Bài báo cáo được tác giả thực hiện tại Trường Đại học Bách khoa TPHCM. Bài báo cáo nêu khái quát những nguyên tắc chung của sắc ký, phân tích làm rõ những đặc điểm quan trọng của một hệ thống sắc ký hiệu năng cao. Qua đó, định hướng ứng dụng HPLC trong phân tích các thành phần của thực phẩm. Bài báo cáo là tài liệu hay, ý nghĩa cho các bạn đang học sau đại học có học môn “Ứng dụng của sắc ký trong phân tích thực phẩm” để làm tài liệu tham khảo cho quá trình học tập.
Trang 1HCM UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING
BÁO CÁO KHOA HỌC
ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
Trang 2NỘI DUNG
I TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT SẮC KÝ
II CẤU TẠO CỦA HỆ THỐNG HPLC
III ỨNG DỤNG HPLC TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
Trang 3I TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT SẮC KÝ
• Nguyên lý: Quá trình tách của các cấu tử (chất cần phân tích ra khỏi chất nền) dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối với pha tĩnh và pha động
• Hệ thống: Pha tĩnh (stationary phase) và pha động (mobile phase)
• Các loại sắc ký phổ biến: Sắc ký khí (Gas
chromatography) và sắc ký lỏng (liquid
chromatography)
Trang 4Nguyên tắc của quá trình tách
Trang 5Nguyên tắc của quá trình tách
Trang 6Nguyên tắc của quá trình tách
Trang 7Nguyên tắc của quá trình tách
Trang 8sắc ký đồ Nguyên tắc của quá trình tách
Trang 9• Nguyên lý: Quá trình tách của các cấu tử (chất cần phân tích ra khỏi chất nền) dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối với pha tĩnh và pha động
• Hệ thống: Pha tĩnh (stationary phase) và pha động (mobile phase)
Trang 10Nguyên tắc của quá trình tách
• Dựa vào mức độ tương tác (ái lực) hoặc kích
thước khác nhau của các chất cần phân tích với các nhóm chức (phân cực hoặc không phân cực, ion dương hoặc âm ) hoặc với kích thước các
khoảng trống (rây phân tử) trong cột nhồi mà các chất có thời gian lưu lại trong cột khác nhau dẫn đến quá trình tách giữa các chất
Trang 11II CẤU TẠO HỆ THỐNG HPLC
• Hệ thống bơm (Pump)
• Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
• Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ
cột)
• Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)
• Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)
• Đầu dò (Detector)
• Hệ thống xử lý dữ liệu
Trang 12HPLC System
Trang 13Cột sắc ký
• Chứa pha tĩnh
• Được nhồi đầy bằng các hạt nhồi
Trang 15Cột sắc ký
• Các loại cột thường dùng trong phân tích:
– Cột pha đảo (Reverse phase)
– Cột pha thuận (Normal Phase)
– Cột trao đổi ion âm (Anion Exchange)
– Cột trao đổi Ion dương (Cation Exchange)
– Cột sắc ký rây phân tử (Size Exclusion)
– Cột sắc ký ái lực (Affinity)
– Cột sắc ký đẳng điện (Mono P)
– Cột Ceramic Hydroapatite (CHT)
Trang 17Pha tĩnh
• Sắc ký lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography
- NPLC)
– Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các
nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino
Silica
Trang 19• Độ phân cực của dung môi
Trang 20Dung môi
Hexan Isooctan Petroleum ether Cyclohexan Carbon tetrahydrochloride Chloroform
Dichlorometan Tetrahydrofuran Diethyl ether Ethyl acetate Aceton
Acetonitril Isopropanol Methanol Nước Acid acetic
Khả năng tan trong nước
Không Không Không Không Không Không Không
Có Không
Trang 21pH: Pha động
• pH cũng ảnh hưởng
đến hiệu quả tách giữa
các chất Tuy nhiên tùy
thuộc vào bản chất của
các chất phân tích mà
ảnh hưởng của pH có
thể làm tăng hoặc giảm
khả năng tách của cột
Trang 22ỨNG DỤNG CỦA HPLC TRONG PTTP
• Florfenicol là 1 loại thuốc kháng khuẩn phổ rộng thay thế cho kháng sinh Chloramphenicol – là loại kháng sinh chủ yếu dùng
để trị bệnh nhiễm trùng huyết đường ruột trên cá tra, ba sa …
• Florfenicol (2,2-dichloro-N-((1R,2S)-3-fluoro-1- (methylsulfonyl) phenyl) propan-2-yl) tan tốt trong các dung môi phân cực như: Nước, Chlorofrom, Methanol, Ethyl acetate, Acetone, Tan ít trong các dung môi không phân cực như: n- hexane, Diether ethyl, Benzene, Petroleum ether,
hydroxy-1-(4-• Công thức phân tử: C12H14Cl2FNO4S
Trang 23• Phương pháp này mô tả qui trình phân tích xác định hàm lượng Florphenicol trong các mẫu có nguồn gốc động vật bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao gọi tắt là HPLC Giới hạn phát hiện của phương pháp 50 µg/kg
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN
Trang 24• Dư lượng Florphenicol trong mẫu được ly trích bằng ethyl acetate Dung môi được làm khô bằng dòng khí nitơ, sau đó hoà tan lại bằng pha động
và làm sạch mẫu bằng n – hexan Hàm lượng chất phân tích được xác định trên hệ thống HPLC, cột pha đảo C18 và đầu dò UV ở bước sóng 220nm
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN
Trang 25• Lấy các phần ăn được từ những vị trí khác nhau của mẫu Cắt phần mẫu vừa lấy thành từng miếng nhỏ từ 3-5 cm Cho phần mẫu vừa cắt (khoảng 100 gam) vào máy xay mẫu, xay đến khi mẫu đồng nhất Giữ mẫu ở -
18 C hoặc thấp hơn cho đến khi phân tích Khi tiến
hành phân tích mẫu phải đưa về nhiệt độ phòng
CHUẨN BỊ MẪU
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN
Trang 26Chuẩn bị mẫu trắng:
• Mẫu trắng là mẫu được xác định không chứa florphenicol Cân 5.00g ± 0.1g mẫu
đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm 50ml
• Cân 5.00g ± 0.1g mẫu trắng đã xay nhuyễn vào ống ly tâm 50ml Thêm 0.5ml dung dịch chuẩn 10µg/ml (7.5.6.5) vào 5.00g mẫu trắng Để yên 20 phút trước khi phân tích
Chuẩn bị mẫu thử:
• Cân 5.00g ± 0.1g mẫu đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm 50ml
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN
Trang 27• Cho 7ml ethyl acetate (V1) vào các ống ly tâm chứa mẫu trắng ,mẫu kiểm soát và mẫu thử , đậy nắp
• Lắc khoảng 5 phút, ly tâm 7 phút ở tốc độ 6000 vòng /phút
• Hút 5 ml (V2) lớp trên cho vào ống ly tâm thủy tinh 15ml
• Làm khô dung dịch bằng hệ thống thổi khí nitơ ở nhiệt độ
50 0 C
PP TIẾN HÀNH
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN
Trang 28• Hoà tan phần cặn bằng 5 ml n- hexan, sau đó cho tiếp 1ml (V3) pha động vào, lắc khoảng 10 phút trên máy lắc , ly tâm 5 phút, tốc độ 4000v/phút
Trang 29Thời gian chạy: 10 phút
Pha động: Acetonitril: đệm Ammonium acetate = 25:75 (v/v)
Rửa cột: Sau khi mẫu chạy hoàn tất, rửa cột và hệ thống HPLC với nước cất và acetonitril với lưu lượng 1ml/phút theo tỉ lệ: 35:65 trong 60 phút
ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH TRÊN HPLC
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN
Trang 30• Cân bằng cột sắc ký với pha động 30 phút
trước khi tiêm mẫu và chuẩn
• Thứ tự tiêm: tiêm dãy chuẩn, mẫu trắng, mẫu kiểm soát, sau đó tiêm mẫu thử
Trang 31PHÂN TÍCH FLORFENICOL THEO TIÊU CHUẨN
QUỐC TẾ
Trang 32PHÂN TÍCH FLORFENICOL THEO TIÊU CHUẨN
QUỐC TẾ