5'), 118,6 (C-6') ESI-MS (positive) m/z 291 [M+H]+ Hợp chất CR3: eriodictyol Chất bột màu vàng nhạt SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 4:1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,93 (1H, s, H-2'), 6,80 (2H, m, H5', H-6'), 5,85 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,83 (1H, d, J = 2,0 Hz, H6), 5,28 (1H, dd, J = 3,0, 12,5 Hz, H-2), 3,05 (1H, dd, J = 13,0, 17,0 Hz, Hb-3), 2,69 (1H, dd, J = 3,0, 17,0 Hz, Ha-3) 13 C-NMR (125MHz, CD3OD):  80,4 (C-2), 44,0 (C-3), 197,6 (C-4), 165,3 (C-5), 97,0 (C-6), 168,6 (C-7), 96,2 (C-8), 164,7 (C-9), 103,2 (C-10), 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C-6') ESI-MS (positive) m/z 289 [M+H]+ Hợp chất CR4: luteolin Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol:nước 10:1:0,01 v/v), vết UV 254 nm thuốc thử H2SO4 10% H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  7,26 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6'), 7,24 (1H, br s, H-2'), 6,65 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 6,38 (1H, br s, H-6), 6,19 (1H, br s, H-8), 5,93 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  166,4 (C-2), 102,1 (C-3), 181,2 (C-4), 161,3 (C-5), 99,3 (C-6), 163,7 (C-7), 94,1 (C-8), 157,4 (C-9), Footer Page of 148 Header Page 10 of 148 102,7 (C-10), 120,4 (C-1'), 112,8 (C-2'), 146,2 (C-3'), 151,2 (C-4'), 116,0 (C-5'), 118,8 (C-6') ESI-MS (positive) m/z 287 [M+H]+ Hợp chất CR5: 7,4-dihydroxy-5,3-dimethoxyflavone Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol:nước 10:1,5:0,01 v/v), vết UV 254, 366 nm thuốc thử H2SO4 10% H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,48 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H6'), 7,45 (1H, d, J = 2,0, H-2'), 6,94 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,58 (1H, d, J = 2,0, H-8), 6,57 (1H, s, H-3), 6,43 (1H, d, J = 2,0, H-6), 3,97 (3H, s, OCH3), 3,91 (3H, s, OCH3) ESI-MS (positive) m/z 315 [M+H]+ Hợp chất CR6: hovetrichoside C Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 3,5:1:0,01 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% [] 25 D = -18,0 (c 0,1, MeOH) H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  6,92 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2', H6'), 6,54 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3', H-5'), 5,99 (1H, s, H-5), 5,91 (1H, s, H-7), 4,95 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1''), 3,48-3,62 (2H, m, H-6''), 3,25 (1H, m, H-2''), 3,25 (1H, m, H-3''), 3,25 (1H, m, H-5''), 3,19 (1H, m, H-4''), 2,90 (2H, m, H-b) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  105,5 (C-2), 192,3 (C-3), 101,3 (C-3a), 156,7 (C-4), 95,1 (C-5), 169,0 (C-6), 91,5 (C-7), 171,8 (C7a), 40,4 (C-b), 124,1 (C-1'), 131,2 (C-2', C-6'), 114,6 (C-3', C-5'), 155,8 (C-4'), 99,5 (C-1), 72,8 (C-2), 76,7 (C-3), 69,2 (C-4), 77,1 (C-5), 60,3 (C-6) ESI-MS (positive) m/z 451 [M+H]+ Hợp chất CR7: piceatannol Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform:methanol 4:1 v/v), vết UV 254, 366 nm thuốc thử H2SO4 10% H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,99 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,92 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,85 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6), 6,77 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,76 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,45 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-2, H-6), 6,17 (1H, t, J = 2,5 Hz, H-4) Footer Page 10 of 148 Header Page 13 of 148 5'), 105,9 (C-6'), 128,4 (C-7'), 129,4 (C-8'), 132,6 (C-9'), 115,9 (C-10'), 145,4 (C-11'), 145,0 (C-12'), 118,1 (C-13), 121,0 (C-14) ESI-MS (positive) m/z 487 [M+H]+ Hợp chất CR12: cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesm-11-ene) Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,3 (n-hexane:ethyl acetate 5:1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% [] 25 D = -42,0 (c 0,1, MeOH) H-NMR (500 MHz, CDCl3):  4,72 (2H, m, H-12), 3,32 (1H, dd, J = 4,0, 11,0 Hz, H-1), 1,75 (3H, s, H-13), 1,13 (3H, s, H-15), 0,89 (3H, s, H-14) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3):  79,4 (C-1), 28,5 (C-2), 40,8 (C-3), 71,6 (C-4), 53,0 (C-5), 25,8 (C-6), 45,7 (C-7), 26,4 (C-8), 40,5 (C9), 39,0 (C-10), 150,3 (C-11), 108,3 (C-12), 21,0 (C-13), 13,0 (C14), 22,8 (C-15) ESI-MS (positive) m/z 239 [M + H]+ Hợp chất CR13: 1β,4β-dihydroxyeudesm-11-ene Tinh thể hình kim màu trắng, mp 171-173oC SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform:ethyl acetate:methanol 4:1:0,1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% [] 25 D = -16,0 (c 0,1, MeOH) H-NMR (500 MHz, CDCl3):  4,73 (1H, br s, Hb-12), 4,71 (1H, br s, Ha-12), 3,26 (1H, dd, J = 4,0, 11,5 Hz, H-1), 1,75 (3H, s, H-13), 1,05 (3H, s, H-14), 1,15 (3H, s, H-15) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3):  79,6 (C-1), 25,6 (C-2), 39,3 (C-3), 71,3 (C-4), 50,4 (C-5), 26,4 (C-6), 46,1 (C-7), 26,8 (C-8), 39,3 (C9), 38,9 (C-10), 150,4 (C-11), 108,5 (C-12), 20,7 (C-13), 12,5 (C14), 29,9 (C-15) ESI-MS (positive) m/z 239 [M + H]+ Hợp chất CR14: 5,7-dihydroxychromone Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform: methanol:nước 6:1,5:0,01 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  8,17 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-2), 6,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,26 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-3), 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  157,3 (C-2), 110,4 (C-3), 181,2 (C-4), 161,5 (C-5), 98,9 (C-6), 164,2 (C-7), 93,9 (C-8), 157,7 (C-9), 104,4 (C-10) ESI-MS (positive) m/z 179 [M+H]+ Footer Page 13 of 148 11 Header Page 14 of 148 Hợp chất CR15: (+)-lyoniresinol 3a-O- -D-glucoside Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform: methanol:nước 5:1:0,01 v/v), vết UV 254 nm thuốc thử H2SO4 10% 25 [] D = +21,4 (c 0,1, MeOH) H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,60 (1H, s, H-8), 6,44 (2H, s, H2,6), 4,43 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-4), 4,29 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 3,84-3,92 (2H, m, H6), 3,87 (3H, s, 7-OCH3), 3,84 (1H, m, H4), 3,76 (6H, s, 3',5'-OCH3), 3,67 (1H, m, Hb-2a), 3,66 (1H, m, H5), 3,56 (1H, m, Ha-2a), 3,47 (1H, m, Ha-3a), 3,36 (3H, s, 5-OCH3), 3,32 (1H, m, Hb-3a), 3,28 (1H, m, H3), 3,24 (1H, m, H2), 2,74 (1H, dd, J = 5,0, 15,0 Hz, Ha-1), 2,63 (1H, dd, J = 11,5, 15,0 Hz, Hb-1), 2,10 (1H, m, H-3), 1,72 (1H, m, H-2) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  33,8 (C-1), 40,6 (C-2), 66,2 (C2a), 46,6 (C-3), 71,5 (C-3a), 42,7 (C-4), 148,6 (C-5), 138,9 (C-6), 147,5 (C-7), 107,8 (C-8), 130,2 (C-9), 126,4 (C-10), 139,3 (C-1'), 106,9 (C-2'), 148,9 (C-3'), 134,5 (C-4'), 148,9 (C-5'), 106,9 (C-6'), 104,8 (C-1''), 75,1 (C-2''), 78,2 (C-3''), 71,6 (C-4''), 77,9 (C-5''), 62,8 (C-6''), 60,2 (5-OCH3), 56,6 (7-OCH3), 56,8 (3',5'-OCH3) ESI-MS (positive) m/z 583 [M+H]+ 3.2 Chiết phân lập hợp chất từ thân rễ củ gấu biển Hình 3.5 Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu biển Footer Page 14 of 148 12 Header Page 15 of 148 Hình 3.6 Sơ đồ phân lập cặn chiết chloroform thân rễ củ gấu biển Hình 3.7 Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate thân rễ củ gấu biển Footer Page 15 of 148 13 Header Page 16 of 148 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập cặn nước thân rễ củ gấu biển Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ củ gấu biển Hợp chất CS1: (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6methylflavanone (Hợp chất mới) Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,5 (chloroformmethanol-nước 5:1:0,05 v/v), vết UV 254 nm thuốc thử H2SO4 10% 25 [] D = – 88,0 (c 0,1, MeOH) CD (c 1,4 × 10–3 M, MeOH): λmax(∆) nm 295 (–13,7), 345 (+2,1) IR max(KBr): 3393, 1637, 1516, 1303, 1158 cm-1 H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,00 (1H, s, H-6'), 6,69 (1H, s, H-3'), 5,97 (1H, s, H-8), 5,60 (1H, dd, J = 3,0, 13,0 Hz, H-2), 3,90 (3H, s, OCH3), 3,83 (3H, s, OCH3), 2,95 (1H, dd, J = 13,0, 17,0 Hz, Hb-4), 2,68 (1H, dd, J = 3,5, 17,5 Hz, Ha-4), 1,97 (3H, s, CH3) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD):  75,2 (C-2), 43,4 (C-3), 198,0 (C4), 162,6 (C-5), 105,3 (C-6), 166,1 (C-7), 95,2 (C-8), 162,6 (C-9), 103,0 (C-10), 120,5 (C-1'), 151,2 (C-2'), 98,7 (C-3'), 149,5 (C-4'), Footer Page 16 of 148 14 Header Page 17 of 148 141,4 (C-5'), 114,5 (C-6'), 6,9 (6-CH3), 56,9 (2'-OMe), 56,6 (4'OMe) HR-ESI-MS m/z: 347,1109 [M + H]+ (calcd 347,1130 cho C18H19O7) Hợp chất CS2: 3,4,6-trihydroxy-4-methoxyaurone Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroformmethanol-nước 10:1:0,01 v/v), vết UV 254, 366 nm thuốc thử H2SO4 10% H-NMR (500 MHz, acetone-d6): δ 7,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,27 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6’), 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’), 6,51 (1H, s, H-10), 6,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 3,89 (3H, s, 4-OCH3) 13 C-NMR (125 MHz, acetone-d6): δ 147,3 (C-2), 179,8 (C-3), 160,7 (C-4), 95,2 (C-5), 168,1 (C-6), 92,2 (C-7), 169,3 (C-8), 104,9 (C-9), 110,7 (C-10), 125,6 (C-1'), 118,4 (C-2'), 146,1 (C-3'), 147,9 (C-4'), 116,4 (C-5'), 125,1 (C-6'), 56,3 (4-OCH3) ESI-MS (positive) m/z 301 [M+H]+ Hợp chất CS3: -mangostin Chất bột màu vàng nhạt SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroformmethanol 15:1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% H-NMR (500 MHz, acetone-d6):  13,78 (1H, s, C-5-OH), 9,55 (2H, brs, C-2-OH, C-7-OH), 6,81 (1H, s, H-1), 6,38 (1H, s, H-8), 5,27 (1H, m, H-2, H-2), 4,11 (2H, d, J = 6,5, H-1), 3,79 (3H, s, 3-OCH3), 3,33 (2H, d, J = 7,0, H-1), 1,82 (3H, s, H-4), 1,78 (3H, s, H-4), 1,65 (3H, s, H-5), 1,64 (3H, s, H-5) 13 C-NMR (125 MHz, acetone-d6):  102,6 (C-1), 157,3 (C-1a), 156,1 (C-2), 144,4 (C-3), 138,0 (C-4), 111,9 (C-4a), 161,6 (C-5), 103,6 (C-5a), 111,0 (C-6), 162,8 (C-7), 93,1 (C-8), 155,6 (C-8a), 182,8 (C-10), 26,8 (C-1), 124,7 (C-2), 131,3 (C-3), 18,2 (C-4), 25,8 (C-5), 21,9 (C-1), 123,4 (C-2), 131,3 (C-3), 17,8 (C-4), 25,8 (C-5), 61,3 (3-OCH3) ESI-MS (positive) m/z 411 [M+H]+ Hợp chất CS4 (trùng với CR1): ()-3,5,6,7,8,4hexahydroxyflavane Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 5:1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS m/z: 307 [M + H]+ Footer Page 17 of 148 15 Header Page 18 of 148 Hợp chất CS5 (trùng với CR2): (+)-catechin Tinh thể màu trắng, mp 173-175oC SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 5:1:0,01 v/v), vết UV 254 nm thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 291 [M+H]+ Hợp chất CS6 (trùng với CR3): eriodictyol Chất bột màu vàng nhạt SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 4:1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 289 [M+H]+ Hợp chất CS7 (trùng với CR4): luteolin Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol:nước 10:1:0,01 v/v), vết UV 254 nm thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 287 [M+H]+ Hợp chất CS8 (trùng với CR7): piceatannol Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform:methanol 4:1 v/v), vết UV 254, 366 nm thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 245 [M+H]+ Hợp chất CS9 (trùng với CR8): resveratrol Chất bột màu trắng đục SKLM pha thường: Rf = 0,40 (chloroform:methanol:nước 6:1:0,01 v/v), vết UV 254, 366 nm thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 229 [M+H]+ Hợp chất CS10 (trùng với CR9): trans-scirpusin A Chất bột màu trắng đục SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 4:1:0,01 v/v), vết UV 254, 366 nm thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 471 [M+H]+ Hợp chất CS11 (trùng với CR10): trans-scirpusin B Chất bột màu vàng nâu SKLM pha thường: Rf = 0,33 (chloroform:methanol:nước 4:1:0,01 v/v), vết UV 254, 366 nm thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 487 [M+H]+ Hợp chất CS12 (trùng với CR12): cyperusol C (1 ,4dihydroxyeudesm-11-ene) Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,3 (n-hexane:ethyl acetate 5:1 v/v), vết thuốc thử H2SO4 10% ESI-MS (positive) m/z 239 [M + H]+ Footer Page 18 of 148 16 Header Page 19 of 148 3.3 Phân tích định tính sắc ký dấu vân tay Chuẩn bị dung dịch thử: mẫu sấy khô đến khối lượng không đổi Cân 5,00 g bột mẫu sấy khô, nghiền nhỏ, thêm 25ml metanol, lắc siêu âm 30 phút nhiệt độ 40oC, lọc (chiết lần lần 25ml metanol) Gộp dịch lọc, loại bớt dung môi áp suất giảm nhiệt độ 50oC điều chỉnh đến thể tích 50ml dung dịch phân tích sắc ký Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng chuẩn bị cách pha dung dịch chất thị gốc có nồng độ 2000µg/ml methanol Các chất thị gốc phân tích sắc ký HPTLC với điều kiện phân tích mẫu để xác định giá trị Rf cho chất thị Từ dung dịch thị gốc, tiến hành pha mẫu đối chứng hỗn hợp chất thị có nồng độ 100 µg/ml methanol Kết phân tích đặc điểm dấu vân tay 16 mẫu HPTLC HPLC bàn luận chương CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Các hợp chất phân lập từ thân rễ củ gấu củ gấu biển Từ cặn chiết n-hexane, ethyl acetate cặn nước thân rễ củ gấu, sau tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần cột silica gel, pha đảo, sephadex diaion, thu 15 hợp chất CR1-CR15 Các hợp chất bao gồm: hợp chất thuộc lớp chất flavonoid (CR1-CR6), hợp chất thuộc lớp chất stilbenoid (CR7-CR11), hợp chất khung sesquiterpen (CR12, CR13), hợp chất thuộc lớp chất chromone (CR14), hợp chất lignan (CR15) Footer Page 19 of 148 17 Header Page 20 of 148 Cấu trúc hợp chất phân lập từ thân rễ củ gấu Từ cặn chiết chloroform, ethyl acetate cặn nước thân rễ củ gấu biển, sau tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần cột silica gel, pha đảo, sephadex diaion, thu 12 hợp chất CS1CS12 Các hợp chất bao gồm: hợp chất thuộc lớp chất flavonoid (CS1-CS7), hợp chất thuộc lớp chất stilbenoid (CS8-CS11), hợp chất khung sesquiterpen (CR12) Footer Page 20 of 148 18 Header Page 21 of 148 Cấu trúc hợp chất phân lập từ thân rễ củ gấu biển 4.2 Nghiên cứu định tính dấu vân tay sắc ký TLC Kết phân tích đặc điểm hóa học 16 mẫu mẫu đối chứng TLC thể qua hình ảnh sắc ký đồ hình 4.19 4.20 Giá trị Rf vết sắc ký đồ ghi bảng 4.20 Các đánh số từ đến tương ứng với mẫu CGB1 đến CGB6, mẫu đối chứng, từ đến 13 tương ứng với mẫu CGV1 đến CGV6, từ 14 đến 17 tương ứng với mẫu HP1 đến HP4 Các chất đối chứng đánh số 1* đến 4* Footer Page 21 of 148 19 Header Page 22 of 148 Hình 4.19 Sắc ký lớp mỏng mẫu quan sát ánh sáng UV 366 nm trước phun thuốc thử Các sắc ký đồ cho vết tách tương đối rõ ràng, chế độ quan sát trước sau phun thuốc thử, mẫu thuộc nhóm CGV, CGB HP cho sắc đồ tương đối giống Vết có Rf=0,40 (chất đánh dấu 4*: 7,4-dihydroxy-5,3dimethoxyflavone) có cường độ mạnh mẫu CGB, mẫu HP cường độ thấp chút, 06 mẫu CGV cường độ thấp nhiều Trên kết dấu vân tay TLC sử dụng vết Rf để phân biệt mẫu củ gấu biển dược liệu Hương phụ với mẫu củ gấu Vết có Rf =0,22 (chất đánh dấu 3*: piceatannol) mẫu HP có cường độ mạnh nhất, sau mẫu CGB, mẫu CGV có cường độ thấp trừ mẫu CGV3 mọc cát có cường độ mạnh tương đương mẫu HP mẫu CGB1,2,4,6 4.3 Nghiên cứu định tính dấu vân tay sắc ký HPLC Xuất phát từ nghiên cứu phổ chất đánh dấu, dựa kết sắc đồ 16 mẫu nhiều bước sóng nghiên cứu, bước sóng lựa chọn để xây dựng dấu vân tay sắc ký 275 nm bước sóng píc xuất thể rõ Trên sở sắc ký đồ bước sóng 275 nm, 32 píc lựa chọn làm píc đặc trưng cho nhận dạng dấu vân tay sắc ký Footer Page 22 of 148 20 Header Page 23 of 148 Hình 4.25 Sắc ký đồ 16 mẫu nghiên cứu bước sóng 275 nm Từ việc xem xét đánh giá tín hiệu diện tich píc, rút số nhận xét sau: - Píc thời gian lưu 1,44 phút có diện tích lớn mẫu CGV mẫu CGB2 (mọc đất), với mẫu CGB lại diện tích nhỏ đặc biệt mẫu HP diện tích nhỏ - Nhóm mẫu CGB HP có diện tích píc thời gian lưu 12,04; 12,67; 18,21; 18,89 phút lớn hẳn mẫu thuộc nhóm CGV Đây lại píc có tỷ trọng lớn sắc ký đồ - Nhóm mẫu HP có diện tích píc thời gian lưu 8,98 phút lớn mẫu thuộc nhóm CGV CGB Trên sở số liệu thời gian lưu tín hiệu píc (ở diện tích píc), luận án sử dụng thuật toán đánh giá mức độ tương đồng sắc ký đồ theo công thức sau [62, 167, 55]: ∑ = ∑ ( ) ∑ ( ) Trong đó: S: độ tương đồng mẫu x mẫu y S có giá trị từ ≤ S ≤ Khi S gần hai mẫu giống xi: diện tích píc thứ i mẫu x yi: diện tích píc thứ i mẫu y n: số lượng píc tham gia trình đánh giá So sánh hai mẫu CGV1 CGB1 với mẫu lại Kết thu sau: Footer Page 23 of 148 21 Header Page 24 of 148 Mẫu CGV1 có độ tương đồng không cao với mẫu CGV khác Mẫu CGB1 có độ tương đồng cao với mẫu CGB khác trừ mẫu CGB2 Điều lý giải mẫu CGB2 mẫu củ gấu biển mọc đất mẫu CGB khác mọc cát Trên sắc ký đồ thấy mẫu CGB2 có diện tích píc thời gian lưu 1,44 phút cao hẳn mẫu CGB1, thêm phần lại sắc ký đồ có píc Điều lý giải hệ số tương đồng mẫu CGB2 thấp so với mẫu CGB khác Các mẫu HP có độ tương đồng với mẫu CGB1 cao mẫu CGV1 Điều minh chứng cho thấy dược liệu Hương phụ chế biến từ củ gấu biển Số liệu cho thấy khác biệt mẫu CGV lớn so với mẫu CGB Sự khác mặt hóa học củ gấu điều kiện thổ nhưỡng nơi củ gấu mọc khác Do dược liệu Hương phụ chế biến từ củ gấu có chất lượng không đồng so với chế biến từ củ gấu biển 4.4 Nghiên cứu định lượng số thành phần HPLC Các số liệu phân tích HPLC cho kết tương đồng với kết phân tích dấu vân tay sắc ký lớp mỏng Kết phân tích sắc ký dấu vân tay cho thấy nhìn chung sắc ký đồ mẫu củ gấu củ gấu biển có píc tương tự chứng tỏ thành phần hoá học loài có nét tương đồng khác hàm lượng Tuy nhiên kết cho thấy hàm lượng hầu hết chất củ gấu biển cao mẫu củ gấu Cụ thể với nhóm chất flavan-3-ol (+)-catechin, ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane, nhóm chất flavanone eriodictyol, (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6methylflavanone, nhóm chất stilbenoid piceatannol, transscirpusin B, hợp chất lignan (+)-lyoniresinol 3a-O- -Dglucoside hàm lượng chất củ gấu biển mẫu dược liệu Hương phụ cao so với củ gấu Điều minh chứng nhận định việc “sử dụng củ gấu biển để chữa bệnh vị Hương phụ lại có tác dụng rõ rệt hơn” [15] Footer Page 24 of 148 22 Header Page 25 of 148 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Về nghiên cứu thành phần hóa học  Từ thân rễ củ gấu phân lập xác định cấu trúc hóa học 15 hợp chất có: hợp chất thuộc lớp flavonoid gồm: ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CR1), (+)-catechin (CR2), eriodictyol (CR3), luteolin (CR4), 7,4-dihydroxy-5,3dimethoxyflavone (CR5), hovetrichoside C (CR6) hợp chất thuộc lớp chất stillbenoid gồm: Piceatannol (CR7), Resveratrol (CR8), trans-Scirpusin A (CR9), trans-Scirpusin B (CR10), Cassigarol E (CR11) hợp chất thuộc lớp chất terpenoid gồm: Cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesm-11-ene) (CR12), 1 ,4dihydroxyeudesm-11-ene (CR13) hợp chất thuộc lớp chất chromone 5,7-dihydroxychromone (CR14) hợp chất lignan (+)- lyoniresinol 3a-O- -D-glucoside (CR15)  Trong 15 hợp chất có hợp chất ()-3,5,6,7,8,4hexahydroxyflavane (CR1) hợp chất lần công bố; có hợp chất lần phân lập từ loài C rotundus L CR3, CR5, CR6, CR11, CR14, CR15  Từ thân rễ củ gấu biển phân lập xác định cấu trúc hóa học 12 hợp chất có: hợp chất thuộc lớp flavonoid gồm: (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone (CS1), Rengasin (CS2), -Mangostin (CS3), ()-3,5,6,7,8,4hexahydroxyflavane (CS4), (+)-Catechin (CS5), Eriodictyol (CS6), Luteolin (CS7) hợp chất thuộc lớp chất stillbenoid gồm: Piceatannol (CS8), Resveratrol (CS9), trans-Scirpusin A (CS10), trans-Scirpusin B (CS11) hợp chất thuộc lớp chất terpenoid Cyperusol C (1 ,4-dihydroxyeudesm-11-ene) (CS12)  Trong 12 hợp chất có hợp chất (S)-5,5,7-trihydroxy2,4-dimethoxy-6-methylflavanone (CS1) hợp chất lần công bố; 11 hợp chất lại phân lập lần từ loài C stoloniferus Retz Trong số 12 chất có hợp chất trùng với chất phân lập từ loài C rotundus L Footer Page 25 of 148 23 Header Page 26 of 148 Về nghiên cứu sắc ký dấu vân tay - Luận án lần so sánh thành phần hoá học loài C rotundus C stoloniferus dựa theo kết phân lập xác định cấu trúc hợp chất kết hợp với phân tích hệ thống sắc ký TLC HPLC - Thiết lập điều kiện phân tích dấu vân tay sắc ký HPLC Đánh giá độ tương đồng mẫu nghiên cứu kỹ thuật HPLC Kết cho thấy có độ tương đồng cao mẫu thân rễ củ gấu biển lấy từ địa phương khác (từ 0,9424 đến 0,9903) Xác định vùng sắc ký đồ (từ phút thứ đến phút thứ 20) cho việc nhận dạng dấu vân tay sắc ký để phân biệt hai loài - Xây dựng điều kiện định lượng thành phần hoạt chất đối tượng nghiên cứu hệ thống HPLC việc sử dụng chất phân lập làm chất đối chứng Như vậy, kết luận án làm rõ mục tiêu đề đề tài xác định thành phần hóa học đối tượng nghiên cứu xây dựng dược liệu vân tay sắc ký Đã tìm chất tổng số 18 chất phân lập xác định cấu trúc Các kết nghiên cứu luận án đăng tạp chí chuyên ngành có uy tín có báo quốc tế KIẾN NGHỊ: Trên sở kết thu từ luận án, có số kiến nghị sau: - Tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học chất phân lập đặc biệt chất chất có hàm lượng lớn để hiểu rõ thành phần hóa học tạo hoạt tính dược liệu Hương phụ - Xây dựng phần mềm chuyên dụng để so sánh, đánh giá độ tương đồng sắc ký đồ HPLC - Tiếp tục hoàn thiện liệu sắc ký dấu vân tay để đánh giá phân tích chất lượng dược liệu Hương phụ dựa theo thành phần hoạt chất với tiêu chí: khác thành phần hoá học dược liệu địa điểm thời điểm thu hái khác nhau; ảnh hưởng điều kiện thổ nhưỡng đến thành phần hoá học; thay đổi hàm lượng hoạt chất trình bảo quản, chế biến dược liệu; hàm lượng hoạt chất sản phẩm bào chế Footer Page 26 of 148 24 Header Page 27 of 148 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Trần Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Minh Châu, Đan Thị Thúy Hằng, Lê Hoàng Trâm, Nguyễn Thị Luyến, Phạm Thanh Bình, Nguyễn Tiến Đạt (2012) Hai hợp chất eudesmen sesquiterpen phân lập từ củ gấu Tạp chí Dược liệu 17 (1), tr 39-41 Nguyễn Minh Châu, Trần Thị Hồng Hạnh, Lê Hoàng Trâm, Nguyễn Thị Luyến, Phạm Thanh Bình, Trần Thượng Quảng, Nguyễn Tiến Đạt (2012) Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất phenolic từ củ gấu Cyperus rotundus L Tạp chí Hóa học, T50 (4A), tr 155-157 Nguyen Minh Chau, Tran Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Luyen, Chau Van Minh, Nguyen Tien Dat (2013) Flavanones and stilbenes from Cyperus stoloniferus Retz Biochemical Systematics and Ecology 50, pp 220-222 (SCI) Tran Thi Hong Hanh, Nguyen Minh Chau, Le Hoang Tram, Nguyen Thi Luyen, Pham Thanh Binh, Chau Van Minh, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Tien Dat (2014) Inhibitors of α-glucosidase and α-amylase from Cyperus rotundus Pharmaceutical Biology 52 (1), pp 74-77 (SCI-E) Phạm Thanh Bình, Nguyễn Minh Châu, Trần Thượng Quảng, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Tiến Đạt (2014) Phân lập xác định cấu trúc hai hợp chất polyphenol từ củ gấu biển Tạp chí Dược liệu 19(6), tr 348-351 Nguyen Minh Chau, Pham Thanh Binh, Tran Thuong Quang, Nguyen Tien Dat (2015) Isolation and structural identification of a xanthone and an aurone from the rhizomes of Cyperus stoloniferus Tạp chí Hoá học, T53 (2e1), pp.36-39 Footer Page 27 of 148 ... từ hai loài củ gấu củ gấu biển phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học chất tách phương pháp phổ kết hợp - Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng liệu vân tay sắc ký củ gấu, củ gấu biển. .. L., nghiên cứu công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học sắc ký dấu vân tay chi Cyperus L Giới thiệu sơ lược củ gấu củ gấu biển Các nghiên cứu công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa. .. thành phần hóa học sắc ký dấu vân tay loài thực vật: củ gấu, củ gấu biển Việt Nam Ứng dụng phương pháp vật lý đại nghiên cứu cấu trúc hóa học hợp chất hữu 3.2 Những đóng góp luận án Hai loài củ gấu