đánh giá khả năng định tính nhóm beta agonist trong thịt bằng kit betaagonist elisa của hãng randox (anh)

MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu .3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lý thuyết chất kích thích tăng trưởng họ Beta-agonist 1.1.1 Clenbuterol 1.1.2 Salbutamol 1.2 Tình hình nghiên cứu nhóm Beta-agonist nước ngồi nước 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nước ngồi 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 13 1.3 Thực trạng sử dụng Beta-agonist thịt nước giới 15 1.4 Một số phương pháp sử dụng để phân tích Beta-agonist 16 1.4.1 Phương pháp ELISA 17 1.4.2 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 20 1.5 Một số vấn đề thẩm định phương pháp phân tích sàng lọc 21 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu: 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 23 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 23 2.1.4 Hóa chất thuốc thử 23 2.1.5 Thiết bị, dụng cụ 23 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Xác định có mặt Salbutamol thịt lợn phương pháp ELISA 26 2.3.2 Xác định có mặt Clenbuterol thịt lợn phương pháp ELISA 26 2.3.3 Xác định phù hợp kit ELISA 27 2.3.3.1 Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) 27 2.3.3.2 Độ chọn lọc (Selecsibility) 27 2.3.3.3 Độ nhạy (Sensitivity) 28 2.3.3.4 Giới hạn phát nhỏ LOD 28 2.3.3.5 Độ thu hồi (Recovery) 29 2.3.4 Thí nghiệm đảm bảo chất lượng kết thử nghiệm kit ELISA 30 2.3.5 Khẳng định khả phát Beta-agonist Kit phương pháp định lượng LC/MS/MS 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Xác định phù hợp kit ELISA 33 3.1.1 Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) 33 3.1.2 Độ chọn lọc (Selecsibility) 37 3.1.4 Độ nhạy (Sensitivity); Độ thu hồi (Recovery) 42 3.2 Khẳng định lại khả phát Beta-agonist Kit ELISA phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS 43 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 3.3 Ứng dụng phù hợp phương pháp phát Beta-agonist kit ELISA mẫu thực thị trường 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - Clen: Clenbuterol - ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - HPLC: High-performance liquid chromatograph - LC/MS/MS: Sắc ký lỏng khối phổ - LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) - LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) - NN&PTNT: Nông nghiệp Phát triển nông thôn - ppb: Phần tỷ (Parts per billion) - Sal: Salbutamol - TACN: Thức ăn chăn nuôi - TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Nhóm chất β2-agonist Bảng 1.2 Giới hạn cho phép Clenbuterol Salbutamol mẫu 15 Bảng 2.1 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác 29 Bảng 3.1 Kết tổng hơp hệ số hồi quy tuyến tính Clenbuterol 34 Bảng 3.2 Kết tổng hơp hệ số hồi quy tuyến tính Salbutamol 36 Bảng 3.3 Kết phân tích Clenbuterol Salbutamol mẫu thịt 37 Bảng 3.4 Kết phân tích Clenbuterol mẫu trắng đánh giá LOD 39 Bảng 3.5 Kết phân tích Clenbuterol mẫu thêm chuẩn đánh giá LOD 39 Bảng 3.6 Kết phân tích Salbutamol mẫu trắng đánh giá LOD 40 Bảng 3.7 Kết phân tích Salbutamol mẫu thêm chuẩn đánh giá LOD 41 Bảng 3.8 Kết phân tích Clenbuterol Salbutamol mẫu thêm chuẩn 42 giá trị LOD Bảng 3.9 Kết phân tích mẫu mù Elisa LC/MS/MS 44 Bảng 3.10 Kết phân tích Clenbuterol mẫu nghiên cứu 45 Bảng 3.11 Kết phân tích Salbutamol mẫu nghiên cứu 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học nhóm chất β1-agonist Hình 1.2 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng kéo dài Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng ngắn Hình 1.4 Cấu trúc hóa học nhóm chất Beta-agonist chưa phân loại Hình 1.5 Vị trí lấy mẫu nghiên cứu 25 Hình 3.1 Độ hấp thụ OD dãy chuẩn kit Clenbuterol 34 Hình 3.2 Độ hấp thụ OD dãy chuẩn kit Salbutamol 36 Hình 3.3 Biểu đồ thể tương đồng kết Clenbuterol thịt phương LC/MS/MS Biểu đồ thể tương đồng kết Salbutamol thịt phương LC/MS/MS phân tích pháp Elisa 49 phân tích pháp Elisa 48 Hình 3.2 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày xã hội phát triển cao nhu cầu đời sống người cao hơn, chất lượng an toàn thực phẩm chiếm vị trí quan trọng Các ngành, quan quản lý Nhà nước có đề án, chương trình nhằm nâng cao chất lượng quản lý sử dụng chất kháng sinh lĩnh vực cụ thể Tuy nhiên, việc quản lý hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh chưa đồng triệt để, tình trạng sử dụng chất kháng sinh tùy tiện Dẫn đến tồn dư chất kháng sinh, gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng Trong lĩnh vực dược phẩm, Beta-agonist nhóm chất sử dụng nhiều điều trị bệnh hen suyễn hay tắc nghẽn phổi mãn tính, hai chất điển hình Salbutamol Clenbuterol Nhu cầu người sử dụng ngày cao, thúc đẩy tăng trưởng tăng lượng nạc cho gia súc, gia cầm Dẫn đến việc sử dụng kích thích tố tăng trưởng, hormone tăng trọng ngày phổ biến từ nhà sản xuất thức ăn chăn nuôi đến người chăn nuôi Clenbuterol Salbutamol đưa vào thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng gia súc, gia cầm Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm Beta-agonist có Clenbuterol Salbutamol xếp vào danh mục "Thuốc, hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn" (Bộ NN PTNT, 2009) Kiểm soát diện nhóm Beta-agonist thức ăn gia súc, gia cầm vào năm gần Nhà nước quan tâm trọng, nhiên chưa tập trung, triệt để Việc định lượng xác dư lượng Beta-agonist thức ăn chăn nuôi vấn đề cần quan tâm công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm Đồng thời, việc xác định tồn dư Betaagonist thịt số gia súc cần thiết mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng chất thức ăn chăn nuôi đưa cảnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page báo vệ sinh an toàn thực phấm Phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ (LCMS/MS) phương pháp sử dụng để kiểm tra xác hàm lượng nhóm Beta-agonist tồn dư thực phẩm Tuy nhiên với chi phí đầu tư thiết bị, máy móc cao, địi hỏi đội ngũ kiểm nghiệm có trình độ chun mơn; việc sàng lọc diện nhóm Beta-agonist cơng đoạn cần thiết trước tiến hành kiểm nghiệm sâu ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu cần phân tích ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình sàng lọc, kiểm tra an tồn chất lượng sản phẩm thực phẩm Trên thị trường có nhiều loại kit ELISA có khả định tính Betaagonist hãng khác như: kit ELISA hãng Biooscientific (MaxSignalTM Beta-agonist, mã 1009), kit ELISA hãng Tecna (Beta-Agonist ELISA Kit, mã AA107), kit ELISA hãng Randox (Beta-Agonist ELISA, mã SU2148; Clenbuterol ELISA, mã CB-1418) Mỗi loại kit ELISA để phân tích định tính dư lượng Beta-agonist thịt hãng khác khác nhiều khả ứng dụng theo mục đích sử dụng điều kiện thực tế phòng thử nghiệm Việt Nam Việc đánh giá loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định tính dư lượng Beta-agonist thịt lợn phải phù hợp với quy định Quyết định số 2002/657/EC Ủy ban Châu Âu thiết lập cho phương pháp bán định lượng cần khẳng định phương pháp định lượng Sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS) Để góp phần giúp quan có thẩm quyền, đặc biệt Sở Nông nghiệp Phát triển nông thôn Hà Nội lựa chọn loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định tính dư lượng Beta-agonist thịt lợn, góp phần xây dựng chiến lược phịng ngừa chất tồn dư độc hại thực phẩm có nguồn gốc động vật, đảm bảo cung cấp thực phẩm an toàn cho nguời tiêu dùng Xuất phát từ cấp bách tình hình thực tế, sở khoa học cơng trình nghiên cứu Betaagonist cơng bố ngồi nước, chúng tơi thực đề tài: “Đánh giá khả định tính nhóm Beta-agonist thịt kit Beta-agonist Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ELISA hãng Randox (Anh)” Nghiên cứu góp phần vào việc quản lý, bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Mục đích nghiên cứu Đánh giá phù hợp kit ELISA việc sàng lọc định tính Betaagonist (Clenbuterol Salbutamol) thịt Tạo thuận lợi cho quan quản lý nhà nước địa bàn Hà Nội lựa chọn kit thử nhanh, phù hợp để nâng cao chất lượng quản lý an toàn thực phẩm Phạm vi nghiên cứu Beta-agonist nhóm hợp chất tự nhiên, có nguồn gốc từ Catecholamines, có khoảng 20 hợp chất khác Hiện Việt Nam, chất thường sử dụng chăn nuôi Clenbuterol, Sabutamol, Ractopamine, Malbutamol, Zilpatrol, Cimaterol phổ biến Clenbuterol, Sabutamol (Dương Thanh Liêm cs, 2002) Do nghiên cứu, tác giả tập trung với đối tượng nghiên cứu Kít ELISA định tính Clenbuterol Salbutamol Hãng Randox (Anh) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lý thuyết chất kích thích tăng trưởng họ Beta-agonist Beta-agonist loại hợp chất cường giao cảm, kích thích tăng trưởng gồm hợp chất tổng hợp có dẫn xuất từ thiên nhiên Adrenaline Noradrenaline tủy tuyến thượng thận tiết Chúng nhóm thuốc gồm nhiều hóa chất khác Nhóm chất thuộc họ Beta-agonist chia thành nhiều loại tùy theo tác dụng hợp chất (Witkamp, R F.,1996) - Nhóm β1–agonists Hình 1.1 Cấu trúc hóa học nhóm chất β1-agonist Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page - Nhóm β2–agonists thường dùng điều trị hen suyễn dạng hít, tác dụng sau - phút, kéo dài 3- gồm chất trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1 Nhóm chất β2-agonist Nhóm Điển hình Tác dụng ngắn Levoalbuterol Salbutamol (Albuterol, Ventolin) Terbutaline Pirbuterol (Maxair) Procaterol Orciprenaline Metaproterenol (Alupent) Fenoterol Bitolterol mesylate Ritodrine Tác dụng kéo dài Tác dụng siêu dài Salmeterol (Serevent Indacaterol Diskus) Formoterol (Foradil) Bambuterol Clenbuterol Hình 1.2 Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng kéo dài Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ... loại kit ELISA có khả định tính Betaagonist hãng khác như: kit ELISA hãng Biooscientific (MaxSignalTM Beta- agonist, mã 1009), kit ELISA hãng Tecna (Beta- Agonist ELISA Kit, mã AA107), kit ELISA hãng. .. thực tế, sở khoa học cơng trình nghiên cứu Betaagonist cơng bố ngồi nước, chúng tơi thực đề tài: ? ?Đánh giá khả định tính nhóm Beta- agonist thịt kit Beta- agonist Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận... kit ELISA hãng Randox (Beta- Agonist ELISA, mã SU2148; Clenbuterol ELISA, mã CB-1418) Mỗi loại kit ELISA để phân tích định tính dư lượng Beta- agonist thịt hãng khác khác nhiều khả ứng dụng theo