Ứng dụng Vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm

II Ứng dụng vi sinh vật bảo quản thực phẩm Các khái niệm • Kiểm soát sinh học (biocontrol) • Vi sinh vật ñối kháng (antagonistic microorganism) • Bảo quản phương pháp sinh học (bio-preservation) • Vi sinh vật bảo vệ (protective culture) II.1 Kiểm soát sinh học (biocontrol) • Biocontrol- Biological Control – Google 2.390.000 kết quả; tiếng Việt: 8.910 kết – PubMed: 7988 báo • Kiểm soát sinh học gắn liền với phát triển nông nghiệp bền vững • ðịnh nghĩa kiểm soát sinh học: “Dùng loài sinh vật sản phẩm sinh vật sống ñể hạn chế, tiêu diệt sinh vật khác” Kiểm soát sinh học ñối với sản phẩm sau thu hoạch • Có từ lâu ñời • Thế kỷ 19: Có số công bố nhà khoa học • Khoảng năm 60: Dịch bệnh Phát triển sản phẩm trừ sâu sinh học • Những năm 80: Phát triển ứng dụng vi sinh vật ñối kháng ñối với sản phẩm sau thu hoạch II.2 Tác nhân kiểm soát sinh học Vi sinh vật ñối kháng • Vi sinh vật có khả ức chế tiêu diệt vi sinh vật có hại (antagonistic microorganism) – Trichoderma kháng mốc thối xám (Botrytis) dâu tây – Pseudomonas syringae Van Hall có khả kháng Botrytis, Penicillium, Mucor Geotricum – Candida oleophila Montrocher kháng Botrytis, Penecillium spp Yêu cầu vsv ñối kháng Bền di truyền Hoạt ñộng có hiệu nồng ñộ thấp Có khả kháng nhiều loại vsv gây hỏng, gây bệnh Nhu cầu dinh dưỡng ñơn giản Có khả sống môi trường không thuận lợi Yêu cầu vsv ñối kháng Có thể sinh trưởng chất ñơn giản thiết bị phản ứng Không gây ñộc hại ñối với vật chủ, không sinh ñộc tố gây hại cho người Bền tác dụng chất bảo quản khác, chịu ñược công ñoạn xử lý hóa học vật lý II.3 Cơ chế hoạt ñộng tác nhân kiểm soát sinh học Vật chủ (thực phẩm) VSV gây hại, gây bệnh VSV khác VSV ñối kháng Cơ chế hoạt ñộng Khả sinh kháng sinh Cạnh tranh dinh dưỡng không gian Khả bám lên VSV có hại tác dụng trực tiếp lên chúng (ký sinh) Kích thích khả chống chịu VSV gây bệnh vật chủ Khả sinh kháng sinh • ðây chế hiệu • Bacillus subtilis sinh – Iturin: peptide có tính kháng nấm – Gramicidin S • Cơ chế thường phối hợp số chế khác theo “công nghệ rào cản” (hurdle technology) Kiểm soát sinh học Pseudomonas cepacia P.d: Penecillium digtatum gây mốc xanh lam P.i: Penecillium italicum gây mốc xanh lục Theo nghiên cứu Dr Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com) Kiểm soát sinh học Pseudomonas cepacia • Xử lý pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P cepacia với nồng ñộ khác • VSV gây bệnh Penecillium digitatum Theo nghiên cứu Dr Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com) Kiểm soát sinh học Pseudomonas cepacia • Kiểm soát mốc xanh lục gây Penecillium expansum pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P cepacia Theo nghiên cứu Dr Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com) Cạnh tranh dinh dưỡng không gian • Cơ chế thường gặp nấm men • Nấm men thường cạnh tranh với VSV gây hại, ức chế sinh trưởng, không tiêu diệt chúng • Khả ức chế hiệu nguồn dinh dưỡng khan Cạnh tranh dinh dưỡng không gian • Nấm men có khả tổng hợp màng polysaccharide tăng khả bám dính lên bề mặt rau • VSV ñối kháng sinh trưởng nhanh xâm chiếm vị trí vết dập rau • Sự sinh trưởng nhu cầu dinh dưỡng vsv ñối kháng làm cho số nấm mốc ñủ dinh dưỡng ñể phát triển Sự tạo thành Biofilm Candida oleophila Wisniewski et al (2007) Post harvest biocontrol: New concepts and applications Sự ký sinh • Pichia guilliermondii có khả bám dính sợi nấm Botrytis cinerea, tiêu diệt nấm số enzym phân hủy màng tế bào • Aspergilus pullulans vết dập táo có khả sinh tổng hợp enzym exochitinase β1,3-glucanase • Một số nấm men khác có khả giảm bám dính bào tử ngăn cản bào tử nảy mầm Sự bám dính Pichia guillemondii lên sợi nấm Botrytis cinerea Wisniewski et al (2007) Post harvest biocontrol: New concepts and applications Kích thích khả chống chịu • Một số vsv có khả tương tác với vật chủ, thúc ñẩy trình lành sẹo • Một số nấm men biểu tính ñối kháng ñược ñưa vào trước cấy vsv gây hại II.4 Các bước phát triển sản phẩm kiểm soát sinh học Khả tương thích Thu thập tác nhân KSSH Xác ñịnh ñặc tính phân loại ðánh giá áp dụng thử nghiệm ðánh giá PTN Phát tri n Phá Nhân giống hàng loạt M r ng Áp dụng diện rộng Phối trộn ñịnh dạng sản phẩm Cải thiện chủng Tương tác với vùng rễ Lưu kho phân phối Sản phẩm cuối Nghiên c u Xác ñịnh nhiễm tạp ðánh giá chấp nhận sản phẩm 10 Một số chế phẩm kiểm soát sinh học ñã thương mại hóa Tên chế phẩm Tác nhân kiểm soát sinh học Bio-save 100 Bio-save 1000 Bio-save 110 Pseudomonas syringae ESC10 Pseudomonas syringae ESC11 BlightBan A506 Pseudomonas fluorescens A506 Tác nhân gây hư hỏng Dạng chế phẩm Ứng dụng Nước sản xuất Botrytis cinerea, Penecillium spp., Mucor pyroformis, Geotrichum candidum Tế bào viên nhỏ dạng lạnh ñông Bảo quản sau thu hoạch cách dội qua, nhúng, phun EcoScience Corp., USA Hỏng ñông ñá, Erwinia amylovora, vi khuẩn gây nâu ñỏ Bột pha nước Phun vào hoa lúc nở trực tiếp lên Plan Health Technology, USA Một số bước tiếp cận nhằm ứng dụng sản phẩm KSSH bảo quản rau Áp dụng sau thu hoạch • Thông thường VSV ñối kháng ñược phân lập từ bề mặt rau • Số lượng tự nhiên VSV ñối kháng thường không ñủ ñể biểu hoạt tính mạnh • ðưa vào lượng lớn VSV ñối kháng ñối với sản phẩm sau thu hoạch • Tăng sinh ñối với VSV ñối kháng ñã có sẵn sản phẩm 11 Áp dụng sau thu hoạch • Ưu ñiểm – ðơn giản, dễ thực sau thu hoạch cách phun, ngâm, tưới – Nếu ñúng cách, ñúng thời ñiểm (trước VSV gây bệnh xâm nhập) có hiệu cao – Ít tốn việc phun thuốc diện tích lớn, dùng VSV nồng ñộ cao Candida oleophila, Cryptococcus albidus, Pichia membranefaciens Áp dụng sau thu hoạch • Giới hạn – Cần ñưa vào sau thu hoạch trước VSV gây hại xâm nhập – Một số vết thương vỏ họ cam chanh có chứa tinh dầu, khó khăn cho VSV ñối kháng bám vào 12 Áp dụng sau thu hoạch Giới hạn • Hiệu VSV ñối kháng tương ñối hẹp • Phụ thuộc loại rau • Phụ thuộc vào hoạt tính ñặc hiệu ñối với VSV gây bệnh • Khả bám dính VSV ñối kháng lên bề mặt khác ñối với sản phẩm sau thu hoạch khác Áp dụng trước thu hoạch • Phun ñịnh kỳ vào trước thu hoạch • Giới hạn – Có thể ảnh hưởng môi trường – VSV ñối kháng bị tiếp xúc biểu hoạt tính ñiều kiện khắc nghiệt (nhiệt ñộ, ñộ ẩm, ánh sáng, VSV khác, thuốc diệt sâu bọ,…) • Biện pháp: – Lựa chọn VSV có khả thích nghi tốt – Cho VSV làm quen, thích nghi với số stress trước ứng dụng 13 Dùng chủng biến ñổi • Các loại hạt lạc, ñậu ñỗ: – Ứng dụng nấm mốc Aspergillus flavus không sinh ñộc tố aphlatoxin ñể cạnh tranh với chủng hoang dã sinh ñộc tố • Thường ứng dụng ñối với rau tươi II.5 Vi khuẩn Lactic bảo quản thực phẩm Vi khuẩn lactic làm hư hỏng thực phẩm hay bảo quản thực phẩm? 14 Giới thiệu chung • Vi khuẩn lactic: lactic acid bacteria, vi khuẩn làm chua sữa • 1873: J Lister thu nhận Bacterium lactis (nay Lactococcus lactis) • 1919: Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa theo ñặc ñiểm – – – – Hình thái (cầu, que, …) Kiểu lên men glucoza: ñồng hình, dị hình Nhiệt ñộ sinh trưởng Khả sử dụng loại ñường 15 II.5.1 ðặc ñiểm chung • Vi khuẩn G+ • Không sinh bào tử (còn tranh cãi, Sporolactobacillus) • Catalase – • Yếm khí tùy tiện • Chịu ñược axit • Lên men ñường tạo thành chủ yếu axit lactic • Vi khuẩn lactic thường sống nơi có môi trường dinh dưỡng dồi (thực phẩm), có số sống thể ñộng vật Các ñặc ñiểm phân loại vi khuẩn lactic Hình que ðặc ñiểm Carnob Hình cầu Lactob Aeroc Enteroc Lactoc Vagoc Leucon Oenoc Pedioc Streptoc Tetragenoc Weissella Tạo tứ cầu - - + - - - + - + - Sinh CO2 từ glucoza - ± - - - + - - - + Sinh trưởng 10oC + ± + + + + ± - + + Sinh trưởng 45oC - ± - + - - ± ± - - Chịu muối 6,5% ND ± + + - ± ± - + ± Chịu muối 18% - - - - - - - - + - Sinh trưởng pH4,4 ND ± - + ± ± + - - ± Sinh trưởng pH9,6 - - + + - - - - + - Axit lactic L D, L, DL L L L D D, DL L L D,D L 16 II.5.2 Cơ chế tác dụng vi khuẩn lactic bảo quản thực phẩm • Cạnh tranh không gian • Cạnh tranh dinh dưỡng • Sinh số chất kháng vi sinh vật Cạnh tranh không gian • Nhiều loài thuộc giống Lactobacillus có khả ngăn chặn bám dính vi sinh vật gây bệnh bề mặt • Bản chất chất ức chế chưa ñược nghiên cứu nhiều • Chất hoạt ñộng bề mặt (surlactin), glycoprotein, glycolipid 17 Các chất kháng vi sinh vật từ vi khuẩn lactic • Axit hữu • H2O2 • CO2 • Diacetyl • Các chất phân tử lượng thấp • Bacteriocin Yếu tố ảnh hưởng ñến tác dụng axit hữu • Trong thực tế thường ứng dụng thực phẩm_ hệ phức tạp chất hữu • Các chất thực phẩm ảnh hưởng ñến khả kháng VSV vi khuẩn lactic – Cao nấm men làm giảm khả kháng khuẩn vk lactic axetic – Sữa máu tăng cường khả kháng khuẩn axit axetic 18 H2O2 • Vi khuẩn lactic có O2 chuyển thành H2O2 tác dụng oxidases, NADH oxidases có chứa flavoprotein superoxide dismutase • Một lý ñó lactic không sinh catalase ñể phân hủy H2O2 hệ phân hủy yếu hệ sinh • Thực tế theo số nhà nghiên cứu H2O2 không tích tụ lại nhiều in vivo, thường bị phân hủy nhanh chóng Cơ chế tác dụng H2O2 • Tính kháng khuẩn dựa vào khả oxy hóa ñại phân tử H2O2 bị phân hủy • Protein lipid phía vỏ tế bào bị ôxy hóa • Một số phản ứng xảy ñối với vi khuẩn lactic ñể tạo H2O2 lấy hết oxy, tạo môi trường yếm khí, lợi cho số vsv • Vi khuẩn lactic sinh H2O2 có mặt ñường tiết niệu, ñóng vai trò quan trọng việc tránh viêm nhiễm 19 H2O2 • Trong tự nhiên, tác dụng kháng khuẩn H2O2 ñược tăng lên lactoperoxidase thiocyanate (SCN-) • SCN- + H2O2 OSCN- + H2O lactoperoxidase • Cấu trúc màng tế bào vsv bị thay ñổi tiếp xúc với OSCN• Hiệu chủ yếu chu trình glycolysis bị chặn enzym bị ảnh hưởng • Tác dụng nhanh ñối với VK G-, lâu ñối với G+ CO2 • Tạo môi trường yếm khí, ức chế số vi khuẩn • Quá trình decarboxyl hóa bị ức chế • Tích tụ CO2 màng lipid tế bào làm vô hoạt thẩm thấu chât qua thành tế bào • Vi khuẩn G- nhạy cảm vi khuẩn G+ 20 Tác dụng Diacetyl • Diacetyl kháng vi sinh vật tốt pH 100 mg/l 23 2-Pyrrolidone-5-carboxylic Acid • Tìm thấy Lactobacillus casei ssp casei, Lb casei ssp.pseudoplantarum Streptococcus bovis • Bền nhiệt (121oC, 20 phút), giảm hoạt tính pH tăng 2,5 Bacteriocin • • • • • Hợp chất sinh tổng hợp ribosome Bản chất Protein Ức chế vi khuẩn khác Có mặt hầu hết vi khuẩn Phổ ức chế tương ñối hẹp: – Nhược ñiểm – Ưu ñiểm: Tiêu diệt có chọn lọc vi sinh vật ñặc hiệu mà không ảnh hưởng ñến hệ sinh vật có ích 24 Bacteriocin kháng sinh ðặc ñiểm Bacteriocin Ứng dụng Sinh tổng hợp Thực phẩm Ribosome Hoạt ñộ Miễn dịch sinh vật chủ Cơ chế thích nghi vsv ñích Phổ hẹp Có Kháng sinh Y dược SP trao ñổi chất bậc hai Phổ khác Không Sự thích nghi Có thể biến ñổi màng tế bào mặt di truyền vị trí tác dụng Cơ chế tác dụng Thường tạo lỗ Màng tế bào màng tế bào nội bào Phản ứng phụ Chưa có báo cáo Có Tác dụng Pediocin AcH lên Listeria monocytogenes L monocytogenes chưa xử lý Sau 30 phút xử lý với Pediocin Sau xử lý với Pediocin Ennahar et al (1996) Production of pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE 92 isolated from cheese Applied and Environmental Microbiology 62 (12) 4381-4387 25 ... triển sản phẩm trừ sâu sinh học • Những năm 80: Phát triển ứng dụng vi sinh vật ñối kháng ñối với sản phẩm sau thu hoạch II.2 Tác nhân kiểm soát sinh học Vi sinh vật ñối kháng • Vi sinh vật có khả... với rau tươi II.5 Vi khuẩn Lactic bảo quản thực phẩm Vi khuẩn lactic làm hư hỏng thực phẩm hay bảo quản thực phẩm? 14 Giới thiệu chung • Vi khuẩn lactic: lactic acid bacteria, vi khuẩn làm chua... chọn lọc vi sinh vật ñặc hiệu mà không ảnh hưởng ñến hệ sinh vật có ích 24 Bacteriocin kháng sinh ðặc ñiểm Bacteriocin Ứng dụng Sinh tổng hợp Thực phẩm Ribosome Hoạt ñộ Miễn dịch sinh vật chủ