Kiến thức Di truyền học bổ sung

Ví dụ, việc sử dụng điểm polyA nằm phía trớc điểm kết thúc đoạn trình tự mã hoá cóthể loại bỏ một số exon nằm sau nó và sinh ra mARN mã hóa cho một loại protein ngắn hơn.Một phân tử tiền

gen hợp thành các phân tử ADN rất dài nằm trong các cấu trúc đợc gọi là nhiễm sắc thể ở

ngời có khoảng 30.000 - 40.000 gen phân bố trên 23 cặp NST, trong đó có 22 cặp NST thờng(autosome) và 1 cặp NST giới tính (X và Y) Nh vậy, ở ngời có 24 loại NST khác nhau Trênnhiễm sắc thể, các gen thờng nằm phân tán và cách biệt nhau bởi các đoạn trình tự không mã

hóa Các đoạn trình tự này đợc gọi là các đoạn ADN liên gen ADN liên gen rất dài, nh ở ngời

các gen chỉ chiếm dới 30% toàn bộ hệ gen Xét ở mỗi gen, chỉ một mạch của chuỗi xoắn kép

là mang thông tin và đợc gọi là mạch khuôn dùng để tạo ra phân tử ARN mang trình tự bổ trợ

để điều khiển quá trình tổng hợp chuỗi polypeptit Mạch kia đợc gọi là mạch không làm

khuôn Cả hai mạch trên phân tử ADN đều có thể đợc dùng làm mạch để mã hoá cho các gen

khác nhau Ngoài ra, ngời ta còn dùng một số thuật ngữ khác để chỉ mạch khuôn và mạch

không làm khuôn, nh mạch đối nghĩa / mạch mang nghĩa, mạch không mã hoá / mạch mã

hoá Cần chú ý là, mạch đối nghĩa và mạch không mã hóa chính là mạch khuôn để tổng hợp

phân tử ARN

Khả năng lu giữ thông tin di truyền của ADN là rất lớn Với một phân tử ADN có n bazơ

sẽ có 4n khả năng tổ hợp trình tự bazơ khác nhau Trong thực tế, chỉ một số lợng hạn chế cáctrình tự mang thông tin có ích (thông tin mã hóa các phân tử ARN hoặc protein có chức năngsinh học)

I 2 Về tổ chức của gen

Hầu hết các gen phân bố ngẫu nhiên trên nhiễm sắc thể, tuy nhiên có một số gen đợc tổ

chức thành nhóm, hoặc cụm Có hai kiểu cụm gen, đó là các operon và các họ gen.

Operon là các cụm gen ở vi khuẩn Chúng chứa các gen đợc điều hoà hoạt động đồng

thời và mã hoá cho các protein thờng có chức năng liên quan với nhau Ví dụ nh operon lac ở

E coli chứa ba gen mã hoá cho các enzym mà vi khuẩn cần để thủy phân lactose Khi có lactose làm nguồn năng lợng (và vắng mặt glucose) thì vi khuẩn cần ba enzym do operon lac

mã hoá Sự dùng chung một trình tự khởi đầu phiên mã (promoter) của các gen trong operon(hình 1) cho phép các gen đó đợc điều khiển biểu hiện đồng thời và sinh vật có thể sử dụngnguồn năng lợng một cách hiệu quả

ở các sinh vật bậc cao không có các operon, các cụm gen đợc gọi là các họ gen Không

giống nh các operon, các gen trong một họ gen rất giống nhau, nhng không đợc điều khiểnbiểu hiện đồng thời Sự cụm lại của các gen trong họ gen có lẽ phản ánh nhu cầu cần có nhiềubản sao của những gen nhất định và xu hớng lặp đoạn của nhiều gen trong quá trình tiến hóa.Một số họ gen tồn tại thành nhiều cụm riêng biệt trên nhiều nhiễm sắc thể khác nhau Hiện t-ợng này có lẽ là do sự tái cấu trúc ADN trong quá trình tiến hoá đã phá vỡ các cụm gen Các

họ gen có thể có cấu trúc đơn giản hoặc phức tạp ở các họ gen đơn giản, các bản sao của gen

giống hệt nhau Ví dụ nh họ gen mã hóa ARN ribosom 5S (rARN 5S) ở mỗi tế bào ngời, cókhoảng 2000 cụm gen của gen này, phản ánh tế bào cần số lợng lớn sản phẩm của gen này

(hình 2a) Trong khi đó, các họ gen phức tạp chứa các gen tơng tự nhng không giống hệt

nhau Ví dụ nh họ gen globin ở ngời mã hóa cho cho các chuỗi polypeptit tơng ứng với cácloại globin , , , , và  (hình 2b) chỉ khác nhau vài axit amin Các chuỗi polypeptit globin t-

ơng tác với nhau thành một phức hệ, và kết hợp với các phân tử hem để tạo ra hemoglobin(một loại protein vận chuyển oxy trong máu)

ADN

Trình tự điều hòa

Hình 1 Operon Lac Ba gen (lac Z, lac Y và lac A) xếp liền kề nhau và đ ợc điều khiển chung

ADN

a)

Các gen mã hóa ARN ribosom (rARN)

Các trình tự liên gen (ADN đệm)

I 3 Trình tự khởi đầu phiên mã (promoter)

Sự biểu hiện của gen đợc điều khiển rất chặt chẽ Không phải tất cả các gen có trongADN của tế bào đều đợc biểu hiện đồng thời Những gen khác nhau đợc hoạt hoá biểu hiệnvào những thời điểm và ở những tế bào khác nhau Tất cả các gen đợc biểu hiện trong một tếbào sẽ xác định đặc tính và chức năng của tế bào đó Ví dụ, các gen biểu hiện trong tế bào cơkhác với các gen đợc biểu hiện trong tế bào máu Sự biểu hiện của gen đợc điều khiển bắt đầu

từ một đoạn trình tự ADN đứng trớc (nằm ngợc dòng về phía đầu 5’) so với đoạn trình tự mã

hóa đợc gọi là trình tự khởi đầu phiên mã (promoter, còn gọi là trình tự khởi động) Đoạn

trình tự khởi động chứa trình tự đặc hiệu đợc ARN polymerase và các protein đặc biệt gọi là

các yếu tố phiên mã nhận biết để gắn vào trong quá trình phiên mã của gen Mức độ biểu

hiện của gen trong tế bào đợc xác định bằng mức độ gắn kết (ái lực) của ARN polymerase vàcác yếu tố phiên mã với promoter

I 4 Exon và Intron

ở các sinh vật bậc cao (sinh vật nhân chuẩn), thông tin di truyền mã hoá trên các NST

thờng bị phân cắt thành nhiều đoạn trình tự ADN cách biệt đợc gọi là các exon Các exon bị ngăn cách bởi những trình tự không mang thông tin có ích đợc gọi là các intron (hình 3) Số l-

ợng các intron trong một gen biến động lớn, có thẻ từ 0 đến trên 50 phân đoạn Độ dài của cácintron và exon cũng rất biến động, nhng các intron thờng dài hơn và chiếm phần lớn trình tựcủa gen Trớc khi thông tin trong gen đợc sử dụng để tổng hợp phân tử protein tơng ứng, thì

các intron phải đợc cắt bỏ khỏi phân tử ARN nhờ quá trình đợc gọi là quá trình cắt bỏ (quá

trình hoàn thiện phân tử mARN) Trong quá trình đó, các exon đợc giữ lại và nối lại với nhauthành một trình tự mã hoá liên tục

Việc xác định các intron trong trình tự một gen có thể thực hiện đợc nhờ các intron điển

hình có trình tự bắt đầu là 5 -GU’ và kết thúc là AG-3’ Tuy vậy, thực tế ngoài những dấu

hiệu này, việc cắt bỏ các intron còn cần các trình tự khác ở vùng nối giữa intron và exon(xem thêm mục III.1)

Intron Exon

Hình 3 Cấu trúc của gen.

I 6 Gen giả (pseudogene)

Có một số gen giống với các gen khác nhng trình tự bazơ của chúng có những sai sótlàm cho chúng không có khả năng chứa những thông tin sinh học hữu ích Những gen đó đợcgọi là những gen giả và những sai sót hoặc đột biến trong trình tự ADN của chúng xuất hiệntrong quá trình tiến hoá làm thông tin bị lẫn lộn đến mức không còn điều khiển quá trình sinhtổng hợp protein bình thờng đợc nữa Những gen giả là dấu vết của quá trình tiến hoá Trải quatiến hoá, những sự biến đổi ban đầu các bazơ gây mất thông tin đợc lặp đi lặp lại đến mứcthậm trí trình tự bazơ của các gen giả khác hẳn với trình tự gen gốc ban đầu Ví dụ nh các genglobin giả trong các cụm gen globin

II Mã DI TRUYềN

II 1 Khung đọc

Ngoài việc quy định điểm bắt đầu quá trình tổng hợp protein, bộ ba mã khởi đầu (AUG)còn xác định khung đọc của trình tự ARN Có thể có ba bộ ba cho bất kỳ một trình tự bazơnào, phụ thuộc vào bazơ nào đợc chọn làm bazơ bắt đầu của codon Thực tế trong quá trìnhtổng hợp protein, thờng chỉ có một khung đọc đợc sử dụng Còn hai khung đọc kia thờng chứamột số bộ ba kết thúc ngăn cản chúng đợc sử dụng để tổng hợp trực tiếp nên phân tử protein(hình 4)

Khung đọc 1 5’ - AUG ACU AAG AGA UCC GG - 3’

Met Thr Lys Arg Ser Khung đọc 2 5’ - A UGA CUA AGA GAU CCG G - 3'

Stop Leu Arg Asp Pro Khung đọc 3 5’ - AU GAC UAA GAG AUC CGG - 3’

Asp Stop Glu Ile Arg

Hình 4 Mỗi trình tự ADN có thể đọc theo ba khung đọc khác nhau, phụ thuộc vào bazơ nào đợc chọn làm bazơ

khởi đầu Trên mỗi phân đoạn ADN mạch kép về lý thuyết có thể có tối đa sáu khung đọc mở (ORF) khác nhau.

Đoạn trình tự nằm giữa một bộ ba khởi đầu và một bộ ba kết thúc tơng ứng cùng khung

đọc đợc gọi là khung đọc mở (ORF = open reading frame) Đặc điểm này đợc dùng để xác

định các trình tự ADN mã hoá protein trong các dự án giải mã hệ gen

II.2 Tính vạn năng của mã di truyền

Ban đầu, ngời ta tin rằng mã di truyền là vạn năng Nghĩa là ở mọi sinh vật, các codongiống nhau đều quy định những axit amin nh nhau Tuy vậy, thực tế cho thấy có một số trờnghợp ngoại lệ Ví dụ, ở hệ gen ty thể có sự khác biệt về bộ ba khởi đầu và bộ ba kết thúc Cụthể, AUG bình thờng là bộ ba kết thúc, thì ở ty thể nó lại mã hoá cho tryptophan; AGA vàAGG bình thờng quy định arginin, ở ty thể lại có vai trò là các bộ ba kết thúc; AUA bình th-ờng mã hóa cho isoleucin thì ở ty thể lại xác định methionin Ngời ta cho rằng những thay đổinày có thể tồn tại đợc là nhờ ty thể là một hệ thống kín Ngoài hệ gen ty thể, một số tr ờng hợpngoại lệ khác cũng đợc tìm thấy ở một số sinh vật đơn bào Ví dụ ở một số động vật nguyênsinh, các bộ ba UAA và UAG bình thờng là các bộ ba kết thúc thì lại mã hoá cho axitglutamic

III sự hoàn thiện marn ở eukaryote

III.1 Cắt bỏ các intron

Quá trình này xảy ra trong nhân nhằm cắt bỏ các trình tự intron không mã hóa khỏi phân

tử tiền-mARN để hình thành nên phân tử mARN hoàn chỉnh chỉ chứa các trình tự mã hoáliên tục tơng ứng với các exon Sau đó, phân tử mARN hoàn chỉnh đợc chuyển ra tế bào chất

5’-Việc cắt bỏ các intron đợc thực hiện bởi một phức hệ gọi là spliceosom, gồm phân tử

tiền-mARN liên kết với các hạt ribonucleoprotein nhân kích thớc nhỏ snRNP (small

nuclear ribonucleoprotein particle, đợc đọc tắt là snớp) snRNP đợc tạo thành tự sự liên kết giữasnARN và protein Có 5 loại snARN phổ biến đợc kí hiệu là U1, U2, U4, U5 và U6 Mỗiloại liên kết với một số phân tử protein để hình thành nên snRNP Trừ U4 và U6 thờng tìmthấy trong cùng một snRNP, còn các loại khác tìm thấy trong các snRNP riêng biệt

Quá trình cắt intron trải qua một số bớc nh sau (hình 5 và 6):

1) U1 snRNP gắn vào vị trí cắt đầu 5’ của intron Việc gắn này dựa trên nguyên tắc bổtrợ của U1 snARN có trong snRNP với trình tự ở đoạn nối với exon ở gần đầu 5’ củaintron.

2) U2 snRNP gắn vào một trình tự gọi là điểm phân nhánh nằm ngợc dòng so với

đoạn nối với exon về phía đầu 3’ của intron Điểm phân nhánh là vị trí đặc thù củacác intron, tại đó chứa một adenyl là vị trí gắn vào của đầu 5’ tự do của intron trongquá trình cắt bỏ intron

3) Phức hệ U4/U6 snRNP tơng tác với U5 snRNP rồi gắn vào các phức hệ U1 và U2snRNP làm hai đầu 5’ và 3’ của intron tiến lại gần nhau, tạo thành cấu trúc thònglọng

4) U4 snRNP tách ra khỏi phức hệ, lúc này spliceosome chuyển thành dạng có hoạttính cắt (exonuclease)

5) snRNP cắt intron ở đầu 5’ tạo ra một đầu 5’ tự do Đầu này sẽ liên kết với nucleotit

A tại điểm phân nhánh vào vị trí nhóm 2’-OH (liên kết phosphodieste 5’-2’) Nhóm3’-OH của adênyl này vẫn liên kết bình thờng với nucleotit khác trong chuỗi

6) Intron đợc cắt ở phía đầu 5’ (intron vẫn ở dạng thòng lọng) và các exon liền kề ở hai

đầu 5’ và 3’ của intron liên kết với nhau Lúc này phức hệ snRNP rời khỏi phân tửARN Và quá trình cắt intron nh vậy đợc lặp đi lặp lại

Cắt đầu 3’ và nối các exon

Các exon đ ợc nối với nhau

Cấu trúc thòng lọng (intron)

Hình 5 Quá trình cắt bỏ intron của phân tử mARN tiền thân ở sinh vật nhân chuẩn.

Quá trình cắt intron nh trên đợc tìm thấy ở các gen đợc phiên mã nhờ ARN polymerase

II Ngoài cơ chế trên đây, một số loại phân tử ARN có thể tự cắt bỏ intron Quá trình cắt bỏintron này không phụ thuộc vào protein và đợc gọi là các intron nhóm I Cơ chế tự cắt của cácintron nhóm I đợc tìm thấy ở các gen rARN, một số gen mã hóa protein trong ti thể và một sốgen mã hóa mARN và tARN ở thực khuẩn thể

Một ví dụ về quá trình tự cắt của intron nhóm I (ở Tetrachynema) đợc mô tả nh sau:

1) Phân tử tiền-mARN đợc cắt ở vị trí nối với exon ở phía đầu 5’ và một nucleoit G gắnvào vị chí cắt này

2) Intron đợc cắt ở vị trí nối tại đầu 3’

3) Hai exon liền kề đợc nối lại với nhau

4) Phần intron đợc cắt ra đóng vòng tạo thành một phân tử ADN dạng vòng Sản phẩmtạo ra là intron ở dạng mạch vòng còn phân tử ADN chứa các exon ở dạng mạchthẳng

Quá trình tự cắt của intron nhóm I do chính ARN tự xúc tác, và các ARN có hoạt tính

nh vậy đợc gọi là ribozym Tuy vậy, hoạt tính tự xúc tác của ARN không nên coi là hoạt tính

enzym Bởi, không giống nh enzym protein, các phân tử ARN không trở về dạng ban đầu saukhi phản ứng kết thúc

Việc tìm ra ARN có hoạt tính xúc tác gần giống với protein đã làm thay đổi quan điểm

về nguồn gốc sự sống Trớc đây, ngời ta cho rằng protein là yếu tố thiết yếu để quá trình saochép các nucleotit có thể xảy ra Nhng lý thuyết mới gần đây cho rằng các axit nucleic đầutiên có khả năng tự sao chép thông qua hoạt tính kiểu ribozym

III.3 Gắn đuôi poly(A)

Đầu 3’ của phân tử tiền-mARN của hầu hết các sinh vật nhân chuẩn đợc sửa đổi bằngcách thêm vào một đoạn trình tự poly A (còn đợc gọi là đuôi polyA) có thể dài tới 250 bazơadenin Sự sửa đổi này đợc gọi là đa adenin hóa và cần có một trình tự tín hiệu trên phân tửtiền-mARN Đó là trình tự 5’-AAUAAA-3’ nằm gần đầu 3’ của phân tử tiền-mARN Khoảng

11 - 20 bazơ tiếp theo có trình tự là YA (Y = pyrimidin), rồi tiếp đến là đoạn trình tự giàu GUnằm xuôi dòng Có nhiều protein đặc hiệu có khả năng nhận biết và gắn vào đoạn trình tự tínhiệu tạo thành một phức hệ cắt mARN ở vị trí khoảng 20 nucleotit phía sau của trình tự 5’-AAUAAA-3’ Sau đó, enzym poly(A) polymerase sẽ bổ sung thêm các adenin vào đầu 3’ củamARN Mục đích tạo đuôi A còn cha rõ, nhng có thể nó có vai trò bảo vệ cho mARN không

U5

Hình 6 Sự hình thành phức hệ cắt intron (spliceosom).

bị phân hủy ở đầu 3’ bởi exonuclease Tuy nhiên, một số mARN, nh mARN mã hoá cácprotein histon, không có đuôi polyA (nhng thờng có thời gian tồn tại ngắn)

III.4 Tính bền vững của mARN

Không giống nh rARN và tARN có tính bền vững khá cao trong tế bào, các mARN cóvòng đời tơng đối ngắn Điều đó có thể do tế bào cần điều tiết mức độ tổng hợp các loạiprotein trong tế bào tùy theo yêu cầu thông qua sự thay đổi mức độ phiên mã Sự thay đổi lợngmARN đang dịch mã phản ánh sự thay đổi mức độ phiên mã ở các tế bào vi khuẩn, mARN cóthời gian bán phân hủy khoảng vài phút Trong khi, ở các tế bào nhân chuẩn, mARN có thờigian bán phân hủy có thể lên đến hơn 6 giờ Mặc dù một số mARN, nh các mARN mã hoáglobin cấu tạo nên hemoglobin, có thể tồn tại rất lâu trong tế bào

III.5 Các phân tử mARN đợc hoàn thiện theo các cách khác nhau

Một trình tự ADN phiên mã chỉ cho ra một phân tử tiền-mARN, nhng phân tử tiền-mARN

có thể đợc hoàn thiện bằng các cách khác nhau để tạo ra nhiều loại phân tử mARN hoàn chỉnhkhác nhau trớc khi đợc sử dụng làm khuôn tổng hợp protein Đó là các cơ chế cắt bỏ tiền-mARN khác nhau, trong đó tế bào sử dụng những điểm cắt khác biệt để loại bỏ hay giữ lại cácexon trong quá trình cắt bỏ Ngoài ra, việc tồn tại các tín hiệu poly(A) khác nhau trên phân tửtiền-mARN cũng có thể dẫn đến việc sinh ra các phân tử mARN có trình tự dài ngắn khác nhau

ở đầu 3’ Ví dụ, việc sử dụng điểm poly(A) nằm phía trớc điểm kết thúc đoạn trình tự mã hoá cóthể loại bỏ một số exon nằm sau nó và sinh ra mARN mã hóa cho một loại protein ngắn hơn.Một phân tử tiền-mARN có thể đợc cắt bỏ các intron theo những cách khác nhau cùnglúc hoặc ở những giai đoạn phát triển khác nhau của một tế bào, hoặc khác nhau giữa các tếbào khác nhau Các protein đợc sinh ra theo các cơ chế này thờng có quan hệ với nhau, songchúng thờng biểu hiện chức năng hoặc có đặc điểm riêng Ví dụ, quá trình hoàn thiện phân tửtiền-mARN của globulin miễn dịch dẫn đến việc tổng hợp các protein có thể chứa hoặc khôngchứa các trình tự axit amin kỵ nớc cho phép nó liên kết đợc vào màng tế bào Điều này giúptạo ra nhiều dạng globulin miễn dịch có thể liên kết với màng và các dạng để tiết ra khỏi tếbào

Các phân tử tiền-mARN cũng còn có thể trải qua quá trình sửa đổi trình tự ARN Trongquá trình đó, trình tự của phân tử tiền-mARN bị biến đổi bằng cách thêm vào, bớt đi hay thaythế các bazơ Sự sửa đổi trình tự ARN đợc xác định đầu tiên ở một số nguyên sinh động vật kýsinh ở những loài này, ngời ta thấy các bản phiên mã của nhiều gen ty thể bị sửa đổi bằngcách đợc bổ sung thêm các gốc uracil Quá trình này cũng gặp ở động vật có xơng sống, nhngmức độ sửa đổi ít hơn nhiều ở ngời, phân tử tiền-mARN của gen apolipoprotein B bị sửa đổi ở

tế bào ruột non bằng cách thay thế bazơ C bằng U để tạo nên một bộ ba kết thúc, dẫn đến việctổng hợp một phân tử protein ngắn hơn Trong khi đó ở tế bào gan, nơi trình tự ARN không bịsửa đổi, protein đó có độ dài đầy đủ

IV Về bệnh di truyền

VI.1 Các dạng bệnh di truyền

Có một nhóm đa dạng các bệnh lý và rối loạn gây ra do các đột biến gen và sự thay đổibất thờng của nhiễm sắc thể Các rối loạn có bản chất di truyền và có thể chia làm 3 nhómchính:

cháu) hoặc xuất hiện một cách tự phát (de novo) trong tế bào sinh dục (tinh trùng hoặc trứng)

trong cơ thể bố hoặc mẹ, và sau thụ tinh, đứa trẻ hình thành mang đột biến trong mọi tế bào

Các rối loạn nhiễm sắc thể

Có các dạng bệnh lý gây ra do sự mất đi hoặc thêm vào một hoặc một số nhiễm sắcthể, hay do sự thay đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể Phần lớn các rối loạn bất thờng về nhiễmsắc thể xuất hiện ngay trong các tế bào sinh dục của cơ thể bố hoặc mẹ, nhng cũng có nhữngtrờng hợp gây ra do di truyền từ thế hệ trớc Các dạng bất thờng về số lợng nhiễm sắc thể (biến

dị số lợng nhiễm sắc thể) có thể biểu hiện bằng sự tăng lên số lợng bộ nhiễm sắc thể đơn bội

(hiện tợng đa bội thể), hoặc do sự thêm và hoặc mất đi của từng nhiễm sắc thể riêng lẻ (hiện

tợng lệch bội) Các dạng bất thờng về cấu trúc nhiễm sắc thể có thể gây ra do sự đứt gẫy

nhiễm sắc thể liên quan đến các hiện tợng mất đoạn, lặp đoạn hoặc đảo đoạn nhiễm sắc thể

Các rối loạn đa nhân tố

Đây là một nhóm gồm nhiều bệnh phổ biến, ví dụ nh đái tháo đờng, các bệnh mạchvành và phần lớn các dị tất bẩm sinh Các bệnh này gây ra do ảnh hởng của nhiều gen theo cáccơ chế bệnh lý phức tạp cho đến nay cha đợc hiểu biết đầy đủ, nhng đợc biết có liên quan đến

sự tơng tác của nhiều gen với nhau, hoặc giữa các gen với các yếu tố môi trờng

Trong khoảng 20 năm qua, nhờ sự phát triển của công nghệ ADN tái tổ hợp, đã cónhiều phát hiện mới mang tính bớc ngoặt liên quan đến các bệnh lý do rối loạn đơn gen gây

ra Thông tin đợc nêu trong phần dới đây liên quan đến một số rối loạn bệnh lý nh vậy

VI.2 Hình thức di truyền

Các rối loạn di truyền đơn gen đợc truyền từ thế hệ bố, mẹ sang thế hệ con, cháu Có ba

hình thức di truyền phổ biến: di truyền trội trên nhiễm sắc thể thờng, di truyền lặn trên

nhiễm sắc thể thờng và di truyền liên kết nhiễm sắc thể X (Bảng 1)

Trong trờng hợp bệnh di truyền do alen trội nằm trên nhiễm sắc thể thờng quy định, việc

truyền một alen gây bệnh từ bố hoặc mẹ sang con là đủ để cá thể con biểu hiện bệnh Các cá thể

bị bệnh có một alen bình thờng và một alen đột biến gây bệnh đợc gọi là các thể dị hợp tử Các

cá thể này có nguy cơ truyền cho 50 % số con alen đột biến và biểu hiện bệnh (hình 7a)

Trong trờng hợp bệnh di truyền do alen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thờng quy định, cá

thể biểu hiện bệnh phải mang đủ một cặp alen đột biến gây bệnh, một bắt nguồn từ bố, một từ

mẹ Cá thể biểu hiện bệnh trong trờng hợp này gọi là cá thể đồng hợp từ về alen đột biến Các

cá thể dị hợp tử với một alen gây bệnh không biểu hiện bệnh nhng có khả năng truyền alengây bệnh sang 50% số cá thể con Đối cả bố và mẹ là các cá thể dị hợp tử mang alen lặn gâybệnh trên nhiễm sắc thể thờng, một phần t số con biểu hiện bệnh, một phần t bình thờng vàmột nửa số cá thể con là thể mang alen gây bệnh nhng không biểu hiện bệnh (hình 7b)

Trong trờng hợp bệnh di truyền liên kết với nhiễm sắc thể X, gen đột biến gây bệnh chỉ

xuất hiện trên nhiễm sắc thể X Do con đực chỉ có một nhiễm sắc thể X duy nhất, việc truyềnalen đột biến sang cá thể con giới đực là đủ để cá thể này biểu hiện bệnh Các cá thể đực biểuhiện bệnh gọi là các cá thể dị giao tử Các con cái có hai nhiễm sắc thể X vì vậy th ờng khôngbiểu hiện bệnh do phần lớn các gen đột biến gây bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X là các alenlặn Đối với các con cái là cá thể mang gen gây bệnh nhng không biểu hiện bệnh, 50% con

đực thế hệ con có nguy cơ bị bệnh và 50% con cái là thể mang gen gây bệnh nhng không biểuhiện bệnh (hình 7c)

Hình 7 (a) Alen trội trên NST thờng Sự di truyền của một alen đột biến duy nhất (a) đều dẫn đến sự biểu hiện của bệnh (b) Alen lặn trên NST thờng Các cá thể bị bệnh phải mang hai alen đột biến (aa) Các cá thể dị hợp tử (Aa) là các thể mang (c) Alen liên kết NST X, đối với các thể mang là cái, 50% số cá thể con giới đực bị bệnh, và

50% số cá thể con giới cái là thể mang.

(c)

hydroxylase Không có khả năng chuyển hóa phenylalanin

các triệu chứng khác

Để có sự cân bằng giữa con đực và con cái về lợng sản phẩm do gen nằm trên nhiễm sắcthể X mã hóa, trong tự nhiên có hiện tợng một trong hai nhiễm sắc thể X trong tế bào con cái

bị bất hoạt Quá trình này đợc gọi là hiện tợng Lyon hóa (giả thiết Lyon) và thờng diễn ra

trong quá trình phát triển của phôi Trong mỗi tế bào, nhiễm sắc thể X bị bất hoạt đợc “chọn”một cách ngẫu nhiên Tuy vậy, một số con cái là thể mang gen gây bệnh nằm trên nhiễm sắcthể X có thể biểu hiện bệnh ở mức độ nhẹ do sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X bình thờng

VI.3 Sai hỏng đơn gen

Có nhiều bệnh di truyền do gen đơn quy định xuất hiện ở ngời (Bảng 7) Các bệnh này

có các đặc điểm biểu hiện đa dạng khác nhau và hậu quả đối với các cá thể bị bệnh cũng khácnhau tùy thuộc vào mức độ quan trọng của gen bị đột biến và bản chất của loại đột biến xuấthiện Một số bệnh, nh bệnh máu khó đông, gây nên các triệu chứng bệnh có thể điều trị đợc,nhng các bệnh khác chẳng hạn nh hội chứng múa giật Huntington, đến nay cha có biện pháp

điều trị triệt để và ngời bệnh thờng chết khi còn trẻ

Các bệnh di truyền do đơn gen quy định thờng xuất hiện với tần số tơng đối thấp nằmtrong khoảng giữa 0,01 đến 5,0 trờng hợp trong 1000 em bé sơ sinh Tần số các rối loạn ditruyền này thờng khác nhau trong các chủng tộc ngời khác nhau Chẳng hạn, tần số bệnh nhân

bị xơ nang là cao nhất ở các nớc Bắc Âu, bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm xảy ra với tần sốcao nhất ở Châu Phi và bệnh -thalassemia phổ biến hơn cả trong các quần thể Châu á Đốivới các bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất ở ngời đến nay đã xác định và tách dòng đợc gengây bệnh đồng thời xác định đợc các đột biến gây bệnh

VI.4 Các đột biến trong sai hỏng đơn gen

Có thể chia các loại đột biến tạo ra các alen gây bệnh thành hai loại chính: các đột biến

điểm liên quan đến sự thay đổi của một bazơ nitơ duy nhất và các đột biến lớn liên quan đến

sự thay đổi trình tự ADN với kích thớc lớn hơn Đối với mỗi loại bệnh, có thể có vài dạng độtbiến khác nhau Ngoài ra, các cá thể bị bệnh cũng có thể cùng lúc mang các gen đột biến khácnhau Ví dụ, có khoảng 20% trờng hợp bị bệnh máu khó động dạng A do kết quả của đột biếnlớn gây ra Các trờng hợp còn lại là do các dạng đột biến điểm mà đến nay các nhà nghiên cứu

đã tìm ra và mô tả 250 kiểu đột biến khác nhau

Các đột biến điểm

Các đột biến điểm gây nên các bệnh di truyền có thể chia thành một số kiểu sau:

(1) Các đột biến sai nghĩa (misense mutations) Đây là những thay đổi của các nucleotit

trên phân tử ADN gây nên sự thay đổi bộ ba mã hóa cho một axit amin dẫn đến sự thay thế bởimột loại axit amin khác trên phân tử protein Các đột biến sai nghĩa gây nên những hậu quảkhác nhau đối với phân tử protein đợc mã hóa Do hiện tợng thoái hóa của mã di truyền,những thay đổi liên quan đến vị trí bazơ thứ ba trong bộ ba mã hóa thờng không có ảnh hởng

đến phân tử protein Ngoài ra, nhiều sự thay đổi thành phần bazơ nitơ dẫn đến sự thay thế củaaxit amin có đặc tính tơng tự có thể không làm thay đổi chức năng và hoạt tính của phân tửprotein Chẳng hạn nh đột biến ở bộ ba mã hóa CTT thành ATT làm thay thế axit amin kị nớc

là leucin bằng isoleucin cũng là một axit amin kị nớc khác Tuy vậy, có nhiều ví dụ cho thấycác đột biến sai nghĩa làm thay đổi rõ rệt chức năng của phân tử protein đợc mã hóa và vì vậygây nên các bệnh di truyền Trong số này có thể kể đến đột biến thay thế A bằng T trong genmã hóa -globin, một trong các chuỗi polypeptit hình thành nên phân tử hemoglobin Đột biếnnày làm thay đổi bộ ba số sáu của gen thay đổi từ GAG mã hóa cho axit glutamic thành GTGmã hóa cho valin Đột biến này gây nên bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm do các tế bàohồng cầu bị biến dạng thành hình liềm do thay đổi sự kết dính của các phân tử hemoglobin.Các tế bào hồng cầu hình liềm có tuổi thọ ngắn gây nên hiện tợng thiếu máu và nằm trong cácmao mạch làm giảm khả năng cung cấp máu tới các cơ quan (chứng thiếu máu cục bộ)

(2) Các đột biến vô nghĩa Đây là những thay đổi của các nucleotit trên phân tử ADN làm

chuyển một mã bộ ba mã hóa axit amin thành một mã bộ ba kết thúc vì vậy quá trình phiênmã sẽ kết thúc sớm hơn bình thờng và dẫn đến sự hình thành phân tử protein có kích thớc ngắnhơn Các đột biến vô nghĩa thờng gây hậu quả nghiêm trọng đối với phân tử protein đợc mãhóa, đặc biệt khi nó xuất hiện gần đầu 5’ của gen Nhiều bệnh di truyền khác nhau đã đợc xác

định có liên quan đến các đột biến vô nghĩa Ví dụ nh đột biến C thành T ở bộ ba số 39 tronggen mã hóa -globin làm thay đổi mã bộ ba bình thờng CAG quy định glutamin thành TAG làmột bộ ba mã kết thúc Đột biến này gây nên sự kết thúc phiên mã sớm của phân tử mARNmã hóa cho -globin dẫn đến sự thiếu hụt một chuỗi polypeptit  và gây nên dạng bệnh lý gọi

là -thalassemia với triệu chứng bệnh thiếu máu do phân tử hemoglobin bình thờng không đợctạo thành

(3) Các đột biến dịch khung Những đột biến này xảy ra do sự thêm vào hay mất đi của một

hay một số bazơ nitơ làm thay đổi khung đọc và một tập hợp các bộ ba mã hóa mới đợc hìnhthành kể từ điểm đột biến xảy ra Đột biến dịch khung cũng thờng gây nên hậu quả nghiêmtrọng đối với phân tử protein đợc mã hóa, đặc biệt khi đột biến xuất hiện gần đầu 5’ của gen.Nhiều bệnh lý đợc mô tả liên quan đến đột biến dịch khung Chẳng hạn đột biến dịch khung

đã đợc tìm thấy là nguyên nhân gây nên bệnh máu khó đông ở nhiều bệnh nhân mắc căn bệnhnày Trong đó bao gồm các trờng hợp do mất đi 4 bazơ nitơ gây nên sự thay đổi khung đọc từ

bộ ba mã hóa thứ 50 và một đột biến thêm 10 bazơ làm thay đổi khung đọc từ bộ ba mã hóathứ 38 Cả hai kiểu đột biến này đều gây triệu chứng bệnh nghiêm trọng

(4) Đột biến vị trí cắt intron Đây là những đột biến làm thay đổi trình tự tín hiệu ở gần đầu

3’ hoặc 5’ của các đoạn intron dẫn đến việc cắt intron sai trong quá trình hoàn thiện phân tửmARN ở sinh vật nhân chuẩn Các đột biến kiểu này cũng có thể xảy ra bên trong intron tạonên điểm cắt intron mới và vì vậy cũng dẫn đến sự cắt sai trình tự intron Một loạt các đột biến

vị trí cắt intron đợc tìm thấy liên quan đến đột biến gen -globin làm thiếu hoàn toàn cácchuỗi -globin trong các cơ thể đồng hợp tử và gây bệnh -thalassemia

(5) Đột biến trình tự gen điều hòa Các đột biến này xảy ra tơng đối hiếm và ảnh hởng đến

việc điều hòa hoạt động của gen, thờng hoặc làm giảm hoặc làm tăng mức độ biểu hiện củagen Một đột biến nh vậy đã đợc xác định trong trình tự chỉ huy của gen mã hóa protein đôngmáu (là protein yếu tố IX) cũng là một nguyên nhân gây nên bệnh máu khó đông Các cá thểmang đột biến này không tạo đợc protein yếu tố IX và bị chảy máu một cách bất thờng Thôngthờng, triệu chứng bệnh thờng mất đi sau tuổi dậy thì nhờ hócmôn steroid kích thích sự biểuhiện của gen này

Các đột biến lớn

Có nhiều bệnh lý gây ra do các đột biến liên quan đến một trình tự dài các nucleotittrên phân tử ADN Phần lớn các đột biến này có ảnh hởng nghiêm trọng đến chức năng củagen và gây bệnh nặng

(1) Các đột biến mất đoạn Sự mất đi của gen có thể biểu hiển với mức độ kích thớc khác

nhau, từ một vài bazơ nitơ đến toàn bộ gen, thậm trí nhiều gen cùng lúc Sự mất đi hoàn toàncủa các gen mã hóa -globin gây nên bệnh -thalassemia (bệnh mất khả năng sản xuấthemoglobin bình thờng) Ví dụ nh, sự mất một phần gen mã hóa dystrophin gây nên bệnh mòncơ, bệnh loạn dỡng cơ; hay sự mất đi một bộ ba mã hóa duy nhất trong gen tổng hợp protein

điều hòa độ dẫn xuyên màng trong bệnh xơ nang CFTR (cystic fibrosis transmembraneconductance regulator) là nguyên nhân gây bệnh gặp phải ở 70% số bệnh nhân bị bệnh xơnang

(2) Các đột biến thêm đoạn Nhiều đột biến thêm đoạn đã đợc ghi nhận Ví dụ nh một trờng

hợp một bệnh nhân bị máu khó đông dạng A hiếm gặp có nguyên nhân gây bệnh là do sựthêm vào gen mã hóa yếu tố VIII một trình tự lặp lại gọi là yếu tố LINE

(3) Các đột biến thay thế đoạn gen Cũng có nhiều đột biến thay thế đoạn gen gây nên bệnh

di truyền đã đợc ghi nhận Ví dụ nh một đột biến gây bệnh máu khó đông dạng A xảy ra do sựtái tổ hợp giữa các trình tự nằm trong vùng intron thứ 22 của gen mã hóa yếu tố VIII và cáctrình tự lặp lại kép dọc theo nhiễm sắc thể X Do một lỗi xảy ra trong quá trình tái tổ hợp, genmã hóa yếu tố VIII bị cắt thành 2 mảnh tách biệt nhau bởi hàng triệu cặp bazơ nitơ, làm mấthoàn toàn chức năng của gen này

(4) Các đột biến lặp lại bộ ba nucleotit Một dạng đột biến gen hiếm gặp liên quan đến các

trình tự lặp lại từng bộ ba nucleotit kém bền vững Trong quá trình giảm phân xảy ra hiện tợng

số lợng bản sao các trình tự lặp lại từng bộ ba nucleotit tăng lên trong các tế bào sinh dục dẫn

đến sự biểu hiện của bệnh trong các thế hệ sau Cơ chế dẫn đến hiện tợng lặp lại nhiều lần củacác trình tự nucleotit và nguyên lý gây bệnh cho đến nay cha đợc biệt rõ Sự tăng lên số lợngcác trình tự lặp lại tìm thấy liên quan đến một số bệnh di truyền bao gồm bệnh múa giậtHungtington

VI.5 Về một số bệnh di truyền

1) Trao đổi chéo trong nguyên phân có thể tạo ra thể khảm về di truyền và một số bệnh ung th ở ngời

Trao đổi chéo là một đặc tính quan trọng của quá trình giảm phân Phức hệ trao đổi chéo

“xác định” vị trí tái tổ hợp đồng thời giữ cho các NST tơng đồng gắn kết với nhau, cho phépchúng thành từng cặp tiến về mặt phẳng xích đạo tại kỳ giữa của giảm phân I, rồi sau đó phân

ly về hai cực đối diện của tế bào Ngoài ra, TĐC trong giảm phân là một cơ chế góp phần làmtăng tính đa dạng của các dạng của các loại giao tử Vì vậy, không có gì là ngạc nhiên khi cáccơ thể sinh vật nhân chuẩn biểu hiện một sự đa dạng lớn về các loại enzym tham gia khởi đầu

đặc hiệu sự TĐC trong giảm phân TĐC cũng có thể xuất hiện trong nguyên phân Tuy vậy,không giống sự kiện diễn ra trong giảm phân, TĐC trong nguyên phân thờng xảy ra do lỗixuất hiện trong quá trình tái bản NST hoặc do bị chiếu xạ dẫn đến sự đứt gãy của các phân tửADN, chứ không phải là một chơng trình đợc điều hòa bình thờng của tế bào nh trong giảmphân Vì vậy, TĐC trong nguyên phân là một sự kiện hiếm khi xảy ra, chỉ xuất hiện với tần sốthấp hơn 10-6 lần phân bào nguyên nhiễm Tuy vậy, việc nuôi cấy các tế bào nấm men và quátrình phát triển của một cơ thể đa bào phức tạp có số lần phân chia tế bào đủ lớn để các nhà ditruyền học có thể hàng ngày phát hiện và theo dõi đợc hiện tợng TĐC trong nguyên phân vốnxảy ra với tần số thấp này Khác với trong giảm phân, TĐC xảy ra trong nguyên phân xảy rangẫu nhiên ở một số ít các tế bào soma, tạo nên những tế bào soma mang “hệ gen” khác nhau

Do vậy, những cá thể mang những tế bào soma chứa các NST bị TĐC đợc gọi là các thể khảm

ở ngời, một số TĐC xảy ra trong nguyên phân có thể gây nên sự hình thành khối u (vídụ: một số bệnh u mắt) ở một số quần thể ngời, số trẻ sơ sinh có bẩm chất di truyền có nguy

cơ bị ung th có tần số vào khoảng 1/20.000 trẻ sơ sinh Gen gây khối u võng mạc (RB) nằm trên NST số 13, trong khi alen kiểu dại bình thờng (RB +) mã hóa cho một loại protein điều hòa

sự phát triển và biệt hóa của võng mạc Các tế bào trong mắt cần ít nhất một bản sao của alen

kiểu dại để duy trì sự điều hòa hoạt động phân chia của tế bào Một đột biến trong alen RB + có

thể dẫn đến làm hỏng chức năng của alen kiểu dại và đợc ký hiệu là RB - Nừu một tế bào mất

đi cả hai bản sao của RB +, thì nó mất đi khả năng điều hòa hoạt động phân chia tế bào bình

th-ờng và gây nên sự hình thành khối u Ví lý do này, alen kiểu dại RB + có đợc xem là một gen

ức chế sự hình thành khối u

Những cá thể có bẩm chất di truyền có nguy cơ ung th võng mạc đợc sinh ra mang một

alen RB + duy nhất NST số 13 thứ hai của họ hoặc chỉ mang alen RB - hoặc hoàn toàn không có

gen RB Nếu một tác nhân đột biến (ví dụ: chiếu xạ) hay một lỗi xảy ra trong quá trình nguyên phân làm mất đi alen RB + còn lại duy nhất ở một tế bào trong một hoặc hai mắt thì khối uvõng mạc sẽ bắt đầu phát triển từ vị trí tế bào sai hỏng Một nghiên cứu ở các bệnh nhân bị

bệnh u võng mạc cho thấy sự xuất hiện của các tế bào mắt với kiểu gen đồng hợp tử RB - /RB -,

trong khi tế bào bạch cầu của ngời bệnh là dạng dị hợp tử RB + /RB - Nh minh họa ở hình A,

một TĐC trong nguyên phân giữa gen RB và tâm động của nhiễm sắc thể mang gen là cơ chế gây nên sự hình thành tế bào mang kiểu gen RB - /RB - Khi tế bào này hình thành, nó đợc phânchia một cách không đợc kiểm soát và dẫn đến sự hình thành khối u

Chỉ có 40% trờng hợp bị bệnh ung th võng mạc là có cơ chế gây bệnh nh trên, còn 60%

còn lại khi sinh ra có kiểu gen bình thờng là RB + /RB + ở những ngời này, hai đột biến phảicùng xảy ra ở cả hai bản sao của gen RB mới gây nên ung th Đột biến đầu tiến có thể dẫn đến

alen RB + bị chuyển thành RB -, còn sau đó các tế bào con xảy ra TĐC trong quá trình nguyênphân và dẫn đến sự phát triển ung th do alen đột biến bị “đồng hợp tử” hóa

Đáng chú ý là TĐC trong nguyên phân gây nên sự hình thành một số bệnh ung th võngmạc đã giúp giải thích sự biểu hiện mức độ bệnh lý khác nhau Những trẻ sơ sinh có kiểu gen

RB + /RB - có thể không bị bệnh Hoặc khi mắc bệnh, sự phát triển của khối u có thể xảy ra ở cảhai mắt, nhng cũng có thể chỉ xảy ra ở một mắt Tất cả những hiện tợng đó phụ thuộc vào việc

tế bào nào trong cơ thể xảy ra hiện tợng TĐC trong nguyên phân

2) Đột biến gen mã hóa các protein cảm thụ ánh sáng và thị lực

Những nghiên cứu đầu tiên mô tả sự bất thờng trong khả năng cảm thụ ánh sáng ở ngời

đợc bắt đầu từ khoảng 200 năm trớc Thời đó, ngời ta phát hiện ra nhiều đột biến có thể gây

ảnh hởng đến thị lực ở ngời Bằng việc phân tích các kiểu hình liên quan đến mỗi loại đột biến

và sau đó kiểm tra sự biến đổi của ADN Ngày nay, chúng ta đã có những hiểu biết chi tiếthơn về cơ chế di truyền phân tử của tính trạng cảm nhận ánh sáng, màu sắc và các loại protein

mà những gen này mã hóa

Có một số dạng bệnh rối loạn cảm nhận màu sắc khác nhau ở ngời đã giúp việc phântích và làm sáng tỏ cơ chế cảm nhận màu sắc ở ngời Đầu tiên, các nhà nghiên cứu nhận biết

và mô tả sự khác biệt trong cách những ngời có rối loạn về cảm nhận màu sắc nhìn thấy sự vật

từ sự khác biệt nhỏ khi nhìn thấy mức độ màu đỏ, tới việc không phân biệt đợc màu đỏ và màuxanh lục, đến việc không nhìn thấy bất cứ màu nào Thứ hai, sự phát triển khoa học tâm- sinh

lý học cung cấp các phép thử để xác định và so sánh chính xác các kiểu hình Chẳng hạn, một

phép phân tích dựa trên sự kiện là mọi ngời có thể cảm nhận mỗi một màu nh sự hòa trộn của

ba dải bớc sóng cơ bản tơng ứng với màu đỏ, xanh dơng (xanh lam) và xanh lục và có thể điềuchỉnh tỉ lệ cờng độ sáng của ba màu này để thu đợc một dải bớc sóng tơng ứng với một màuthứ t, chẳng hạn màu vàng Một ngời với thị lực bình thờng, sẽ chọn một tỉ lệ màu thích hợpcủa màu đỏ và màu xanh lục để tạo nên màu vàng đặc thù, nhng nếu một ngời không có khảnăng phân biệt màu đỏ với màu xanh lục thì mọi sự kết hợp giữa hai màu này sẽ chỉ cho ramột màu giống nhau Cuối cùng, do những biến dị di truyền liên quan đến thị giác hiếm khigây ảnh hởng đến hoạt động sinh sản hay tuổi thọ trong các xã hội ngời hiện đại, những độtbiến này có thể tạo ra nhiều alen mới làm thay đổi khả năng cảm nhận màu sắc và những alen

đột biến này đợc duy trì lâu dài trong quần thể

a) Cơ sở phân tử và tế bào của sự cảm nhận màu sắc ở mắt

l-ánh sáng yếu trong các bớc sóng

ánh sáng ở cờng độ sáng lớnhơn, các tế bào hình que bị bãohòa và không còn chức năng gửicác tín hiệu thêm nữa đến não

bộ Lúc này, các tế bào hình nón

sẽ tiếp quản chức năng này, xử

lý các bớc sóng ánh sáng của ờng độ sáng mạnh và giúpchúng ta có thể phân biệt đợccác màu sắc Các tế bào hìnhnón có ba loại Loại thứ nhấtchuyên hóa để cảm nhận ánhsáng đỏ, loại thứ hai cảm nhận

c-ánh sáng xanh lục và loại thứ bacảm nhận ánh sáng xanh dơng

Đối với mỗi tế bào thụ quan ánhsáng nh vậy, hoạt động cảmnhận ánh sáng bao gồm sự hấpthụ các photon từ ảnh sáng ởmột dải bớc sóng nhất định,chuyển các thông tin về số lợng

và năng lợng của các photonthành các tín hiệu điện, vàchuyển các tín hiệu đó qua tếbào thần kinh thị giác tới bộnão

Bốn gen mã hóa bốn chuỗi polypeptit cảm nhận màu sắc

Các protein cảm nhận photon vàkhởi đầu quá trình truyền tínhiệu trong các tế bào hình nón

là rhodopsin Protein này là mộtchuỗi polypeptit duy nhất gồm

348 axit amin xếp thành mộtchuỗi zigzag xuyên màng tế bào(hình 8.b.1) Một axit aminlysine nằm trong chuỗi liên kếtvới một phân tử carotenoid sắc

tố trên võng mạc có khả nănghấp thụ photon Các axit amin ởgần vùng liên kết võng mạc cấutrúc nên vị trí hoạt động củarhodopsin Bằng việc thay đổi vịtrí võng mạc qua một cơ chế đặcbiệt, các rhodopsin xác định sự

Hình nón

Võng mạc Rhodopsin

a)

b) 1- Protein Rhodopsin 2- Protein cảm nhận màu xanh d ơng

4-Protein cảm nhận màu đỏ 3-Protein cảm nhận màu lục

Các gen mã hóa protein cảm nhận

Rhodopsin Xanh d

ơng

Hình 8 Cơ sở phân tử và tế bào của sự cảm nhận màu sắc

(a) các tế bào hình nón và hình que ở võng mạc chứa hàng triệu

protein thụ thể cảm nhận ánh sáng liên kết trên màng tế bào (b)

các thụ thể cảm nhận ánh sáng ở các tế bào hình que là

rhodopsin Các protein thụ thể cảm nhận màu đỏ, xanh d ơng và

lục có ở các tế bào hình nón giống với rhodopsin ở phần lớn trình

tự, nh ng vẫn đủ khác biệt dẫn đến khả năng thụ cảm màu sắc

khác nhau (c) các gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ (1) và

lục (2) nằm thành chuỗi trên NST X Ng ời bình th ờng có 1 bản sao

gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ và từ 1 đến 3 bản sao của

gen mã hóa protein cảm nhận màu lục (d) sự tiến hóa của các

Lục

Đỏ

bào võng mạc Mỗi một tế bào hình que thờng chứa khoảng 100 triệu phân tử rhodopsin trênlớp màng đặc thù của nó Gen mã hóa tổng hợp rhodopsin ở ngời nằm trên NST số 3.

Protein có vai trò cảm nhận và khởi đầu quá trình truyền tín hiệu trong các tế bào hình nón đốivới photon màu xanh dơng có liên quan đến rhodopsin Protein này cũng là một chuỗipolypeptit duy nhất gồm 348 axit amin và bao quanh một phân tử sắc tố của võng mạc Gần50% trên phân tử protein cảm nhận ánh sáng xanh dơng là giống hệt trình tự của rhodopsin;phần còn lại có sự khác biệt giữa hai protein này và là phần đặc thù cho sự cảm nhận ánh sángmàu xanh dơng (hình 8.b.2) Gen mã hóa protein cảm nhận ánh sáng xanh dơng nằm trên NST

số 7

Cũng có quan hệ với protein rhodopsin là các protein cảm nhận ánh sáng màu đỏ vàxanh lục nằm trong các tế bào hình nón màu đỏ và xanh lục Hai protein này cũng chỉ gồmmột chuỗi polypeptit duy nhất, gồm 364 axit amin, cũng liên kết với võng mạc và nằm xuyênqua màng tế bào (các hình 8.b.3 và 4) Cũng giống nh protein cảm nhận màu xanh dơng, cácprotein cảm nhận màu đỏ và xanh lục có khoảng gần 50% trình tự axit amin giống vớirhodopsin; các protein này chỉ khác biệt nhau trung bình 4 / 100 axit amin Mặc dù chỉ khácbiệt nhau nhỏ nh vậy, những protein này đủ để để biệt hóa hai loại tế bào hình nón mẫn cảmvới các photon ánh sáng thuộc bớc sóng khác nhau, là các tế bào hình nón màu đỏ và xanhlục Cả hai gen mã hóa cho các protein màu đỏ và xanh lục đều nằm trên NST X thành mộtchuỗi kế tiếp nhau Phần lớn mỗi NST X trong tế bào ở ngời mang một gen duy nhất mã hóaprotein cảm nhận ánh sáng đỏ, còn có từ một đến ba bản sao gen mã hóa protein cảm nhận

ánh sáng xanh lục

Họ gen rhodopsin hình thành do hiện tợng lặp đoạn và phân ly

Sự giống nhau về cấu trúc và chức năng giữa bốn loại protein rhodopsin cho thấy cácgen mã hóa các chuỗi polypeptit này xuất hiện do hiện tợng lặp đoạn của một gen thụ thể cảmnhận ánh sáng tiền thân, rồi sau đó phân ly do sự tích lũy của nhiều đột biến Các đột biếnthúc đẩy khả năng cảm nhận màu sắc đã đợc u tiên chọn lọc qua quá trình tiến hóa hàng triệunăm Các protein cảm nhận ánh sáng đỏ và xanh lục giống nhau hơn cả, và chỉ khác nhaukhoảng 15 axit amin Điều này cho thấy hai gen này chỉ phân ly trong thời gian gần đây Sựkhác biệt của hai protein này so với protein cảm nhận màu xanh dơng và rhodopsin cho thấycác protein này phân ly sớm hơn trong quá trình tiến hóa từ gen mã hóa thụ thể cảm nhận ánhsáng tiền thân (hình 8.d)

b) Các đột biến ở họ gen rhodopsin gây ảnh hởng đến thị lực và khả năng cảm nhận màu sắc

Nhiều đột biến thay thế axit amin ở gen rhodopsin gây nên bệnh mù một phần hay mù hoàn toàn

Ngời ta đã phát hiện đợc ít nhất 29 loại đột biến axit amin duy nhất trong gen mã hóarhodopsin gây nên một nhóm bệnh di truyền trội nằm trên NST thờng đợc gọi chung là các

bệnh loạn sắc tố võng mạc (retinitis pigmentosa) với những triệu chứng đầu tiên là sự mất

chức năng của các tế bào hình que, rồi dẫn đến sự thoái hóa dần dần của các tế bào võng mạcngoại vi Những đột biến này thờng gây nên sự hình thành protein rhodopsin không đợc gấpnếp theo đúng cấu trúc không gian thông thờng, hoặc trở nên kém bền vững Do proteinrhodopsin bình thờng là thành phần cấu trúc quan trọng của màng tế bào hình que, nhữngprotein đột biến mất chức năng này đợc duy trì trong tế bào những không đợc gắn vào màng tếbào nh bình thờng Các tế bào hình que không có đủ rhodopsin ở trên màng thờng bị chết sau

đó Tùy thuộc vào số tế bào hình que bị chết, mà ngời bệnh có thể bị mù hoàn toàn hay mùmột phần

Các đột biến khác ở gen mã hóa rhodopsin gây nên một dạng bệnh lý ít nghiêm trọnghơn là bệnh mù ban đêm Các đột biến có mức độ đa hình cao này làm thay đổi trình tự củacác axit amin trong phân tử protein theo hớng làm tăng ngỡng ánh sáng kích thích cần thiết đểkhởi đầu chuỗi truyền tín hiệu cảm nhận ánh sáng Với những thay đổi này, khi cờng độ ánhsáng yếu, mắt không cảm nhận đợc màu sắc

Các đột biến trong gen mã hóa các sắc tố của tế bào hình nón làm thay đổi thị lực theo một số cách có thể phỏng đoán đợc

Các rối loạn thị lực gây ra bởi các đột biến liên quan đến các gen sắc tố thuộc tế bàohình nón ít nghiêm trọng hơn so với các rối loạn thị lực gây ra bởi các đột biến tơng tự xảy ravới các gen rhodopsin trong các tế bào hình que Nguyên nhân chủ yếu có lẽ bởi vì các tế bàohình que chiếm đến 95% số nơron thần kinh cảm nhận màu sắc ở ngời, trong khi các tế bàohình nón chỉ chiếm 5% Một số đột biến liên quan đến gen mã hóa protein cảm nhận màuxanh dơng nằm trên NST số 7 gây nên hội chứng rối loạn thị lực sắc tố xanh (tritanopia) Các

đột biến ở gen mã hóa protein cảm nhận sắc tố đỏ trên NST X có thể làm mất chức năng cảmnhận màu đỏ của các tế bào hình nón và gây bệnh mù màu đỏ Với một số đột biến nhỏ khácliên quan đến gen quy định protein cảm nhận màu đỏ có thể gây nên bệnh mù màu đỏ mộtphần hoặc hoàn toàn tùy vào vị trị đột biến

Trao đổi chéo không cân bằng giữa các gen mã hóa protein xanh lục và đỏ gây nên phần lớn các biến dị về tính trạng cảm nhận màu sắc

Một ngời có thị lực bình thờng thông thờng có một gen mã hóa protein cảm nhận màu

đỏ Một số trong những ngời bình thờng này có một gen xanh lục nằm gần kề, còn một số

ng-ời khác có số gen xanh lục dao động từ hai đến năm bản sao Các gen đỏ và xanh lục giốngnhau đến 96% về trình tự ADN Các gen màu xanh lục khác nhau giống nhau đến 99,9% Do

sự giống nhau và nằm gần nhau của những gen này nên hiện tợng trao đổi chéo không tơng

đồng dễ xảy ra với những gen này Hàng loạt các dạng TĐC khác nhau ở vùng gen này có thểtạo ra các kiểu hình đột biến thiếu vắng hoàn toàn gen màu đỏ, hoặc gen màu xanh lục, có sự

tổ hợp khác nhau của các gen màu xanh lục, mang gen lai xanh lục - đỏ Do khả năng cảmnhận màu đỏ và xanh lục phụ thuộc vào tỉ lệ ánh sáng đỏ và xanh lục đợc phản chiếu từ hình

ảnh, những ngời thiếu các gen đỏ và xanh lục sẽ cảm nhận màu đỏ và xanh lục là một màugiống nhau

Một số đột biến có thể làm mất hoàn toàn khả năng nhìn màu đỏ và xanh lục

Đến nay, các nhà di truyền học đã tìm thấy bảy loại đột biến mất đoạn gây bệnh mùmàu đỏ và xanh lục liên kết với NST giới tính X Bệnh lý này đợc gọi là hội chứng tế bào hình

nón đơn sắc xanh dơng (blue cone monochromacy), bởi những ngời này chỉ cảm nhận đợc

màu liên quan đến màu xanh dơng Nghiên cứu phân tử cho thấy cả bảy đột biến mất đoạn này

đều liên quan đến một đoạn trình tự gồm 600 bp nằm ngoài vùng mã hóa của các gen đỏ vàxanh lục Điều này cho thấy khả năng trình tự này là một đoạn trình tự (gen) điều hòa dài cầnthiết cho sự biểu hiện của chuỗi các gen đỏ và xanh lục

Tóm lại, chúng ta nhìn đợc và cảm nhận đợc các màu sắc đa dạng, phong phú của vạnvật một phần là nhờ bốn gen trực tiếp tạo ra bốn loại phân tử protein trong các tế bào hình que

và hình nón ở võng mạc mắt Các đột biến làm thay đổi những chuỗi polypeptit này hoặc số ợng của chúng đều có thể làm thay đổi hoặc làm hỏng thị lực hoặc khả năng cảm nhận màusắc của mắt

l-V Phân tích gen và sản phẩm của gen

V.1 Các kỹ thuật phân tích axit nucleic

V.1.1 Điện di phân tích ADN và ARN

Có nhiều phơng pháp khác nhau có thể đợc sử dụng để phân tích ADN và ARN, nhng

cho đến nay điện di trên gel là phơng pháp đợc sử dụng phổ biến hơn cả nhờ u điểm nhanh và

tơng đối đơn giản Nguyên tắc của phơng pháp là do: dới tác động của điện trờng, các phân tửADN (thờng tích điện âm) khác nhau về kích thớc, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân

tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sangcực dơng (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau Vì vậy, chúng dần dần tách nhau ra trên tr-ờng điện di, qua đó ngời ta có thể thu thập và phân tích đợc từng phân đoạn ADN hoặc genriêng rẽ Trên điện trờng các phân đoạn ADN có kích thớc càng nhỏ càng có tốc độ di chuyểntrên điện trờng nhanh hơn Sau khi điện di kết thúc, các phân tử ADN có thể quan sát thấy nhờ

sử dụng các thuốc nhuộm phát huỳnh quang, chẳng hạn nh ethidium (chất này gắn kết vớiADN bằng cách cài vào khe ở giữa các nucleotit) Mỗi một băng điện di thờng phản ánh mộttập hợp các phân tử ADN có cùng kích thớc

Có hai loại vật liệu làm gel đợc sử dụng phổ biến trong điện di, đó là agarose và

polyacrylamid Trong đó, gel polyacrylamid có khả năng phân tách cao, nhng khoảng kích

thớc ADN có thể phân tích hẹp Vì vậy, điện di trên gel polyacrylamid có thể phân tách đ ợccác phân đoạn ADN khác nhau thậm trí chỉ một

cặp nucleotit (1 bp) duy nhất, nhng thờng chỉ để

phân tích các đoạn ADN kích thớc vài trăm bp

Còn gel agarose có khả năng phân tách thấp hơn

đối với các phân đoạn ADN kích thớc nhỏ, nhng

rất hiệu quả khi phân tách các phân đoạn ADN

kích thớc lớn tới hàng chục hoặc hàng trăm kb (1

kb = 1000 bp)

Các phân đoạn ADN kích thớc lớn không

thể “lọt” qua các lỗ có kích thớc nhỏ trên các

bản gel, kể cả gel agarose Thay vào đó, chúng

sẽ “trờn” qua mạng lới của gel bằng việc đầu này

của phân tử đi trớc, còn đầu kia theo sau Kết

quả là các phân đoạn ADN kích thớc lớn (từ 30

đến 50 kb) có tốc độ di chuyển trên điện trờng

gần nh tơng đơng và khó phân tách đợc bằng

ph-ơng pháp điện di thông thờng Đối với các phân

đoạn ADN kích thớc lớn nh vậy, ngời ta có thể

phân tách bằng việc sử dụng phơng pháp điện di

xung trờng (pulsed-field gel electrophoresis).

Điện cực

Hình 9 Ph ơng pháp điện di xung tr ờng A

và B là hai bộ điện cực Chúng đ ợc bật và tắt một cách luân phiên Khi bật A, phân tử ADN

di chuyển về góc phải phía d ới Khi A tắt và B

Trong phơng pháp này, ngời ta sử dụng 2 cặp điện cực nằm chéo góc trên bản điện di (hình 9).Việc “bật” và “tắt” luân phiên 2 cặp điện cực sẽ làm cho các phân đoạn ADN lớn thay đổichiều di chuyển nh mình họa trên hình vẽ Các phân đoạn ADN có kích thớc càng lớn càngchậm hơn trong quá trình thay đổi chiều di chuyển Nhờ vậy, các phân đoạn có kích thớc khácnhau sẽ phân tách ra khỏi nhau trong quá trình di chuyển Kỹ thuật điện di xung tr ờng trongthực tế có thể sử dụng để xác định đợc kích thớc đầy đủ của nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặcnhiễm sắc thể các loài sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, nh nấm men Những loài này có kích thớc

hệ gen khoảng vài Mb

Điện di không những có thể phân tách các phân đoạn ADN khác nhau về kích thớc màcả về hình dạng và cấu hình không gian của chúng Các phân tử ADN ở dạng mạch vòng giãnxoắn hoặc bị “đứt gãy” ở một số nucleotit di chuyển chậm hơn trên trờng điện di so với cácphân tử ADN ở dạng mạch thẳng có cùng khối lợng Tơng tự nh vậy, các phân tử ADN ở dạngsiêu xoắn, kích thớc và thể tích thu nhỏ thờng di chuyển nhanh hơn trên trờng điện di so vớicác phân tử ADN dạng mạch vòng giãn xoắn hoặc có mức độ cuộn xoắn thấp hơn có cùngkhối lợng

Kỹ thuật điện di cũng đợc sử dụng để phân tách các phân tử ARN Các phân đoạn ADNsợi kép mạch thẳng có cấu trúc bậc hai đồng nhất nên tốc độ di chuyển trên tr ờng điện di tơngquan tỉ lệ thuận với khối lợng phân tử của chúng Cũng giống nh ADN, các phân tử ARN cũngthờng tích điện âm, nhng ngoài cấu trúc cơ bản ở dạng mạch đơn, các cấu trúc bậc 2 và 3 củaphân tử ARN có ảnh hởng đến tốc độ di chuyển của chúng trên trờng điện di Để hạn chế điềunày, thông thờng ngời ta phải xử lý ARN với một số hóa chất ngăn cản sự hình thành các liênkết cục bộ trong phân tử ARN, chẳng hạn nh glyoxal Hợp chất này liên kết với nhóm -NH2trong các bazơ nitơ và ngăn cản sự kết cặp của các nucleotit Các phân tử ARN đợc xử lýglyoxal không hình thành đợc các cấu trúc bậc 2 và 3 vì vậy có tốc độ di chuyển trên trờng

điện di dờng nh đơn thuần phụ thuộc vào khối lợng phân tử của chúng

V.1.2 Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN

Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thớc có thể thaotác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm Trong các tế bào, phần lớn cácnhiễm sắc thể thờng là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khácnhau Vì vậy, để có thể phân lập và phân tích từng gen, ngời ta phải cắt các phân tử ADN kíchthớc lớn thành các phân đoạn nhỏ Công việc này đợc thực hiện bởi một nhóm các enzym đặc

biệt gọi là enzym giới hạn

Tất cả các enzym giới hạn đều có hai đặc tính: 1) nhận biết một trình tự đặc hiệu trên phân tử ADN (gọi là trình tự giới hạn); và 2) cắt bên trong phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu

(hoặc ngay tại vị trí giới hạn nh đối với nhóm enzym giới hạn loại II; hoặc cách vị trí giới hạnmột số nucleotit nhất định nh đối với các nhóm enzym giới hạn thuộc các nhóm I và III).Trong các nhóm enzym giới hạn, nhóm thờng đợc dùng trong các nghiên cứu di truyền phân

tử và kỹ nghệ gen là nhóm II nhờ vị trí và trình tự cắt của chúng đ ợc xác định rõ Trong phạm

vi giáo trình này, vì vậy chúng ta chỉ đề cập đến việc ứng dụng của nhóm enzym giới hạn này.Các trình tự giới hạn của enzym nhóm II thờng gồm 4 - 8 bp, thông thờng có tính đối xứng và

vị trí cắt thờng nằm trong trình tự giới hạn này Ví dụ nh enzym giới hạn EcoRI đợc tìm thấy ở

vi khuẩn E coli có trình tự giới hạn là 5’-GAATTC-3’ với vị trí cắt ở giữa G và A Tên enzym gồm 3 ký tự đầu chỉ tên loài vi khuẩn mà từ đó enzym đợc tìm thấy (Eco = Escherichia coli),

các ký tự sau chỉ tên của chủng vi khuẩn và số thứ tự của enzym đợc tìm thấy ở loài vi khuẩn

đó (EcoRI là enzym giới hạn đầu tiên đợc tìm thấy ở E coli).

Một enzym giới hạn có trình tự giới hạn gồm 6 bp giống EcoRI thông thờng đợc trông

đợi sẽ có trung bình một vị trí cắt trong một đoạn trình tự có kích thớc khoảng 4 kb (bởi theonguyên tắc xác suất tại một vị trí nhất định xác suất để có một loại nucleotit nhất định là 1/4,vì vậy xác suất để có một trình tự nhất định gồm 6 bp sẽ là 1/46 = 1/4096) Giả sử có một phân

tử ADN mạch thẳng có 6 vị trí cắt của enzym EcoRI Việc cắt phân tử ADN này bằng EcoRI

sẽ cho ra 7 phân đoạn ADN khác nhau Do đó, khi điện di trên gel sản phẩm cắt, 7 phân đoạnADN sẽ phân tách nhau ra do chúng khác nhau về khối lợng (vì chúng khác nhau về thànhphần và trình tự các nucleotit) Nh vậy, một phân đoạn ADN sẽ tơng ứng với một vùng củaphân tử ADN ban đầu

Việc sử dụng một enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII cũng có trình tự giới hạn

gồm 6 bp, nhng có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT-3’) sẽ cho ra các sản phẩm cắt

khác với khi sử dụng EcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu) Nh vậy, việc sử dụng đồng thời

nhiều enzym giới hạn sẽ tạo ra một kiểu hình phổ điện di các phân đoạn cắt giới hạn đặc thù

đối với từng gen phân tích

Đối với một số enzym giới hạn khác, chẳng hạn nh Sau3A1 (tìm thấy ở vi khuẩn Staphylococcus aureus) có trình tự giới hạn ngắn hơn (5’-GATC-3’), nên tần số cắt của chúng thờng cao hơn các enzym có trình tự giới hạn dài Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình 1 vị trí

cắt trong một đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256) Ngợc lại, enzym NotI có trình tự

giới hạn dài (5’-GCGGCCGC-3’) trung bình cứ một đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, mới có 1

vị trí cắt (1/48 = 1/65536)

Các enzym giới hạn không chỉ khác nhau về trình tự giới hạn và độ dài đoạn trình tự giớihạn đặc trng của chúng, mà chúng còn khác nhau về cách “cắt” phân tử ADN Chẳng hạn nh

enzym HpaI tạo ra các phân tử ADN dạng đầu bằng (đầu tù), còn các enzym EcoRI, HindIII

và PstI cắt phân tử ADN tạo ra các phân đoạn có đầu dính Sở dĩ gọi là “đầu dính” bởi phần

các trình tự ở hai đầu sau khi đợc enzym cắt ra bổ trợ với nhau theo nguyên tắc Chargaff và vìvậy chúng có xu hớng “dính” trở lại với nhau, hoặc với các phân tử ADN đợc cắt bởi cùng mộtloại enzym giới hạn Tính chất này đợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp vàcác kỹ thuật tách dòng phân tử

V.1.3 Các phơng pháp lai phân tử và mẫu dò

Các phân tử ADN sợi kép có một tính chất đặc biệt là khả năng biến tính (phân táchthành hai mạch đơn) và hồi tính (hai mạch đơn có trình tự bổ trợ có xu hớng liên kết trở lại khivắng mặt các tác nhân gây biến tính) Khả năng liên kết bổ trợ giữa các bazơ nitơ cũng chophép hai mạch ADN có nguồn gốc khác nhau nhng có trình tự bổ trợ liên kết với nhau trong

điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH, ion hóa …) để tạo nên một phân tử ADN mới Hiện ợng liên kết nh vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch ADN với nhau, hoặc giữa hai mạch ARNhoặc giữa ADN và ARN Phân tử axit nucleic sợi kép mới hình thành đợc gọi là phân tử lai vàquá trình kết cặp giữa các bazơ thuộc hai mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác nhau theo

t-nguyên tắc bổ trợ nh vậy đợc gọi là quá trình lai phân tử.

Nhiều kỹ thuật trong nghiên cứu di truyền phân tử đợc dựa trên nguyên tắc lai phân tử.Chẳng hạn, bằng nguyên tắc này ngời ta có thể dùng một trình tự ADN biết trớc để xác địnhmột trình tự bổ trợ tơng ứng có trong hệ gen của mẫu phân tích Phân đoạn ADN có trình tự

biết trớc dùng trong phản ứng lai nh vậy đợc gọi là mẫu dò Các mẫu dò có thể có nguồn gốc

từ các phân đoạn ADN trong tự nhiên hoặc đợc tổng hợp theo nguyên tắc hóa học, và để nhậnbiết đợc chúng, các mẫu dò thờng đợc đánh dấu với các chất phóng xạ hoặc phát huỳnh quang

(ở đây, gọi tắt là chất phát quang)

Có hai phơng pháp đánh dấu mẫu dò ADN Phơng pháp thứ nhất dùng nguyên tắc tổnghợp hóa học phân tử ADN mới với tiền chất là các phân tử đánh dấu Phơng pháp thứ hai làgắn một phân tử đánh dấu vào đuôi của một trình tự ADN có sẵn Chẳng hạn, bằng việc sửdụng enzym polynucleotide kinase, ngời ta có thể bổ sung nhóm phosphat  của ATP vàonhóm 5’-OH của một phân tử ADN định đánh dấu Nếu nhóm phosphat này đợc đánh dấubằng đồng vị phóng xạ 32P thì phân tử ADN sẽ đợc dánh dấu phóng xạ

Phơng pháp đánh dấu ADN thứ hai (sử dụng các tiền chất đánh dấu) thờng đợc thực hiệndựa trên phản ứng PCR, hoặc đôi khi chỉ cần sử dụng các đoạn mồi ngắn rồi cho enzym ADNpolymerase thực hiện phản ứng kéo dài chuỗi Các tiền chất đánh dấu đợc sử dụng thờng là 1trong 4 loại nucleotit đợc cải biến thành dạng đợc đánh dấu bằng cách gắn với các nhóm chấtphát quang hoặc nguyên tử phóng xạ Với phơng pháp này, khoảng 25% nucleotit trong phân

tử ADN đợc đánh dấu và điều đó đủ đáp ứng hầu hết các nhu cầu nghiên cứu khác nhau.Các phân tử ADN đánh dấu với các tiền chất phát quang đợc phát hiện bằng cách chiếuxạ mẫu ADN với ánh sáng UV có bớc sóng phù hợp và đo ở bớc sóng phát xạ tơng ứng Cácphân tử ADN đợc đánh dấu phóng xạ thờng đợc phát hiện bằng cách chụp mẫu ADN với phimtia X, hoặc đo bằng máy khuếch đại tín hiệu hạt  từ các nguyên tố phóng xạ 32P và 35S (đây làhai nguyên tố phóng xạ đợc sử dụng phổ biến để dánh dấu ADN)

Trong các nghiên cứu di truyền học phân tử hiện nay, có nhiều cách để xác định cácphân đoạn ADN và ARN đặc hiệu dựa trên các phơng pháp lai ở đây, chúng ta chỉ đề cập đếnhai phơng pháp đợc dùng phổ biến:

Xác định các phân đoạn ADN và ARN bằng điện di và mẫu dò

Phơng pháp sử dụng mẫu dò kết hợp với điện di là một phơng pháp cơ bản có thể giúpxác định mức độ phổ biến hoặc kích thớc của một đoạn trình tự ADN hoăc ARN đợc quan tâmnghiên cứu Chẳng hạn nh bằng kỹ thuật này, ngời ta có thể xác định và so sánh đợc mức biểuhiện của một gen ở các loại tế bào và mô khác nhau thông qua định lợng bản phiên mã mARNtơng ứng của gen đó tại các tế bào và mô tơng ứng; hay nh để xác định kích thớc của một đoạnADN cắt giới hạn mang trình tự gen đợc quan tâm nghiên cứu

Giả sử chúng ta cắt hệ gen của nấm men bằng enzym giới hạn EcoRI và cần xác định

đ-ợc kích thớc của phân đoạn ADN cắt giới hạn mang trình gen A Sản phẩm ADN tổng số sau

khi đợc cắt bằng EcoRI sẽ tạo ra một số lợng lớn các phân đoạn có kích thớc xấp xỉ 4 kb (vì 46

= 4096 bp) Vì vậy, nếu đem sản phẩm cắt giới hạn nhuộm với EtBr, thì sản phẩm điện di sẽ làmột dải các phân đoạn liên tục có kích thớc xấp xỉ 4 kb, và không thể xác định đợc chính xác

phân đoạn nào mang gen A Trong trờng hợp đó, kỹ thuật thẩm tách Southern (còn gọi là lai

Southern) có thể đợc dùng để xác định phân đoạn mang gen đó Lúc này, ngời ta sẽ đem sản

phẩm cắt giới hạn ngâm vào một dung dịch có tính kiềm để làm biến tính các phân đoạn ADNsợi kép Các phân đoạn này sau đó đợc chuyển sang một màng tích điện dơng gọi là màng

“thẩm tách” theo hình thức “đóng dấu” Nghĩa là các phân đoạn ADN định vị trên màng thẩm