Ứng dụng kỹ thuật GC o (gas chromatography olfactometry trong phân tích thực phẩm

Phân tích bằng phương pháp GCO là một kĩ thuật phân tích được tổng hợp từ hai cách thức phân tích khác nhau: đó là phân tích sắc kí khí dùng để phân tách những thành phần bay hơi của một

MỞ ĐẦU

Thực phẩm là một phần tất yếu trong cuộc sống của con người nên yếu tố cảm quan đóng vai trò quan trọng Xã hội phát triển khiến nhu cầu biến đổi từ “ăn no, mặc ấm” sang “ăn ngon, mặc đẹp” Vậy thế nào là ăn ngon, đó là phải đảm bảo có hình dạng, mầu sắc đẹp, mùi vị hấp dẫn đăc trưng cho sản phẩm Vì vậy, mùi đóng vai trò to lớn tạo nên chất lượng cho sản phẩm thực phẩm

Tuy nhiên việc nghiên cứu về mùi gặp rất nhiều khó khăn Phương pháp nghiên cứu được dùng phổ biến là phân tích cảm quan, nhưng chỉ đưa ra được những miêu tả về mùi của sản phẩm chứ không đưa ra được mùi của từng thành phần trong sản phẩm Rất nhiều sản phẩm có mùi không tốt nhưng ta không thể xác định được nguyên nhân

Hệ thống GC-O Hệ thống đưa ra miêu tả mùi cho từng cấu tử trong sản phẩm, đồng thời định tính định lượng được chính xác thành phần hóa học tạo ra mùi

GC-O (Gas Chromatography Olfactometry)

1 Lịch sử GCO

Năm 1952, máy sắc kí khí GC đầu tiên được ra đời dưới sự chủ trì của giáo

sư Keulemann, và các cộng tác viên Không lâu sau đó, các nhà hoá học đã quan tâm đến việc nghiên cứu mối tương quan giữa mùi và những thông số định tính và định lượng của các thành phần trong sản phẩm bằng việc sử dụng GC Năm 1964 Fuller, Steltenkamp, và Tisserand đã thông báo những miêu tả đầu tiên của hệ thống GC đã được thay đổi cho mục đích này Năm 1972 phiên bản GC-O (Gas chromatography-Olfaction) đầu tiên đã được ra đời với một thiết bị tạo không khí

ẩm giúp tăng khả năng cảm nhận mùi

Trong hơn 40 năm qua, phương pháp GCO ngày càng hoàn thiện và đóng góp quan trong vào việc tạo ra mối liên kết giữa các số liệu hoá học của sản phẩm với người tiêu dung

Thiết bị GCO đã có mặt trong rất nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu về mùi vị trên thế giới đặc biệt ở Mĩ, Pháp, Nhật Một trong những kết quả tiêu biểu thu nhận được nhờ sử dụng GCO là Flavornet Đây là một cơ sở dữ liệu được biên soạn bởi Terry Acree & Heinrich Arn trường đai học Cornell, Geneva, NY 14456,

Mĩ , bao gồm hơn 500 thành phần mùi hoạt tính, rất hữu ích trong lĩnh vực nghiên cứu về mùi

Ngoài ra, cũng cần phải nói đến rất nhiều các nghiên cứu khoa học về tinh dầu, rươu vang, sữa… đã được tiến hành cùng với GCO ví dụ như:

Năm 2002, PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thị Minh Tú cùng với các đồng nghiệp tại trường đại học Kochi, Nhật Bản đã có nghiên cứu về thành phần mùi đặc trưng của của tinh dầu lấy từ vỏ của một loại chanh của vùng Tanaka (Mochiyu), Nhật Bản theo phương pháp ép lạnh bằng việc sử dụng GCO Năm 2003, PA Clausen

và các đồng nghiệp đã sử dụng GCO để xác định mùi phát ra từ các sản phẩn chứa tinh dầu lanh tại Indoor Environment Group, Copenhagen, Đan Mạch… Hay vừa

mới đây nhất, năm 2007 Beata Plutowska và Waldemar Wardencki thuộc Technical University của Gdan´sk, Hà Lan đã có nghiên cứu đăng trên trang: www.sciencedirect.com của tạp chí sinh học và công nghệ Science Direct về việc

áp dụng GCO trong phân tích và đánh giá chất lượng của nước uống có ga Cũng trong năm này, David Obenland, Sue Collin, James Sievert, Kent Fjeld, JulieDoctor , Mary LuArpaia của trung tâm SanJoaquinValley Agricultural Sciences Center, KearneyAgricultural Center, SunkistGrowers, Mĩ đã cùng tiến hành nghiên cứu sự thay đổi của mùi thơm và sự mất mát hương vị do việc bao gói

và bảo quản của cam

Ở Việt Nam, phương pháp này còn khá mới mẻ Đặc biệt, chúng ta chưa có một thiết bị phân tích GCO dùng cho phương pháp phân tích này

2 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động GC-O.

Phân tích bằng phương pháp GCO là một kĩ thuật phân tích được tổng hợp từ hai cách thức phân tích khác nhau: đó là phân tích sắc kí khí dùng để phân tách những thành phần bay hơi của một hỗn hợp và phân tích cảm quan bằng cách sử dụng cơ quan cảm giác thính giác để ngửi những thành phần bay hơi được tách ra nhờ sự phân tách sắc kí trên

2.1 Sắc kí khí (GC)

Sắc kí là một họ các kĩ thuật hóa học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng

sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua

hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là "thời gian lưu "

Sắc kí khí là một trong các kĩ thuật sắc kí trong đó hỗn hợp phân tích được chuyên chở trong chất khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất tan khi chúng chảy qua pha tĩnh

Sắc kí khí là một trong những phương pháp tách các chất trong một hỗn hợp được

sử dụng nhiều nhất Nó giúp phân tích nhanh và đạt hiệu quả cao về mặt phân tách Nó cho phép xác định một cách định tính và định lượng các thành phần trong hỗn hợp khí phức tạp hoặc của hỗn hợp có thể hoá hơi nhưng không bị phân huỷ Dựa trên sự khác nhau về ái lực giữa pha tĩnh và pha động được thể hiển trong hai quá trình hấp thụ và giải hấp thụ xảy ra liên tục giữa hai pha: pha động (là khí: heli, nitơ, hydro, argon) và pha tĩnh (thường là rắn hoặc lỏng) Sự định tính dựa trên thời gian lưu và định lượng dựa vào chiều cao của pic hoặc diện tích pic Khi pha động chứa một phần tử chất cần phân tích A được cho chảy qua cột chứa pha tĩnh thì chất cần phân tích sẽ được phân bố giữa hai pha Kd như sau:

Kd =        

m

s d

t

A

A A

A



Trong đó [A]s là nồng độ chất A trong pha tĩnh tại thời điểm này trong cột và [A]m

là nồng độ chất A trong pha động

A chỉ có thể chuyển trong cột khi nó ở pha động Nói cách khác, nếu Kd rất lớn thì chất A sẽ chủ yếu ở pha tĩnh và sẽ bị giải hấp rất chậm Muốn biết một chất cần phân tích sẽ được giải hấp nhanh chậm ra sao, ta cần biết tỷ lệ thời gian mà nó sẽ ở pha động

Nguyên tắc hoạt động của máy sắc ký khí GC

Sơ đồ thu gọn của thiết bị sắc ký khí được mô tả theo hình:

Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và đêtêctơ Nhờ có khí mang chứa trong bơm khí, mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký xảy ra tại đây Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào đêtêctơ, tại đó chúng chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuyếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu

tử được tách gọi là pic Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng (định tính) cho chất cần tách Còn diện tích của pic là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu

Cấu tạo của máy sắc kí khí

Nguồn cung cấp khí mang

Khí mang phải không được tương tác với mẫu và chỉ mang mẫu đi qua cột Nói cách khác hệ số phân bố phải không phụ thuộc vào bản chất của khí mang mà chỉ phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh Nhiều khí đã được sử dụng trong GC gồm: heli, nitơ, hydro, argon hay không khí và oxy Heli là khí mang phổ biến nhất, đặc biệt ở Mỹ, nơi mà heli không quá đắt Heli là khí trơ hóa học rất thích hợp cho sắc

kí khí nhiệt độ cao Khí hydro thương mại thường đạt đủ tiêu chuẩn cho sắc kí

Tuy nhiên, hydro có thể phản ứng với chất phân tich và có vấn đề nghiêm trọng về

an toàn Argon cũng như các khí trơ khác, Argon trên cơ sở không có hoạt tính

hóa học được dùng cho sắc kí khí ở nhiệt độ cao Khí argon ngày càng được sử

dụng nhiều làm khí mang Khí nitơ do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ dàng làm

tinh khiết nên nitơ được sử dụng rất nhiều trong sắc kí khí Không khí và oxy: độ tinh khiết của oxy thương mại cũng đạt yêu cầu cho sắc kí khí, nhưng cần phải sấy khô vì rất dễ lẫn nước trong bom đựng khí

Khi lựa chọn khí mang cần để ý đến detector sử dụng, độ tinh khiết của khí mang và yêu cầu tách, sử dụng phối hợp với các phương thức khác Với detector

độ dẫn (TCD) cũng như detector dây đốt nóng và detector dẫn nhiệt cần phải sử dụng khí mang có độ dẫn cao như hydro, heli Detector ion hoá ngọn lửa (FID) có thể vận hành với tất cả các khí vô cơ làm khí mang trừ ôxi Detector cộng kết điện

tử (ECD) có thể vận hành với tất cả các khí mang khác nhau, khi làm việc theo kiểu dòng một chiều có thể dùng nitơ, vận hành theo kiểu xung có thể dùng argon

bổ sung 5% metan sẽ cho kết quả tốt hơn

Với mỗi bộ phận cung cấp khí mang cần có hệ thống điều khiển áp suất hoặc tốc

độ dòng khí mang, điều khiển bằng cơ hoặc điện tử

Buồng bơm mẫu

Trước khi vào cột tách thông thường mẫu được đi vào buồng bay hơi rồi dùng dòng khí mang đưa vào cột Tuy mẫu được mang qua cột dưới dạng pha khí nhưng mẫu thực cần phân tích có thể là khí lỏng hoặc rắn yêu cầu duy nhất là mẫu phải

có đủ áp suất hơi để có thể được làm bay hơi trong phòng mẫu, nhiệt độ của phòng mẫu có thể cao hơn nhiệt độ của cột để quá trình làm bay hơi được thực hiện dễ dàng

Mẫu có thể được đưa vào cột theo các hình thức:

- Gián tiếp và chia dòng

- Gián tiếp và không chia dòng

- Trực tiếp

Lò (buồng điều nhiệt)

Là nơi đặt hệ thống cột tách, có vai trò điều chỉnh, ổn định nhiệt độ, áp suất cột tách sao cho phù hợp với chế độ nhiệt của mỗi mẫu cần phân tích Có hệ thống đốt nóng, quạt điều nhiệt, và lớp bao bông thuỷ tinh để giữ nhiệt

Buồng điều nhiệt

Hệ thống cột tách

Trong thực tế có nhiều dạng cột tách nhằm thoả mãn các mục đích nghiên cứu khác nhau Nói chung, cột tách sắc ký cần đạt các yêu cầu sau đây:

- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh, nhờ việc tối ưu

hóa các thông số của phương trình vandemter

- Độ thấm cao, tức là độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định

- Khả năng tải trọng của cột tách, khả năng hoà tan của cấu tử trong pha tĩnh được chọn (chính là hệ số phân bố của cấu tử đó trong pha tĩnh đã cho) Hình dạng của đường phân bố đẳng nhiệt (trong trường hợp lý tưởng là đường thẳng qua gốc toạ độ) cũng đóng vai trò quan trọng đến khả năng tải trọng

- Phải có khoảng nhiệt độ sử dụng lớn, làm việc được ở nhiệt độ cao Người ta chia ra làm hai loại cột tách chính là cột nhồi và cột mao quản Tùy theo loại mẫu, độ phức tạp của mẫu và tùy loại máy sắc kí mà chọn cột nhồi hay cột mao quản

 Cột nhồi thường làm bằng thép không gỉ, thủy tinh, có đường kính từ 3

- 6 mm chiều dài cột thông thường là 5 -20 m nhưng không thể kéo dài tuỳ ý cột vì độ chênh lệch áp suất giữa đầu và cuối cột tăng tỷ lệ thuận với chiều dài cột

 Cột mao quản, thường được làm bằng vật liệu fused silica có tính bền

về mặt vật lý rất cao và trơ về mặt hóa học Cột mao quản thường có đường kính trong khoảng 0,53mm - 0,1mm, chiều dài thường từ 10 - 30

m, có khi lên tới 100 -150 m và thành trong của cột được tẩm pha tĩnh

So với cột nhồi cột mao quản có những ưu điểm sau:

- Các hỗn hợp phức tạp được tách với hiệu suất cao hơn hẳn

- Tách được tất cả các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau

- Độ tin cậy cao hơn trong việc nhận biết các cấu tử

- Độ nhạy phát hiện lớn hơn

- Giảm thời gian phân tích

- Cho phép nối trực tiếp với khối phổ kế mà không cần bộ tách

Yêu cầu chung cho pha tĩnh dùng cho cột sắc kí:

- Ít bay hơi

- Bền nhiệt

- Trơ về mặt hóa học

- Thường pha tĩnh được chọn trong phân tích dựa trên độ phân cực

Pha tĩnh của cột và các chất phân tích cần có độ phân cực tương tự thì mới tách tốt (các chất giống nhau hòa tan tốt vào nhau)

Detector

Detector có nhiệm vụ chuyển hoá một đại lượng không điện (trong trường hợp này

là nồng độ của các chất được tách khỏi cột sắc ký) thành đại lượng điện Ngày nay, đã có khoảng 30 loại detector khác nhau, trong đó 3 loại phổ biến nhất là: detector dẫn nhiệt (TCD) , detector ion hoá ngọn lửa (FID) và detector cộng kết điện tử (ECD)…

Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu

Hệ thống này dùng để thu thập và tính toán các kết quả

Một số dạng peak trong sắc kí khí:

 Dạng đối xứng: đây là dạng lý tưởng, thường thu được khi quá trình phân

bố chất giữa hai pha động và tĩnh xảy ra nhanh, ít hoặc không phụ thuộc vào nhiệt độ Nếu lượng mẫu tiêm vào không vượt quá dung lượng cho phép của cột thì thời gian lưu không phụ thuộc vào lượng mẫu tiêm vào

 Dạng không đối xứng: gồm 2 dạng kéo đuôi (talling) và dạng thu nhỏ (leading hay fronting) Hiện tượng này xảy ra khi: nồng độ chất phân tích quá lớn (thường xảy ra dạng kéo đuôi); có sự hấp phụ chất phân tích quá mạnh, chất phân tích trên pha tĩnh (cả 2 dạng) Thời gian lưu sẽ thay đổi

tùy lượng mẫu bơm.

Để nâng cao hiệu suất tách có thể:

- Lựa chọn pha tĩnh, chiều dài cột, đường kính cột, phù hợp với loại mẫu, lượng mẫu, lựa chọn chương trình nhiệt độ phù hợp

- Ghép nối hai hay nhiều cột có pha tĩnh khác nhau

- Với những mẫu có thành phần phức tạp việc ghép nối cột thường được sử dụng

- Những cột có đường kính không khác nhau nhiều có thể ghép nối với nhau

- Nếu kết hợp với van chuyển cột tự động cho phép tự động chuyển cột trong quá trình phân tích

2.2 GC-O (Gas Chromatography Olfactometry)

Phân tích bằng phương pháp GCO là một kĩ thuật phân tích được tổng hợp từ hai cách thức phân tích khác nhau: đó là phân tích sắc kí khí dùng để phân tách những thành phần bay hơi của một hỗn hợp và phân tích cảm quan bằng cách sử dụng cơ quan cảm giác thính giác để ngửi những thành phần bay hơi được tách ra nhờ sự phân tách sắc kí trên

Cấu tạo của thiết bị GCO

GCO là sự lắp giáp đặc biệt giữa máy sắc kí với một bộ ngửi (Olfactory Detector Port) Tính độc đáo của GCO chính là sự kết hợp khả năng phân tích sắc kí và sự nhạy cảm của cơ quan khứu giác của con người

Nguyên tắc hoạt động

Mẫu dùng để phân tích được bơm vào cột sắc kí khí Ở đầu ra của cột, một phần được dẫn đến đầu dò tín hiệu, phần còn lại được hướng trực tiếp tới mũi của người đánh giá cảm quan qua bộ ngửi Khi một mùi được nhận biết bởi người ngửi, các miêu tả về mùi sẽ được thông báo tới người thứ hai, người này sẽ ghi lại

và đưa ra một thời gian lưu tương ứng và đồng thời Tập hợp của những miêu tả và

thời gian lưu của chúng cho phép ta đưa ra một biểu đồ về mùi Dựa vào biểu đồ này, một mùi hay một vùng chất mùi tương ứng với một mùi sẽ được xác định chính xác

Việc xác định cấu trúc của phân tử và bản chất của chúng được thực hiện nhờ máy phân tích khối phổ GCMS Những vết của pic thu nhận được được so sánh với một thư viện phổ

Cấu tạo

GCO có cấu tạo gồm các bộ phận cơ bản như của một máy phân tích sắc kí thông thường : Nguồn cung cấp khí, một buồng tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò có kết nối với một thiết bị ghi tín hiệu Ngoài ra GCO còn có một số bộ phận đặc biệt tạo nên sự khác biệt với một máy GC đó là một bộ ngửi và một thiết bị tạo ẩm được thiết kế đặc biệt Các bộ phận này ở mỗi máy có thiết kế khác nhau nhưng chúng đều có mục đích:

- Cột không chứa pha tĩnh: không gây ra hiện tượng lưu giữ sắc kí đồ với các

cấu tử mang mùi khi đi ra ngoài môi trường không khí

- Bộ ngửi: có tác dụng chủ yếu là tạo ra môi trường nhiệt độ giúp cho các

thành phần bay hơi không bị ngưng tụ lại bên trong cột không có pha tĩnh khi đi từ bên ngoài lò nơi có nhiệt độ cao ra ngoài môi trường không khí có nhiệt độ thấp hơn

- Bộ tạo ẩm: hỗ trợ khả năng nhận biết mùi.

Vai trò - chức năng của GCO

- Xác định một cấu tử hay một nhóm các cấu tử tạo lên mùi đặc trưng của một sản phẩm thực phẩm

- Xác định ngưỡng cảm nhận của một chất tạo mùi của cơ quan khứu giác Liên kết giữa người tiêu dùng với các thông số hóa học của một sản phẩm