phương pháp ghép tấm biểu mô cuống rốnnuôi cấy điều trị loét giác mạc khó hàn gắn

1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Loét giác mạc khó hàn gắn (LGMKHG) tình trạng ổ loét không biểu mô hoá sau điều trị tích cực loại trừ nguyên nhân gây bệnh Đây hậu bệnh lý khác giác mạc (GM), có chế phức tạp, nên đến chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Có nhiều biện pháp điều trị LGMKHG ứng dụng chống viêm, nước mắt nhân tạo, tăng dinh dưỡng bề mặt nhãn cầu, đặt kính tiếp xúc mềm, khâu cò mi, ghép GM…, nhiên nhiều trường hợp trình biểu mô hóa GM khó khăn đe dọa đến chức thị giác Ghép màng ối phương pháp ứng dụng tỷ lệ thành công dao động (từ 31,4% đến 91,7%), việc sử dụng màng ối mặc thường làm giảm tính suốt GM, ảnh hưởng đến chức thị giác Công nghệ tế bào gốc gần nghiên cứu điều trị LGMKHG, mở hướng phát triển điều trị bệnh lý Ghép biểu mô nuôi cấy tự thân (vùng rìa, niêm mạc miệng) đồng loại (biểu mô màng ối) sử dụng cho số trường hợp cho kết đáng khích lệ Biểu mô cuống rốn (BMCR) chất biểu mô màng ối bọc quanh cuống rốn Các tế bào phân lập chứng minh có tính chất tế bào gốc biểu mô, có khả biệt hóa thành số loại tế bào biểu mô khác môi trường thích hợp, đặc biệt biểu mô GM Reza (2011) biệt hóa biểu mô cuống rốn giống với biểu mô GM, ghép thỏ Kết cho thấy GM sau ghép 10 tuần trong, tân mạch, có hình ảnh mô học giống với GM thỏ bình thường Những nghiên cứu mở hướng ứng dụng BMCR nuôi cấy bệnh lý bề mặt nhãn cầu, đặc biệt LGMKHG – tình trạng bệnh lý khó điều điều trị nhãn khoa Xuất phát từ kết tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Đánh giá kết phương pháp ghép biểu mô cuống rốn nuôi cấy điều trị loét giác mạc khó hàn gắn Nhận xét yếu tố ảnh hưởng đến kết phẫu thuật 2 Tính cấp thiết đề tài Loét GM khó hàn gắn hậu nhiều bệnh lý khác bề mặt nhãn cầu, có chế phức tạp, chưa có điều trị đặc hiệu, phương pháp điều trị trước nhiều hạn chế Ổ loét tồn kéo dài, tổn thương sâu dần nhu mô gây loét thủng, bệnh lý nan giải thầy thuốc nhãn khoa Do việc nghiên cứu phương pháp mới, điều trị hiệu bệnh lý cần thiết Công nghệ tế bào gốc (đặc biệt tế bào biểu mô đồng loại) bắt đầu ứng dụng điều trị LGMKHG gần đây, mở giải pháp cho tình trạng bệnh lý Tuy nhiên đến có nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc, đặc biệt tế bào gốc đồng loại, điều trị LGMKHG Những đóng góp luận án Đây nghiên cứu công bố giới Việt nam sử dụng BMCR nuôi cấy điều trị LGMKHG với số lượng đủ lớn Nghiên cứu chứng minh hiệu phương pháp bước đầu làm rõ chế liền biểu mô, tồn tế bào biểu mô đồng loại diện GM sau ghép Với thời gian theo dõi dài sau PT đến 34 tháng chứng minh độ an toàn ghép BMCR nuôi cấy Mặc dù kỹ thuật áp dụng tương đối giống với biểu mô màng ối nghiên cứu Parmar D.N (2006), có cải tiến giúp đơn giản hóa cho trình nuôi cấy PT, phù hợp với điều kiện nước phát triển Việc dùng giá đỡ giếng nuôi cấy (thay collagen với độ cong GM) giúp trình nuôi cấy dễ dàng Phương pháp cố định biểu mô khâu ép lên kính tiếp xúc đạt hiệu tốt, mà không đòi hỏi phương tiện đại, kỹ thuật phức tạp Bố cục luận án Luận án gồm 119 trang gồm: Đặt vấn đề (2 trang), chương 1Tổng quan (32 trang), chương 2- Đối tượng phương pháp nghiên cứu (17 trang), chương 3- Kết (35), chương 4- Bàn luận (30 trang), Kết (2 trang), Kiến nghị (1 trang) Trong luận án có 31 bảng, 13 biểu đồ, 23 hình, phụ lục Luận án có 110 tài liệu tham khảo, có tiếng Việt, 104 tiếng Anh, tiếng Đức CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Loét giác mạc khó hàn gắn 1.1.1 Khái niệm Loét GM khó hàn gắn hay ổ khuyết biểu mô lâu liền (persistent epithelial defect), ổ loét không biểu mô hóa sau điều trị tích cực loại trừ nguyên nhân gây bệnh Trên lâm sàng ổ loét biểu biểu mô hóa vòng tuần xác định khó hàn gắn LGMKHG bao gồm hai nhóm khuyết biểu mô đơn có loét nhu mô 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh LGMKHG - Tổn thương trực tiếp đến tế bào biểu mô GM, vùng rìa do: suy giảm tế bào gốc vùng rìa, suy giảm liên kết tế bào biểu mô, tổn thương tế bào biểu mô thuốc nhỏ mắt, chất bảo quản - Tình trạng viêm bề mặt nhãn cầu: IL1 TNFα hoạt hóa men tiêu protein hóa ứng động dương với bạch cầu, ức chế di cư tế bào - Tổn thương thần kinh dinh dưỡng (neurotrophic keratopathy): ức chế phân chia tế bào giảm cảm giác GM - Tổn thương học: làm tăng số lượng tế bào bị bong khỏi GM, mức độ nặng gây khuyết biểu mô, loét GM 1.1.3 Các phương pháp điều trị LGMKHG Nguyên tắc chung: phối hợp nhiều biện pháp, định hướng chế chiếm ưu để có phương pháp điều trị phù hợp Điều trị tổn thương phối hợp Các phương pháp nội khoa: dừng thuốc tra mắt gây độc biểu mô, nước mắt nhân tạo, thuốc tăng dinh dưỡng, giúp tăng liền biểu mô, thuốc ức chế men tiêu protein, chống viêm… Tuy nhiên đa số sử dụng biện pháp hỗ trợ, điều trị trường hợp LGMKHG mức độ nhẹ Huyết tự thân đặt kính tiếp xúc mềm phương pháp có hiệu quả, thường áp dụng Tuy nhiên cần theo dõi sát có nguy bội nhiễm ổ loét Các phương pháp điều trị ngoại khoa: phương pháp trước (cò mi, khâu phủ kết mạc, ghép GM) có hiệu có nhiều nhược điểm, ảnh hưởng đến thẩm mỹ, chức dễ có nguy LGMKHG tái phát Ghép vùng rìa GM có hiệu LGMKHG suy giảm tế bào nguồn vùng rìa, không thực tổn thương hai mắt Ghép màng ối phương pháp nghiên cứu, ứng dụng khoảng 20 năm Đây phương pháp đơn giản, phục hồi tình trạng khuyết nhu mô GM, dùng trường hợp loét thủng nhỏ (< 3mm), làm giảm trình viêm, tăng sinh tân mạch GM, không gây phản ứng thải ghép Màng ối kích thích liền biểu mô theo hai chế chủ yếu: tạo màng đáy giống với màng đáy GM bình thường (khi ghép diện loét – inlay), tạo vi môi trường thuận lợi kích thích tế bào biểu mô xung quanh tổn thương di chuyển vào che phủ ổ loét (khi ghép phủ lên diện loét – overlay) Tùy nhóm đối tượng mà phương pháp có kết dao động (tỷ lệ thành công từ 31,4% đến 91,7%), làm giảm độ GM sau ghép, có nguy lây truyền chéo (ghép màng ối đông lạnh) Công nghệ tế bào gốc điều trị LGMKHG: hướng nghiên cứu điều trị - ổ loét giác mạc thay tạm thời hay vĩnh viễn biểu mô nuôi cấy giống biểu mô GM 1.2 Nghiên cứu sử dụng biểu mô nuôi cấy điều trị LGMKHG 1.2.1 Tấm biểu mô nuôi cấy tự thân Ghép biểu mô nuôi cấy tự thân (tế bào gốc vùng rìa, tế bào niêm mạc miệng) sử dụng LGMKHG suy tế bào gốc vùng rìa toàn hai mắt Ổ tổn thương che phủ lớp biểu mô nằm màng đáy có độ dày tính chất tương đối giống với lớp biểu mô GM bình thường Tuy nhiên mắt viêm nên có nguy hỏng mảnh ghép cao 1.2.2 Tấm biểu mô nuôi cấy đồng loại Ghép biểu mô nuôi cấy đồng loại cần tế bào không gây thải ghép, biệt hóa giống biểu mô GM – tế bào biểu mô màng ối đáp ứng yêu cầu He Y.G cộng (1999) so sánh ghép biểu mô tế bào vùng rìa GM nuôi cấy biểu mô màng ối nuôi cấy GM thỏ tổn thương Nghiên cứu cho thấy sau ghép 24h, tế bào biểu mô màng ối tái phân cực, sau gắn với nhu mô GM phía thể bán liên kết giống tế bào biểu mô rìa GM nuôi cấy Sau PT 10 ngày, 4/12 trường hợp ghép biểu mô màng ối 6/15 trường hợp ghép tế bào vùng rìa phát tồn tế bào GM Kế thừa kết này, Parmar D.N cộng (2006) thử nghiệm sử dụng biểu mô màng ối nuôi cấy collagen cho bệnh nhân loét GM khó hàn gắn thất bại với biện pháp điều trị nội khoa Kết bệnh nhân ổ loét biểu mô hóa hoàn toàn sau – lần đặt biểu mô màng ối nuôi cấy Phân tích chế liền biểu mô, tác giả cho có liền ổ loét tác động sinh học biểu mô màng ối cải tạo vi môi trường ổ tổn thương GM, giúp tế bào biểu mô xung quanh tăng sinh che phủ loét Ngoài ra, biểu mô màng ối liên kết tạm thời nhu mô phía để che phủ ổ loét tạm thời, thay dần khicác tế bào GM xung quanh di chuyển vào 1.3 Ứng dụng BMCR nuôi cấy điều trị LGMKHG 1.3.1 Tính chất gốc tế bào BMCR Bọc quanh cuống rốn màng ối, BMCR biểu mô màng ối, hình thành từ thượng bì phôi (epiblast) vào ngày thứ 7–8 thai kỳ Do dẫn đến suy luận tế bào BMCR có tính chất “gốc” từ tế bào vạn thượng bì phôi Tế bào BMCR có marker tế bào gốc phôi (Oct-4, Rex 1, SSEA- 4, SOX – 2, Nanog), dương tính với số marker tế bào gốc trung mô (CD44, CD166), dương tính rõ với marker tế bào gốc biểu mô (CD151, CD227) Các tế bào biểu rõ tính chất tế bào gốc biểu mô (dương tính với CK7, CK8, CK14, CK19, ∆Np63) marker khác tế bào gốc vùng rìa (ABCG2, HES1, BMI1, CK15, SOD2) Trên thực nghiệm tế bào BMCR biệt hóa thành tế bào gan (với đầy đủ chức năng), biểu bì biểu mô GM 1.3.2 Độ an toàn cấy ghép tế bào gốc biểu mô cuống rốn Màng ối (có tế bào biểu mô) từ lâu sử dụng người Tế bào biểu mô màng ối thử nghiệm ghép chứng minh độ an toàn không gây thải người từ năm 1980 Tế bào BMCR chất biểu mô màng ối (nhưng biệt hóa hướng biểu mô) nên có nguy sinh u Thực nghiệm ghép BMCR chuột suy giảm miễn dịch sau tháng không thấy có khối tân tạo BMCR phần thai nên không gây thải ghép đồng loại Trong tế bào có HLA E, G có vai trò ức chế miễn dịch Trên thực nghiệm ghép dị loài (trên chuột) thấy BMCR không bị thải 1.3.3 Các nghiên cứu biệt hóa BMCR thành biểu mô giác mạc BMCR có marker tế bào gốc vùng rìa, nuôi cấy môi trường PTTe-1 biệt hóa giống với tế bào biểu mô GM (dương tính CK3, CK12) Reza H.M cộng ghép BMCR nuôi cấy mắt thỏ gọt biểu mô kết GM Kết 100% số thỏ GM trong, biểu suy giảm tế bào gốc vùng rìa sau tuần, thời điểm 10 tuần 50% số thỏ Xét nghiệm giải phẫu bệnh lý cho thấy bề mặt GM sau ghép lớp tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa, có cấu trúc giống GM thỏ bình thường, viêm biểu mô Đánh giá hóa mô miễn dịch tế bào dương tính với CK3, CK12 (đặc hiệu cho biểu mô GM) âm tính với CK4, CK19 (đặc hiệu biểu mô kết mạc) Như vậy, BMCR chất biểu mô màng ối, biệt hóa giống biểu mô giác mạc nên hoàn toàn nghiên cứu áp dụng điều trị loét GM khó hàn gắn giống phương pháp Parma D.N nêu Tuy nhiên đến giới Việt Nam chưa có nghiên cứu vấn đề CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành 37 bệnh nhân bị LGMKHG nguyên nhân khác điều trị Bệnh viện Mắt Trung ương từ tháng năm 2011 đến tháng 11 năm 2013 Tiêu chuẩn lựa chọn Tiêu chuẩn loại trừ - Nuôi cấy chất nạo ổ loét cho kết - Loét GM dọa thủng, âm tính với vi khuẩn, nấm thủng - Đã điều trị nội khoa hết - GM ổ viêm sâu nhu dấu hiệu viêm cấp bề mặt nhãn mô cầu, ổ loét có dấu hiệu khó hàn - Bệnh nhân có quặm, gắn: biến dạng, hở mi nặng kèm + Mắt giảm kích thích theo + Bờ ổ loét có gờ cuộn biểu mô - Các trường hợp loét khó hàn + Đáy ổ loét tương đối sạch, hầu gắn có tổn thương tế bào gốc vùng rìa GM toàn không chất hoạt tử + Không có biểu biểu mô hoá - Bệnh nhân không hợp tác nghiên cứu thêm tuần 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.Thiết kế nghiên cứu: thử nghiệm lâm sàng, có chủ đích, không đối chứng, so sánh dọc trước sau điều trị 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu: p (1 − p ) N = Z 21−α / d2 tính theo công thức N: cỡ mẫu nghiên cứu ≈ 32 mắt (trong nghiên cứu 37 mắt) 2.2.3 Phương pháp chọn mẫu: bệnh nhân LGMKHG điều trị nội khoa tích cực trước PT Các trường hợp lại điều trị tích cực phương pháp nội khoa hai tuần mà hiệu định PT 2.2.4 Phương tiện nghiên cứu - Phương tiện khám phẫu thuật: bảng thị lực, sinh hiển vi khám, hiển vi PT, giấy thấm nitrocellulose, KTX - Tấm biểu mô cuống rốn nuôi cấy: nuôi nuôi cấy phòng thí nghiệm môn Ngoại, Đại học quốc gia Singapore (cung cấp công ty KenCare Việt Nam) Tấm biểu mô đánh giá mô học, marker CK3, CK12 (theo tiêu chuẩn sở) 2.2.5 Cách thức tiến hành nghiên cứu - Khám, thu thập thông tin bệnh nhân: đặc điểm bệnh nhân, tiền sử bệnh tổn thương mắt - Phẫu thuật ghép biểu mô cuống rốn nuôi cấy Tê cạnh nhãn cầu ml lidocain 2% Dùng dao lưỡi tròn gọt lấy bỏ hoại tử, làm đáy ổ loét, bờ ổ loét, tạo cho diện ghép Đặt biểu mô (giá đỡ đáy giếng nuôi cấy) lên diện loét mặt có biểu mô quay xuống Đặt kính tiếp xúc mềm đường kính 11mm che phủ diện đặt biểu mô, khâu cố định vào củng mạc hai mũi Vicryl 8/0 theo hình dấu cộng bắt chéo qua KTX PT phối hợp thì: rửa mủ tiền phòng cắt mộng ghép kết mạc rìa trường hợp có bệnh lý phối hợp Ghép biểu mô lần hai: ổ LGMKHG sau ghép lần thứ thu gọn chưa biểu mô hóa hoàn toàn sau tuần - Điều trị nội khoa sau phẫu thuật + Tra mắt dung dịch moxifloxacin 0,5% (4 lần/ngày) đến GM liền hoàn toàn, uống Zinnat 0,25g x viên/ngày x ngày Dinh dưỡng huyết tự thân 20%, nước mắt nhân tạo + Cắt cố định KTX, kiểm tra tình trạng biểu mô hóa ổ loét sau PT ngày 2.2.6 Các tiêu chuẩn đánh giá kết phẫu thuật - Thời gian liền biểu mô Thành công: ổ loét LGMKHG biểu mô hóa hoàn toàn sau hay nhiều lần PT, chia mức (theo Tsubota, 1999): + Tốt: biểu mô hóa hoàn toàn tuần sau PT + Trung bình: ổ khuyết biểu mô thu gọn sau tuần PT biểu mô hóa hoàn hoàn toàn sau tháng điều trị + Kém: tình trạng khuyết biểu mô kéo dài tuần sau PT, cần ghép lần hai Thất bại: ổ loét không biểu mô hóa hoàn toàn sau điều trị, cần sử dụng phương pháp điều trị khác, loét GM tái phát vòng tháng sau PT ghép lần hai - Tình trạng diện GM ghép biểu mô cuống rốn Bảng 2.2 Tiêu chuẩn phân loại tình trạng diện ghép Mứ Tình trạng diện ghép biểu mô c độ Biểu mô bề mặt nhẵn bóng, phẳng Tốt GM trong, quan sát rõ chi tiết tiền phòng Không có tân mạch diện ghép Biểu mô bề mặt xù xì khuyết biểu mô Khá GM đục nhẹ, quan sát rõ bờ đồng tử Có tân mạch diện ghép, nhu mô nông, không cương tụ Biểu mô bề mặt xù xì, có khuyết bong biểu mô tái diễn Kém GM đục nặng, không quan sát chi tiết tiền phòng Tân mạch diện ghép nhiều, cương tụ, có tân mạch sâu - Kết test áp đánh giá biểu mô bề mặt GM sau ghép: xem có tế bào bất thường, không giống tế bào biểu mô GM, nhân quái, nhân chia (thực tháng, tháng, tháng sau PT) - Thị lực: đánh giá theo bảng thị lực Snellen 2.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phẫu thuật - Các yếu tố liên quan tình trạng loét khó hàn gắn: nguyên nhân gây loét, thời gian loét thời gian khó hàn gắn Đặc điểm ổ loét GM: kích thước, độ sâu, tổn thương phối hợp - Tình trạng biểu mô trước ghép Đánh giá đại thể biểu mô (bằng kính hiển vi PT) theo mức: tốt, khá, Đánh giá khả sống tế bào: nhuộm Trypan blue (3 mẫu), nuôi cấy lại biểu mô (3 mẫu) - Các yếu tố trình phẫu thuật: PT phối hợp thì; tai biến, biến chứng sau PT 2.2.8 Đánh giá mô học gen giới tính mảnh giác mạc ghép BMCR: để đánh giá có mặt tế bào BMCR diện ghép Lấy BMCR trẻ trai ghép cho bệnh nhân nữ Sau thời gian tiến hành ghép GM cho bệnh nhân này, lấy GM ghép BMCR làm mô bệnh học xét nghiệm PCR tìm gen SRY (đặc hiệu cho NST Y) để xác định có mặt tế bào BMCR diện ghép 2.3 Thu thập xử lý số liệu: xử lý chương trình thống kê y học SPSS 13.0, R Đánh giá liên quan biến số hệ số tương quan r; khác biệt biến số test χ Fisher’s ecxact test với biến định tính; test t-Student test Wilcoxon-Mann-Whitney với biến định lượng CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm bệnh nhân biểu mô trước ghép 3.1.1 Phân bố theo tuổi, giới Tuổi: 21 đến 86 tuổi (trung bình 59,6 ± 19,8 tuổi), 32/37 trường hợp 40 tuổi Giới: 26 nam, 11 nữ 3.1.2 Nguyên nhân gây loét giác mạc Bảng 3.2 Các nguyên nhân ban đầu gây tổn thương GM Nguyên nhân Số lượng Tỷ lệ % Nhiễm virus Herpes 12 32,4 Nghi ngờ nhiễm Herpes 5,4 Nhiễm trùng Nhiễm khuẩn 11 29,7 Nhiễm nấm 2,7 Sau PT 8,1 Sau tia xạ 2,7 Chấn thương 5,4 Hội chứng Sjogren 2,7 Nguyên nhân chưa xác định 10,9 Tổng 37 100 3.1.3 Thời gian mặc bệnh thời gian khó hàn gắn 10 Biểu đồ 3.1 Thời gian loét giác mạc (a), thời gian khó hàn gắn (b) Thời gian loét GM từ tuần đến 28 tuần (TB 9,9 ± 5,2 tuần), thời gian khó hàn gắn từ tuần đến 13 tuần (TB 5,0 ± 2,9 tuần) Hệ số tương quan thời gian điều trị trước với thời gian loét khó hàn gắn r = 0,58, có ý nghĩa thống kê 3.1.4 Các phương pháp điều trị trước Bảng 3.4 Các phương pháp điều trị loét GM áp dụng Phương pháp điều trị Số lượng(mắt) Thời gian (tuần) Ngoại khoa Nội khoa Ghép giác mạc Rửa mủ tiền phòng TGM Kháng sinh TGM Kháng virus TGM Kháng nấm TGM NSAIDs TGM Steroid TGM NMNT 37 23 24 24 số mắt Biểu đồ 3.2 Các phương pháp điều trị LGMKHG 3.1.5 Đặc điểm tổn thương trước phẫu thuật 8,9 ± 3,2 5,1 ± 1,7 3,5 4,8 ± 2,1 2,2 ± 1,5 4,5 ± 1,9 34 the period time of PEDs and the period time of the corneal defects before PED was statistically significant ( r = 0.58) 3.1.4 The previous treatments Bảng 3.4 The previous treatments of corneal ulcer Treatments Quantity Time (weeks) Surgical Keratoplasty therapies Hypopion lavage Antibiotic eye drops Antiviral eye drops Medical Antifungal eye drops therapies NSAIDs eye drops Steroid eye drops Artificial tears eyes 37 23 24 24 8.9 ± 3.2 5.1 ± 1.7 3.5 4.8 ± 2.1 2.2 ± 1.5 4.5 ± 1.9 Figure 3.2 The previous treatments of PEDs 3.1.5 The characteristics of PEDs The size and depth of the defects The area of the PEDs were from 11% to 65% corneal area (average 33.9 ± 14.9 % corneal area) The correlation between the size and the depth of PEDs was quite low (r = 0.24), and it was not statitistically significant The size and depth of the PEDs had very low correlation with other fators (the period time of the defects and the period time of PEDs) (r < 0.1) 35 Table 3.6 The size and the depths of the PEDs Area < 30% 30% -60% Depth 0.05) - The PEDs’characteristics: The size and the deptht of the ulcers: had low correlation correlation with the condition of transplantation sites in follow up time (r ≤ 0,32), and these were not statitistically significant (p > 0.05) Combined ocular lesions: the correlation between the tear secrection and the transplantation sites in month postoperatively was -0.47 (p < 0.05) However, the correlations in later follow up time were decreased and not not statitistically significant (p > 0.05) - The quality of tissue-cultured CLECs after preservation: the preservative time and the the quality of cells sheet after preservation had very low correlation with the condition of transplantation sites (r < 0.1, p > 0.05) 3.3.3 The visual acuity involved factors There were no statitistically significant difference in visual acuity between groups of original causes of the corneal ulcer (p > 0.05) The recurrent ulcer group had lower visual acuity than the primary group in months postoperatively (p < 0.05) The correlations between the depth of ulcers, tear secrection and visual acuity were -0,4 and 0,46 respectively (p 0.05) The preservative time and the the quality of cells sheet after preservation had very low correlation with the visual acuity postoperatively (r < 0.1, p >0.05) CHAPTER DISCUSSION 4.1 The patients’ characteristics 4.1.1 The mechanisms of PEDs in study’s patients To investigate the mechanism of individual PED was quite complicated However, this mechanism was partially specified by 40 original causes of the corneal ulcer, the combined ocular lesions and the previous treatments In our study, the original causes of corneal ulcer were variety, but the corneal infection occupied more than two third (26/37 eyes) (section 3.1.2) This result showed the specific characteristic in Vietnam corneal ulcer – maily caused by infection, and was similar to N H Lê’s study of PED (2002) - infection ulcer rate was 86.1% The PED’s mechanism of this group was ocular inflammation that increased proteinase at the ulcer and prevented the immigration of adjacent epithelial cells to ulcer bed Reduction of corneal sensation, dry eye and hypopion were the prominent factors in combined ocular lesions - There were 21 eyes (56.8%) that had reduction of corneal sensation (chat 3.4) The mechanism of PED in these eyes was neurotrophic keratopathy - There were 30 eyes (81.1%) that had reduction of tear secrection (Schirmer I test ≤ 5mm), and 18 eyes (48.6%) had meibomian gland dysfunction Moreover, there were 14 eyes having both above lesions (section 3.2.2) There were 14 eyes (37.8%) that had stable and mild hypopion (1 – mm) with all negative result when doing the microbial test These evidence showed that the hypopion were resulted in ocular inflammation Both these factors (dry eye, hypopion) made PED progress by ocular inflammation mechanism Investigation of previous treatment (before PED appeared) showed the epithelial-toxic agents were frequently used for long time, such as NSAIDs eye drops, antiviral eye drops, benzalkonium… (table 3.4) There were even 18 eyes used artificial tear with benzalkonium as preservative agent in 24 eyes treated artificial tear with purpose of healing promotion In summary, the two main mechanisms of PED in our patients were ocular inflammation and neurotropic keratopathy The other mechanisms were not important role 4.1.2 The previous treatment of PEDs in our patients Stopping epithelial-toxic eye drops was the first therapy of PED However, 37 eyes (100%) in our study were continued using antibiotic eye drops to prevent infection and eyes were used antiviral eye drops 41 for long time since PED’s occurrence These medicaments made not only PED more severe but also the around normal corneal epithelai cells damaged Free preservative artificial tear also simple treatment for PED However, in our study, there were 14 eyes (37.8%) using artificial tear with benzalkonium as a preservative agent Moreover, in 13 eyes using artificial tear since PED’s occurrence , there were only eyes using free preservative medicament The modern therapies for PED were rarely applied in our patients: tarsorrhaphy (1 eye), amniotic transplantation (2 eyes), contact lens (2 eyes), contact lens and autologous serum (3 eyes) 4.1.3 The characteristics of PED The size of PEDs in our study was smaller than 2/3 corneal area (average 33.9 ± 14.9 % corneal area), and the depth was mainly lower than 2/3 corneal thickness (33/37 eyes) In our opinion, the size of PEDs was small because our patients’ eyes had quite little limbal injury (< 1800) Seitz B (2009) also recognised that eyes with large limbal injury (>1800) also made PED size larger Beside, most of eyes in our study were in degeneration condition ( 14 Hepertic eyes, 11 non-infection PED eyes), so that the destroyed phase of the ulcers were not clear, and the depth of ulcer were not so deep The correlation between the size and the depth was quite low (r = 0.24), and there were little relation between the size, the depth of PEDs with the period time of the defects, the period time of the PED (r < 0.05) (section 3.1.5) This characteristic happened 4.2 The result of tissue-cultured CLECs transplantation 4.2.1 The epithelial healing time The healing time in our patients were quite short, 22/37 eyes completely healed in week, and only one eye had epithelial healing time over weeks The high success rate of our study (34/37 eyes, 91.9%) showed the suitbale indication of transplantation for PEDs Bảng 4.1 The epithelial healing time in studies of PEDs The healing time n Authors Therapies ≤2 ≤4 >4 (%) weeks weeks weeks Tsubota Autologous serum 16 10 (1999) 20% (%) 43.8 62.5 37.5 42 Autologous serum 15 50%, 100% (%) 20 46.7 53.3 Autologous serum 25 13 17 Jeng (2009) 50% (%) 52 68 32 AMT (inlay, 16 11 Chen (2000) overlay) (%) 37.5 68.8 31.2 Letko AMT (inlay, 30 15 15 (2001) overlay) (%) 26.7 50 50 Prabhasawat AMT (inlay, 28 16 21 (2001) overlay) (%) 57.1 75 25 N.H Le 36 25 31 AMT inlay (2002) (%) 69.4 86.1 13.9 Culture-tissued N.Đ.Ngan 37 31 33 CLECs (2014) (%) 83.8 89.2 10.8 transplantation The table 4.1 showed our results were better than some previous studies of treating PEDs, however there were many differences in characteristics of PEDs in each study 4.2.2 The condition of the transplantation site on cornea There was no abnormal mass on transplantation site in all successful transpanted corneas in follow up time (section 3.2.2) The impression cytology results showed normal non-keratinised epithelial cells (section 3.2.3) The SRY PCR test (looking for Y chromosome) in all female corneal specimens were negative, meaning there were no male cells (CLECs) on the cornea at different time (1 month, months, 26 months postoperatively) (mục 3.2.6) All these results proven there were normal corneal scar at the transplantation site All transplanted eyes had no symtoms and signs of ocular inflammation and neovessels Some of them showed mild irritation by fiaxtion sutures After completely healing, the condition of inflammation, edema, and stromal vessels of these eyes were steady reduced 4.2.3 The results of visual acuity The visual acuity of before surgery eyes were quite low: 86.5% (32/37) eyes were in blind (< CF 3m), and there were no eyes having visual acuity better than 20/60 Although visual acuities after surgery increased and were statitistic significant better than they before surgery Pool (2001) 43 (p< 0.005), there were 28.1% (9/32) eyes in blind (< CF 3m) months postoperatively At the end of follow up time, there were 40% (12/30) eyes having visual acuity from 20/60 to 20/30, but none of them were better than 20/30 (table 3.10) After surgery, visual acuities gradually increased, and were statitistically significant better at months postoperatively than they at month postoperatively (p < 0.05 ) There was no difference bwtween visual acuity at months and at the end of follow up time (p > 0.05), meaning visual acuity of our patients increased and gained stablely at months after surgery (section 3.2.4) 4.2.4 The healing mechanism of tissue-cultured CLECs transplantation The idea of using tissue-cultured CLECs came from the efficacy of amniotic membrane transplantation and tissue-cultured amniotic epithelial cells in treatment PEDs Amniotics membrane was proven to inhibit inflammatoty reaction, scar creation, and neovascular growth, as well as promote epithelial migration, adhesion when overlay transplantation These bilogical efficacies came mainly from many mediator agents inside amniotic epithelial cells The mediator agents just existed on transplantation site for short time after surgery So if we transplanted viable amniotic cells, the efficacy may be better than using amniotic membrane This theory was proven by Parma’s study (2006) on human PEDs CLECs were amniotic epithelial cells around umbilical cord, so their micro-structure was the same as amniotic cells, and were one kind of stem cell These cells were also differentiated to corneal-liked epithelial cells So that’s when transplantation tissue-cultured CLECs on PEDs, they would promote healing in the similar mechanism of amniotic cells Moreover, CLECs may temporary adhered to stromal bed to make a scaffold for surround corneal epithelial cells that came and steady replaced to cover the defect (as Parma’s analysis) In our study, we also found that CLECs were not able to exist long time on transplantation site after surgery The test for Y chromosome in female corneal specimens showed negative result as soon as 1.5 months postoperatively 44 These mechanism of CLECs on PEDs were suitable with our subjects ( PEDs caused by inflammation and neurotrophic keratopathy) and explained the high success rate in our study 4.3 Influence factors of the CLECs transplantation 4.3.1 The PEDs’ involved factors Original causes of the corneal ulcer: All Herpetic PEDs were in good grade of epithelial healing These eyes completely healed in weeks after sugery with 11 fist week healed eyes (78.6%) We supposed this group quickly healed because they were neurotrophic keratopathy and ulcer bed inflammation; the limbal stem cells were quite normal.So that CLECs trannsplantation would inhibit the inflammatory reaction, promote epithelial healing very quickly However, the transplantation site of these eyes needed months to be stable, that was later than the other groups The reason of this phenomenon was the infitration anf inflammation inside cornea stroma of Herpetic keratopathy, that only gradually resolved for long time after epithelial healing The period time of the defects, the period time of the PED : There were no statitistically significant differences between groups of different time of the defects anf time of the PED (p > 0.05) However, the correlation between healing time and defect time was moderate n (r = 0,35, statitistically significant), while the correlation between healing time and time of the PED was quite low (r = 0.29, not statitistically significant) The transplantation site of the group of long time defect (over months) was later stable than other groups There were no differences in condition of transplantation site among groups of PED’s time The correlation among the period time of the defects, the period time of the PED with transplantation site in follow up time were quite low (r 0.05) 4.3.2 The PEDs’characteristics The size and the shape of the ulcers: The correlation among the size and the shape of PEDs with some results of our therapy (healing time, transplantation site) were low (r < 0.32), and not statitistically significant with p > 0.05 This analysis pointed that the PED’s characteristics were not useful for the result prognosis of CLECs transplantation However, there was moderate negative correlation between the depth of the PEDs and visual acuity postoperatively (r = - 0.4, p < 0.05) 45 The reason why that closed relation may be the depth of PEDs affected the corneal scar formation, as well as corneal topography, that affected the postoperative visual acuity So that the depth of PEDs may an useful factor for predicting visual acuity postoperatively Combined ocular lesions: The condition of tear film played and important role in result of CLECs transplantation The healing time had moderate correlation with the tear secrection (r = 0.36, statitistically significant) The healing time of 14 eyes having both reduction of tear secrection and MGD (10.1 ± 5.5 days) was statitistically significant longer than the other (7.8 ± 4.1days) (p < 0.05) The tear secrection also had moderate correlation with the condition of transplantation sites, especially at month postoperatively (r = - 0.47, p< 0.001) This correlation meant tear film affected not only epithelial healing but also scar formation Addition, that result explained why the relation between tear film and postoperative visual acuity (r = 0.46, p < 0.05) We had no intruments to measure the corneal sensation in quatity, but clinical examination showed the large number of reduction of corneal sensation (56.8%, 21/37 eyes) The healing time of reduction of corneal sensation group (10.2 ± 4.7 days) was statitistically significant longer than the others (p < 0.05), that proven the role of corneal sensation in epithelial healing progress In our study, the factors of limbal stem cells deficiency and hypopion were not clearly affected on the CLECs transplantation 4.3.3 Tissue-cultured CLECs preservation The advantages of CLECs were able to prepare and store for long time and ready to be use when we need without waiting like other cultivated autograft We evaluated the viablity of CLECs after months preservation in -80oC by two methods The trypan blue dying method showed more than 90% viable cells The re-cultured method showed CLECs grew rapidly after day Evaluating by microscopy showed 37/38 cells sheets in good condition There were almost no correlation between quality of the cells sheets and healing time, transplantation site as well as visual acuity postoperatively (r 0.05) 4.3.4 Operative procedure Advantages: 46 - Operative manipulations, that did not attache to CLECs, protected the cells sheets - The cultured procedure on Falcon well were similar to normal cultured procedure, and simpler than culturing on collagen shield with concave shape (like Parma’s procedure) - The fixation procedure was quite simple and able to in different medical centers - The ability of our fixation procedure was quite good Disadvantages: - The diameter of Falcon cultuted well bed (12-well plate) was 10 mm This size was not enough for large corneal defect, so in this situation we had to use – well plate type - The well bed was flat so it was to difficult to force 100% cells sheets on corneal surface, especilally when the defect was larger than 50% corneal area - Fixation cells sheets by two crossing Vicryl 8/0 sutures easily created subconjunctival haemorrhage, that made difficult to fix contact lens We usually used vasoconstriction eye drops to prevent this complication (adrenaline 0.1%) 4.3.5 Failure cases analysis - The first case: the mechanism of PED were complicated: nerotrophic keratopathy, ocular position changing, and eyelid – cornea system lost normal correlation (caused by VI nerve palsy) So this patient was cure with lateral tarsorrhaphy - The second case: got infection on healing procedure - The third case: severe dry eye of Sjogren syndrome (Schirmer I test = mm) Because of lacking of tear, the trasplated cells were not able to exist and work This eye was cured with punctal occlusion, autologous serum 50%, and steroid eye drop CONCLUSION The efficacy of the therapy - The transplantation of tissue-cultured CLECs successful treated 91.9% (34/37) PEDs cases with 83.8% (31/37) eyes in good treatment 47 - The transplantation sites were ameliorated after surgery and stable months postoperatively there are 83.3% (25/30 eyes) in good condition, 16.7% (5/30 eyes) in moderate condition at last checked follow-up time - Postoperative visual acuities of all eyes were better than its before surgery (p < 0.05) The visual acuities were steadily raised and become stable in months after surgery - The epithelial cells on transplantation site suface that were collected by impression cytology were like normal corneal epithelial cells in month, months, months postoperatively Remark some influence factors of this therapy - The original causes of the defect: Herpetic keratitis group got highest success rate, 100% (14/14 eyes) - The mechanisms of PEDs in our study were ocular surface inflammation and neurotrophic keratopathy - In combined diseases, dry eye and reduction of corneal sensation had the most involved relation to the success of the therapy + The correlation between tear secretion and the time of epithelial healing r = 0.36, and the condition of transplantation site r = -0.47, and visual acuity in months postoperatively r = 0.46 All of these correlation were statistically significant + The healing time of 14 eyes that were both redution of tear secretion and MGD was statistically higher than the other eyes + Others factors, such as hypopion, partial damaged limbus, were not clearly influenced the healing time - The time of epithelial defetc had statitiscally correlate to the healing time (r = 0.35) Moreover, this correlation was highest in Herpetic keratitis group (r = 0.69) - Six months preseved CLECs in -80oC are quality enough for transplatation RECOMMENDATIONS 48 - Enlarge the sample of the study to precisely evaluate the therapy of tissue-cultured CLECs transplantation - Transplant tissue-cultured CLECs in the group of PEDs wit total limbal stem cells deficiency - Find the more suitable cultured wells with softer scaffold, that will work in large size defect on the cornea - Create the standard protocol of CLECs cultivation, and clinical application procedure, so that this therapy could be used in different medical centers - Develop the extraction solution of CLECs and study the safety and efficacy of this solution in PED cases