3 bản chất quá trình lên men rượu

3.Bản chất trình lên men rượu 3.1.Một số nghiên cứu đầu tiên: Lên men rượu lôi nhà khoa học giới Vào kỉ 18, Blac cho sản phẩm lên men rượu C2H5OH CO2 Năm 1789, Lavoise thực số thí nghiệm cho thấy bên cạnh sản phẩm C2H5OH CO2 có số sản phẩm khác mà ông đặt tên acid acetic Theo ông, 95,5 % đường cho 57,7% C 2H5OH, 33,3%CO2 2,5% acid acetic Năm 1810, Tay Hussac nghiên cứu tỉ mỹ khám phá Lavoise, ông cho 45 phần đường glucose tạo 23 phần rượu C 2H5OH 22 phần CO2 Từ ông cho phương trình sau: C6H12O6 = 2C2H5OH + 2CO2 Năm 1853, Pasteur công bố kết nghiên cứu ông lên men rượu, theo ông 100 phần saccharose chuyển sang 105,4 phần đường nghịch đảo sau lên men cho 54,1 phần C 2H5OH 49,4 phần CO2, 3,2 phần glycerin, 0,7 phần acid sucenic phần sản phẩm khác Từ đó, người ta tính 45 phần glucose lên men rượu 21,8 phần C 2H5OH 23 phần Tay – Hussac tính Sau nhiều nhà khoa học sâu vào nghiên cứu trình lên men rượu giống vi sinh vật lên men, yếu tố kĩ thuật trình lên men 3.2.Bản chất trình lên men Lên men trình oxy hóa khử sinh học để thu lượng hợp chất trung gian Lên men rượu trình sinh hóa phức tạp, đòi hỏi phải có tham gia nấm men số vi sinh vật khác Trong trình lên men rượu, đường biến đổi thành rượu ethylic CO Quá trình lên men rượu kèm theo hình thành sản phẩm đồng thời giải phóng lượng Trong phản ứng lên men, đường chia cắt thành mạch cacbon để hình thành nên hợp chất carbon mạch ngắn Để thực hoạt động sống sinh trưởng, sinh sản phát triển mình, vi sinh vật đòi hỏi phải có lượng Lên men trình cung cấp lượng hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật Nhưng tế bào sống sử dụng lượng dạng lượng tàng trữ mạch cacbon giải phóng phản ứng enzyme chuyển electron từ mức lượng sang mức lượng khác Các phản ứng sinh hóa xảy trình lên men phản ứng chuyển hydro Nhưng chuyển hydro tương đương với chuyển electron, lẽ nguyên tử hydro tách thành proton H+ electron Các enzyme xúc tác trình tách nguyên tử hydro khỏi chất gọi enzyme dehydrogenaza Như vậy, lên men trình oxy hóa – khử có enzyme xúc tác hay nói cách khác trình oxy hóa – khử sinh học Trong trình đó, nguyên tử cacbon chất bị oxy hóa đến CO 2, nguyên tử hydro tách khỏi chất, chuyển đến NAD +, sau từ NADH2 điều kiện yếm khí hydro chuyển đến sản phẩm trung gian khác đến chất tiếp nhận tổng hợp nên nhằm mục đích đó, nghĩa để tái sinh lại NAD+ Tùy thuộc vào chất tiếp nhận hydro cuối mà phân biệt hô hấp lên men hô hấp yếm khí Lên men trình để thu lượng, qua hydro tách khỏi chất chuyển đến chất tiếp nhận cuối chất hữu Hợp chất hữu khử vào môi trường dinh dưỡng tích tụ lại Phụ thuộc vào sản phẩm tích tụ chiếm ưu sản phẩm đặc trưng mà người ta phân lên men rượu, lên men lactic hay lên men butyric,… Lên men khác với hô hấp yếm khí oxy hóa không hoàn toàn Hô hấp yếm khí tiến hành điều kiện oxy tham gia hydro lại chuyển qua mạch hô hấp mà đến chất tiếp nhận cuối nitrat sulfat 3.3.Cơ chế trình lên men rượu [3,5]: Lên men rượu trình sinh học phức tạp xảy tác dụng nhiều enzyme Theo lý thuyết đại tạo thành rượu từ glucose trải qua giai đoạn sau nay: 1./ Đầu tiên tác dụng xúc tác glucokinaza, đường gluco kết hợp với photphat phần tử ATP ( Andenozitri – Photphat) tế bào nấm men tạo thành gluco – photphat AND C6H12O6 + ATP  CH2O(H3PO3)(CHOH)4CHO + ATP 2./ Tiếp sau gluco- 6- photphat tác dụng enzym đồng phân glocophotphat-izomenaza biến thành fructophotphat CH2O(H3PO3)(CHOH)4CHO  CH2O(H3PO3)(CHOH)3COCH2OH 3./ Giai đoạn tác dụng enzym photphofuctokinaza phân tử ATP thứ hai sẽ đính thêm gốc photphat nửa vào fucto-6-photphat đđể tạo thành fucto-1-6-diphotphat phân tử ADN thứ hai CH2O(H3PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP  CH2O(H3PO3) (CHOH)3COCH2(H2PO3) + ADP Sự tạo thành fucto-1-6-photphat giai đoạn chuẩn bị lên men Giai đoạn thực chuyển hóa mối liên kết cao thành dạng dễ biến đổi tác dụng enzym 4./ Giai đoạn cuối xảy tác dụng xúc tác aldolaza phân cắt phân tử fuctodiphotphat thành phân tử trioza gồm aldehyt – photphoglyxeric photphodioxyaceton CH2O(H3PO3)(CHOH)3COCH2(H2PO3)CH2O(H3PO3)COCH2OH+ CH2O(H3PO3)CHOHCHO 5./ Vai trò chủ yếu biến đổi trình lên men rượu andehyt- diphotphoglycerin Nhưng dịch lên men chúng chứa ít, điều chứng tỏ có đồng phân tác dụng enzym triphotphat izomeraza CH2O(H3PO3)COCH2OH  CH2O(H3PO3)CHOHCHO 6./ Giai đoạn phân tử aldehyde photphatglycerin bị oxy hóa Phản ứng xảy có tham gia acidphotphorit Trong canh trường nhờ xúc tác enzym triphotphat dehydronaza Coenzym ADN (nicotiamitandenit-dinucleotic) CH2O(H3PO3)CHOHCHO + H3PO4 + NaDH  CH2O(H3PO3)CHOHCHO-H2PO3 + 2NaDH2 (1-3 diphotpho glyxerin acid) 7./ Giai đđoạn với tham gia photphatglyxerinkinaza gốc photphat cao 1- diphotphoglyxeric tạo thành chuyển vào phân tử ADP CH2O(H3PO3)CHOHCHO-H2PO3 + 2ADP  CH2O(H3PO3)CHOHCOOH + 2ATP 8./ Dứoi tác dụng photphoglyxeromutaza gốc acid chuyển từ vị trí cacbon thứ ba đến vị trí cacbon thứ hai 2CH2O(H3PO3)CHOHCOOH  2CH2OCHO (H3PO3) COOH 9./ Dưới tác dụng enolaza, acid 2-photphoglyceric nước biến thành acid photphopyruvic 2CH2OCHO (H3PO3) COOH  2CH2CO(H3PO3) COOH + 2H2O 10./ Acid phophopyruvic không bến dễ bị gốc acid photphoric enzym pyrovackinaza acid pyruvic tạo thành 2CH2=CO-(H3PO3)COOH + 2ADP = 2CH3CO-COOH + 2ATP 11./ Tới acid pyruvic bị decacbonxyl đđể tạo thành aldehyde acetic 2CH3COCOOH  2CO2 + 2CH3CHO 12./ Giai đoạn cuối lên men rượi aldehyt acetic bị khử NADH2 2CH3CHO + 2NaDH2  2CH3CH2OH + 2NAD Phương trình tổng quát lên men rượu sau: C6H12O6  2CO2 + 2C2H5OH Trong trình lên men rượu phần tử gam glucose giải phóng khoảng 50Kcal Năng lượng nấm men sử dụng chừng 20Kcal Số lại thải canh trường làm tăng nhiệt độ dịch lên men Hình 1.24: Sơ đồ trình lên men rượu Sản phẩm phụ sản phẩm trung gian trình lên men: Trong trình lên men sản phẩm cồn etylic CO tạo nhiều chất khác Bằng phương pháp phần tích sắc kí người ta có 500 chất khác Nhưng xếp vào nhóm chính: acid, esste, andehyt, alcol ( bao gồm rượu bậc thấp lẫn rượu bậc cao dầu fusel)  Sự tạo thành acid: Trong trình lên men rượu thường tạo acid hữu như: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic,… chiếm chủ yếu acid acetic acid lactic • Acid Acetic: tạo thành từ phản ứng oxy hóa aldehyt acetic CH3CHO + CH3CHO + 2H2O  CH3COOH + 2C2H5OH • Acid Lactic: đđược tạo pyrovicdehydronaza theo phản ứng CH3CO-COOH + 2NaDH2  CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc: CH2O(H2PO3)CHOHCHO + CH3CHOHCOOH + H3PO4 • Acid Citric: tạo thành từ aldehyt acetic theo phản ứng sau: 9CH3CHO + 4H2O  (CH2COOH)2 + COH- COOH + 6C2H5OH • Acid Succinic: tạo thành theo đường dehydro trùng hợp hai phân tử acid acetic với phân tử aldehytacetic CH3COOH + CH3CHO  COOHCHCH2COOH + C2H5OH  Glycerin Aldehyt: sản phẩm trung gian lên men rượu điều kiện lên men rượu điều kiện lên men nhằm mục đích thu alcol etylic Người ta khống chế pH lên men giới hạn 4,5 ÷ 5,2 với điều kiện lượng glycerin tạo thành chiếm 0,3 ÷ 0,45 tương ứng ÷ % lượng đường ban đầu Nếu tăng pH tới kiềm lượng glyxerin đạt 23,4 % lượng aldehyt chưa chuyển thành rượu đạt 11,9% Dựa vào tính chất để tạo thành glycerin Người ta dùng natrisunfit cho vào canh trường lên men nhằm điều chỉnh sản phẩm tạo thành Tóm lại: tùy theo điều kiện môi trường lên men xảy theo kiểu khác Lên men rượu bình thường: C6H12O6  2CO2 + 2C2H5OH Lên men rượu cho thêm Na2S2O3 C6H12O6  CH3CHO + C3H8O3 + CO2 Lên men ruọu môi trường kiềm: C6H12O6  2CO2 + CH3COOH + C2H5OH + C3H8O3  Sự tạo thành Alcol cao phân tử: Một sản phẩm phụ quan trọng tạo thành trình lên men rượu có số nguyên tử cacbon lớn hai là: aldol propylic, izobutylic, izoamylic, imylic, Hàm lượng chúng vào khoảng 0,4 ÷ 0,5% so với cồn etylic, chúng ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm gây cho sản phẩm có mùi khó chịu Các aldol có tên chung dầu Fusel hay gọi dầu khét Nguyên nhân hình thành dầu Fusel nấm men sử dụng nitơ acid amin trình sinh trưởng tạo thành Phương trình tổng quát hình thành alcol cao phân tử đơn giản theo phản ứng sau: R-CH-COOH + H2O RCH2OH + NH3 +CO2 NH2 Nhiều nhà nghiên cứu cho thấy tạo thành alcol cao phân tử phụ thuộc vào cấu trúc hàm lượng acid amin có dịch lên men  Sự tạo thành este: Song song với việc tạo thành acid aldol tác dụng enzym estaraza nấm men acid aldol tác dụng lẫn để tạo thành este tương ứng viết dang tổng quát sau: R1CH2OH + R2COOH  R2COO-CH2R1 + H2O 3.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men rượu 3.4.1.Nhiệt độ: Mỗi vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu cho phát triển chúng Đối với nấm men Saccharomyces nhiệt độ tối ưu nằm giới hạn 28 ÷ 320C Khi lên men nhiệt độ thấp khả lên men kéo dài Nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường ban đầu xuống tới 20 ÷ 220C để hạn chế phát triển tạp khuẩn Sau – 10 nhiệt độ môi trường tăng tới mức tối thích 28 ÷ 300C Tiếp làm lạnh để ổn định nhiệt độ giới hạn tối ưu Nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men giảm nhanh chủ yếu dễ nhiễm vi khuẩn lactic nấm men dại Ở nhiệt độ 30 0C nấm men dại phát triển nhanh nấm men Saccharomyces, nhiệt độ cao 35 ÷ 38 0C chúng phát triển nhanh ÷ lần Mặt khác lên men nhiệt độ cao tạo nhiều sản phẩm phụ este, aldehyt tổn thất rượu theo CO2 tăng 3.4.2.pH môi trường: Nồng độ ion H+ môi trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động nấm men, chúng có khả làm thay đổi điện tích chất vỏ tế bào, làm tăng giảm mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng chất lượng lên men Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt trạng thái ion định Trạng thái lại phụ thuộc vào pH môi trường Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành alcol etylic 4,5 ÷ 5,2 Nếu tăng pH cho môi trường lên men lúc môi trường đễ bị nhiễm khuẩn Glycerin tạo thành nhiều giảm hiệu suất lên men Ở pH nhỏ 4,2 nấm men phát triển chậm so với 4,5 ÷ 5,2 tạp khuẩn không phát triển Trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3,8 ÷ 4,0 để hạn chế phát triển vi khuẩn vi khuẩn lactic nấm men dại, lúc nấm men đủ mạnh để lấn áp tạp khuẩn thường làm tăng pH đến khoảng tối thích 3.4.3.Nồng độ dịch lên men (nồng độ đường) Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất thẩm thấu làm cân trạng thái sinh lý nấm men Kết l ml độ rượu cao ức chế tạp khuẩn mà ức chế nấm men Mặc khác nồng độ đường cao dẫn đến tổn thất kéo dài thời gian lên men Ngược lại nống độ dịch đường ban đầu thấp không kinh tế làm giảm hiệu suất thiết bị lên men, tốn lượng chưng cất tăng tổn thất rượu bả nước thải Bình thường người ta khống chế hàm lượng nồng độ chất khô dịch đường ban đầu từ 16 ÷ 180Bx ( tùy theo mức độ khiết) Tương đương với 13 ÷ 15% đường để sau len men nhận nồng độ rượu dịch dấm chín 8,5 ÷ 9,5%V 3.4.4.Nồng độ cồn etylic: Rượu tạo trình lên men tác động ngược lại đến cường độ lên men Thông thường nấm men lên men tới nồng độ đạt 12 ÷ 14% V Một số nấm men đạt 17÷ 20%V Với nồng độ cao ức chế nấm men gần đình lên men rượu Với nồng độ rượu đạt 4,5%V bắt đầu ảnh hưởng đến phát triển sinh sản nấm men Khi nồng độ đạt đến 5%V sinh sản bắt đầu ngưng trệ, lên tới 7÷8% V bắt đầu kết thúc giai đoạn lên men mạnh bắt đầu giai đoạn lên men chậm ( lên men phụ) 3.4.5.Thời gian lên men: Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men Thời gian lên men tính từ lúc cấy giống vào môi trường trải qua giai đoạn sinh sản, sinh trưởng, lên men … Người ta chưa xác định rõ trình lên men kết thúc Thông thường người ta chia thành giai đoạn lên men - Giai đoạn lên men chính: giai đoạn kết thức nếm dịch lên men không vị đường hay quan sát thấy khả tạo bọt yếu - Giai đoạn lên men phụ: giai đoạn ủ chín tàng trữ, tính từ lúc bắt đầu kết thúc trình lên men thường kéo dài vài tháng trở lên 3.4.6.Nồng độ O2 môi trường: Nấm men loại vi sinh vật hô hấp tùy tiện, môi trương yếm khí lên men để tạo rượu CO2, điều kiện đủ O có khả oxy hóa dường thành CO2 H2O, đồng thời sinh sản phát triển mạnh, kìm hãm lên men O2 hay gọi hiệu ứng “Pasteur” Do việc sản xuất rượu vang giai đoạn đầu cần tạo điều kiện hiếu khí nấm men phát triển, sinh sản đủ số lượng tế bào cần thiết cho trình lên men Sau phải yếm khí tuyệt đối cho nấm men chuyển hóa đường 3.4.7.Nồng độ CO2 tạo thành: Khí CO2 tạo thành trình lên men rượu từ dịch đường Một phần tồn môi trường, phần tách bên bề mặt môi trường, phần tích tụ lại làm lớp ngăn cản không khí môi trường Khí CO tích tụ lại môi trường làm giảm khả sinh sản nấm men không làm yếu khả lên men chúng Theo Mike Hugar với nồng độ 0,25% trọng lượng CO môi trường làm ức chế sinh sản nấm men Cũng theo Smitener sinh sản nấm men ngừng nồng độ CO2 môi trường lên đến 4,5% trọng lượng, tương ứng với áp suất 7,7 bar 150C Khi môi trường chứa hàm lượng đường cao cản trở CO thoát ngoài, ức chế sinh sản nấm men dẫn đến hiệu suất thấp Khí CO2 nằm khoảng không gian môi trường không khí có tác dụng kìm hãm phát triển vi sinh vật 3.4.8.Ảnh hưởng số hóa chất chất sát trùng: Trong điều kiện sản xuất dù vệ sinh có đến đâu khó bảo đảm vô trùng tuyệt đối cần phải sử dụng số hóa chất sát trùng để hạn chế ngăn ngừa vi khuẩn Tùy theo chất lượng hóa chất sử dụng nhiều hay cho hạn chế phát triển tạp khuẩn không ảnh hưởng đến hoạt động nấm men Khi dùng formalin hay fluosilicac natri nồng độ không vượt 0,02% so với dịch lên men Bảng1.8 :Ảnh hưởng số acid tới nấm men Chất Ngừng sinh Acid clohidric Acid sulfuric Acid phosphoric Acid acetic Acid lactic trưởng % Mol 0,14 0,038 0,34 0,039 0,30 0,031 0,75 0,125 0,40 0,100 Nồng Độ Tiêu diệt men % 0,72 1,30 2,00 3,00 3,00 Mol 0,195 0,132 0,204 0,500 0,333 Thời gian làm tê liệt Giờ 0,46 2,04 1,28 1,25 1,27 Ngoài chất kể dịch đường lên men chứa lượng furforol, melanoidin ảnh hưởng đến nấm men ♦ Furforol: có nhiều mật rỉ, khoảng 6÷ mg/100g chất khô Nhưng pha loãng đến nồng độ 20 ÷ 22% nổng độ furforol khoảng 1,5÷ 2,0 mg/100ml hay 0,015 ÷ 0,02% ảnh hưởng furforol xem không đáng kể ♦ Melanoidin: ảnh hưởng trình nhân giống nấm men Melanoidin không hấp thu bề nặt nấm men với nồng độ 0,005% làm nhiều tế bào bị chết