Sáng kiến kinh nghiệm kết quả bước đầu chuyển gen vào cây hoa đồng tiền

KT QU BC U CHUYN GEN VO CY HOA NG TIN Gerbera jamesonii "FERRARI" NH VI KHUN Agrobacterium tumefaciens Initial results of gene transfer into Gerbera jamesonii Ferrari via Agrobacterium tumefaciens Nguyn Quang Thch1, Nguyn Th Lý Anh, Nguyn Th Thanh Phng, inh Trng Sn, V Ngc Lan, Trn Ngc Tuõn Trn Th Cỳc Hũa2, Phm Ngc Thch SUMMARY This study have verified some parameters and established the protocol for gene transferring in Gerbera (Ferrari variety) The concentration of cefotaxime to kill the bacteria in the medium was 500 mg l-1 The concentration of PPT using for Gerbera callus selection was 2.5 mg l-1 and the PPT concentration using for selecting the transgenic plants was 3mg l-1 The co cultivation medium for bacteria and callus was mixed following Murashige and Skoog (1962), one little with amount of 30g sucrose, 10g glucose, 2mg BA, 0.3 mg kinetin, 0.1mg IAA, 1g cassamino acid, 20mg AS and 7.0 g agar The pH of the solution was adjusted to 5.4 The protocol for gene transformation was established and two clones of gerbera were multiplied after selecting on the medium supplemented with PPR at 3.0 mg l-1 The electrophoresis results of PCR products with detected nos terminator primer pairs showed the gene was cloned using DNA template extracted from leaf tissue of the gerbera clones This result confirmed the present of the target genes in the two regenerated clones selected after transformation Key words: Gerbera Agrobacterium, transgenic plants M U Nghiờn cu to ging bng cỏc phng phỏp chuyn gen hin ó thu c rt nhiu thnh cụng cỏc phũng thớ nghim trờn th gii Mt s nghiờn cu v chuyn gen ó c trin khai nghiờn cu nc ta Tuy nhiờn, hu ht cỏc nghiờn cu u trung vo mt s i tng cõy thc phm hoc cõy cụng nghip nh: lỳa, ngụ, c chua, bp ci, u , bụng vi (ng Trng Lng, 2001), (Lờ Trn Bỡnh, 2005) Cỏc nghiờn cu v chuyn gen trờn i tng hoa cõy cnh cỳc ca Vin Sinh hc Nhit i Thnh ph H Chớ Minh Hoa ng tin l mt nhng loi hoa ph bin trờn th gii, c s dng lm hoa chu, hoa ct cnh, hoa trng cnh (Teresa, Elzbieta, Danuta, 1999) nc ta, hoa ng tin c trng khỏ ph bin, cú giỏ tr kinh t cao v c bit l hoa ng tin cú th hoa vo thi v hố ngoi Bc l thi gian him hoa nm (Nguyn Quang Thch, 2002) Chớnh vỡ vy, vic Vin Sinh hc Nụng nghip - i hc Nụng nghip I H Ni Vin Lỳa ng bng sụng Cu Long ễmụn - Cn Th cũn ớt c quan tõm Mi ch cú cụng trỡnh cụng b v chuyn gen cho cõy hoa nghiờn cu to ging hoa ng tin bng k thut chuyn gen s gúp phn to c ngun vt liu ban u phc v cụng tỏc chn to ging ng tin cú cỏc c tớnh mong mun VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU - iu kin ng nuụi cy: nhit 240C, che ti, nuụi cy 48 - 72 gi - Phng phỏp xỏc nh s biu hin ban u ca gen gus theo Jefferson (1987) - Phng phỏp PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.1 Vt liu - Gerbera jamesonii Ferrari - S dng vi khun chng EHA105 mang vector ITB2c mang cỏc gen gus, bar, cryIAc Vin sinh hc Nhit i TPHCM - VKHVN cung cp 2.2 Phng phỏp nghiờn cu - S dng cỏc bin phỏp nghiờn cu nuụi cy mụ hin hnh - S dng phng phỏp chuyn gen nh vi khun Agrobacterium tumefaciens - Mụi trng tỏi sinh chi ng tin: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 2mg/l BA, 0.3mg/l kinetin, 0,1mg/l IAA, 2g/l phytagel, pH = 5,4 - Phng phỏp nuụi cy vi khun - Chun b dch vi khun trc lõy nhim: vi khun c nuụi cy trờn mụi trng lng LB (V Nagaraju, 1998) (200 vũng/phỳt, 24 gi) Dch vi khun c ly tõm ly sinh t bo vi khun tc 5000 vũng/phỳt phỳt iu kin nhit phũng v c pha mụi trng pha loóng - Phng phỏp vi khun: Vi khun c nhanh t 3-5 ln bng nc ct vụ trựng hoc mụi trng MS vụ trựng - Phng phỏp nhim mu vi vi khun: Mu cy callus c ngõm dung dch vi khun vi thi gian phỳt, vt ra, khụ trờn giy thm vụ trựng sau ú c cy lờn mụi trng ng nuụi cy Hỡnh ng tin Ferrari Hỡnh S cu trỳc plasmid ITB2c KT QU NGHIấN CU V THO LUN 3.1 Nhúm thớ nghim tin chuyn gen Trong quy trỡnh chuyn gen nh vi khun A.tumefaciens, vic b sung khỏng sinh tin hnh dit vi khun A.tumefaciens cú th nh hng n kh nng tỏi sinh [Purnima, Kothari, 2004], [Nagaraju, Sita, 1998], [Hoshi & cs, 2004] Bờn cnh ú, cng cn xỏc nh c ngng cú tỏc dng gõy cht 100% ca cht chn lc lm c s cho chn lc Chớnh vỡ th, chỳng tụi tin hnh xỏc nh nh hng ca cỏc yu t trờn n kh nng tỏi sinh ca vy c lily Siberia S nh hng ca khỏng sinh cefotaxime n t l sng v kh nng tỏi sinh ca mụ cõy ng tin c th hin b sung khỏng sinh cefotaxime t nng 300 n 700ppm cho t l sng ca callus t 100% trờn tt c cỏc cụng thc iu ú cho thy callus cú kh nng sng rt mnh mc dự ó b c ch bi khỏng sinh cefotaxime Khỏng sinh cefotaxime ó c ch s sinh trng ca cỏc chi tỏi sinh v rừ rng l ó nh hng ti cht lng ca chi tỏi sinh iu ny c th hin rừ qua cỏc ch tiờu sinh trng, phỏt trin nh: chiu cao chi tỏi sinh ó gim t 2,8cm (cụng thc khụng b sung) xung cũn 2,3cm (cụng thc b sung 600ppm); s lỏ gim t 3,5 (cụng thc khụng b sung) xung 1,6 lỏ/chi (cụng thc b sung 600ppm), bờn cnh ú, chi tỏi sinh nh, thp, mu xanh nht hi vng (bng 1) Nh vy, i vi ngun mu cy l callus ng tin ging Ferrari, cú th s dng khỏng sinh cefotaxime nng n 500mg/lớt dit vi khun Agrobacterium tumefaciens Bng nh hng ca khỏng sinh cefotaxime n t l sng v kh nng tỏi sinh ca callus cõy ng tin (theo dừi sau tun) CT cefotaxime ng hng tỏi sinh Tng trng ca chi tỏi sinh Hỡnh thỏi mu T l mu To callus To r To chi Chiu cao chi S lỏ/chi cy v chi tỏi sng (%) sinh (%) (%) (%) (cm/chi) (lỏ) CT1 100 100 100 2,8 3,5 +++ CT2 300 100 100 90,2 2,8 2,8 +++ CT3 400 100 100 75,3 2,5 2,2 ++ CT4 500 100 100 58,2 2,5 2,0 ++ CT5 600 100 100 28,9 2,3 1,6 + CT6 700 100 100 0 Ghi chỳ: Mụi trng nuụi cy: MS, 30g sucrose/l, 10g gluco/l, 2mg BA/l, 0.3mg kinetin/lớt, 0,1mgIAA/l, 7g thch agar/l, pH = 5,4 +++: Mu cy xanh, chi tỏi sinh sinh trng tt, mu xanh, hỡnh thỏi bỡnh thng ++: Mu cy l callus hi vng, chi tỏi sinh sinh trng chm, lỏ cú mu xanh hi nht, chi nh +: Mu cy l callus mu vng, chi tỏi sinh sinh trng kộm, chi nh, thp, mu xanh vng Bng nh hng ca PPT n kh nng tỏi sinh ca callus ng tin ging Ferrari (theo dừi sau tun) CT PPT (ppm) ng hng tỏi sinh Tng trng ca chi tỏi sinh T l mu To callus To r To chi Chiu cao chi sng (%) S lỏ/chi (lỏ) (%) (%) (%) (cm/chi) Hỡnh thỏi mu cy v chi tỏi sinh CT1 100 100 100 2,5 3,2 +++ CT2 0,5 100 100 80 2,5 2,5 ++ CT3 1,0 100 100 100 2,0 2,0 ++ CT4 1,5 80 80 60 1,3 1,3 ++ CT5 2,0 30 30 10 0,8 1,2 + CT6 2,5 0 0 0 CT7 3,0 0 0 0 Ghi chỳ: Mụi trng nuụi cy: MS, 30g sucrose/l, 10g gluco/l, 2mg BA/l, 0,3mg kinetin/lớt, 0,1mgIAA/l, 7g thch agar/l, pH = 5,4 +++: Mu cy xanh, chi tỏi sinh sinh trng tt, mu xanh, hỡnh thỏi bỡnh thng ++: Mu cy l callus cú mu en, chi tỏi sinh sinh trng chm, lỏ vng, cú biu hin mt mu dip lc, chi nh +: Mu cy en, ban u cú tỏi sinh to chi, sau tỏi sinh - tun cỏc lỏ ca chi tỏi sinh xut hin cỏc im cht Cht chn lc PPT ó cú nh hng rt xu ti t l sng ca callus Nng PPT cng cao cng c ch s tỏi sinh ng thi gõy cht mu cy B sung PPT nng 2,5mg/lớt ó gõy cht 100% mu cy l callus PPT ó gõy c rt mnh i vi cỏc chi tỏi sinh Mu cy hon ton khụng cú kh nng tỏi sinh to r, cỏc chi tỏi sinh ban u cú mu vng sau ú mt mu dip lc, tip n l xut hin cỏc im cht trờn u mỳt lỏ (bng 2) Do vy, cú th s dng nng PPT mc 2,5mg/lớt cho callus ó c chuyn gen khỏng PPT Hỡnh Chi ng tin trờn mụi trng chn lc bng PPT Bng nh hng ca cht chn lc PPT n kh nng sng ca cõy ng tin in vitro (kt qu theo dừi sau tun) CT PPT (ppm) ng hng tỏi sinh Tng trng ca chi tỏi sinh T l mu To callus To r To chi Chiu cao chi sng (%) S lỏ/chi (lỏ) (%) (%) (%) (cm/chi) Hỡnh thỏi mu cy v chi tỏi sinh CT1 100 100 100 2,8 3,5 +++ CT2 0,5 100 0 100 2,1 2,9 ++ CT3 1,0 100 0 100 1,3 2,0 + CT4 1,5 40 0 40 1,0 2,0 + CT5 2,0 30 0 30 1,0 2,0 + + CT6 2,5 10 0 10 1,0 2,0 CT7 3,0 0 0 0 Ghi chỳ: Tiờu chun chi thớ nghim: sinh trng bỡnh thng, cao 1cm, cú lỏ Mụi trng nuụi cy: mụi trng MS +++: Chi xanh, sinh trng tt, hỡnh thỏi bỡnh thng ++: Chi sinh trng chm, nh, lỏ vng, cú biu hin mt mu dip lc +: Chi sinh trng chm, ban u b vng lỏ sau ú xut hin cỏc im cht ti u mỳt lỏ PPT ó cú nh hng rt sõu ti t l sng ca cõy ng tin B sung PPT t nng - 3,0mg/lớt ó lm gim t l sng ca cõy ng tin t 100% xung 0% (cụng thc b sung 3ppmPPT) ng thi, PPT cú tỏc dng c ch rt mnh kh nng sinh trng ca cõy ng tin Ngay cụng thc (cụng thc b sung 1,0 mg PPT/lớt) mc dự t l sng t 100% nhng gn nh s sinh trng ca cõy ng tin ó b ngng hn, chiu cao ch tng 0,3cm, s lỏ khụng tng sau tun nuụi cy Mu cy hon ton khụng cú kh nng sinh trng trờn cỏc cụng thc b sung PPT nng t 1,5 - 2,5mg/lớt nng ny ó lm ngng hn s sinh trng v chiu cao, s lỏ, phn gúc chỡm mụi trng b en, nhiu lỏ b vng Nng PPT mc 3,0ppm l nng gõy cht 100% i vi cõy ng tin in vitro Vỡ vy cú th s dng nng PPT mc 3,0ppm tr lờn lm nng dựng cho chn lc cỏc cõy ng tin ó c chuyn gen khỏng PPT iu kin nuụi cy in vitro 3.2 Cỏc thớ nghim chuyn gen Bng nh hng ca thi gian tin nuụi cy mu, phng phỏp lõy nhim n s sinh trng ca vi khun Agrobacterium trờn mt s ging ng tin (theo dừi sau ng nuụi cy ngy) STT Phng phỏp lõy nhim Nh git T l sng ca mu cy (%) Ngõm + + Xut hin vi khun Khụng Cú 100 + 100 + Khả chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens phụ thuộc nhiều vào đối tợng trồng, nguồn mẫu lây nhiễm Một số trình sinh trởng sản sinh phytoxic chất có khả ức chế sinh trởng mạnh vi khuẩn [Hoshi & cs, 2004] Khi đợc đồng nuôi cấy với callus đồng tiền Ferrari, sinh trởng vi khuẩn A.tumefaciens mạnh không phụ thuộc vào phơng pháp lây nhiễm (bảng 4) Rõ ràng, đối tợng đồng tiền, vi khuẩn Agrobacterium dễ dàng sinh trởng phát triển mạnh Đây thuận lợi cho trình lây nhiễm nhng lại khó khăn giai đoạn Thông thờng, vi khuẩn sinh trởng phát triển mạnh trình đồng nuôi cấy, trình phục hồi nh chọn lọc sau khó khăn để loại bỏ đợc vi khuẩn 3.3 Biểu gen gus biểu gen kháng PPT Các kết chọn lọc tái sinh đồng tiền sau chuyển gen đợc thể bảng Bng Kt qu chn lc trờn i tng hoa ng tin ging Ferrari Cụng thc S cõy tỏi sinh S mu cy S mu T l tỏi sinh cõy Hỡnh thỏi T l mu sau chn lc chn lc cht sau chn lc (%) cõy tỏi sinh cht (%) (cõy) (mu) (mu) i chng (khụng ng nuụi 30 cy vi vi khun) 30 100 0 Chuyn gen (ng nuụi cy vi 770 vi khun) 668 99,84 0,26 Ghi chỳ: chn lc trờn mụi trng cú b sung 3mg PPT/lớt Bỡnh thng Hỡnh S tỏi sinh trờn mụi trng chn lc v s biu hin ca gen gus trờn callus ng tin Hỡnh Kt qu in di sn phm PCR bng on mi phỏt hin nos teminator Ghi chỳ: G1: dũng ng tin chuyn gen 1, G2: dũng ng G: cõy ng tin Ferrari cha chuyn gen, Nc: nc ct ln vụ trựng, Kt qu bng cho thy: 100% mu cy trờn cụng thc i chng u cht sau chn lc iu ú chng t tỏc ng gõy cht ca PPT i vi cõy ng tin Trờn cụng thc cú ng nuụi cy vi vi khun tin chuyn gen 2, Agrobacterium, ó thu c hai cõy ng tin tỏi sinh sinh trng tt v cú hỡnh thỏi bỡnh thng Rừ rng, ó cú s thay i v kh nng khỏng PPT, c th l tng kh nng khỏng PPT ca cõy ng tin tỏi sinh Kt qu trờn cho phộp tm thi kt lun hai cõy ng tin ú ó c chuyn gen bar l gen khỏng PPT Kt qu in di sn phm PCR vi cp mi phỏt hin nos terminator cho thy ó nhõn c on gen ny t ADN khuụn tỏch chit t mụ lỏ ca hai cõy ng tin Ferrari chuyn gen Kt qu ny cho phộp khng nh s hin din ca gen chuyn vo dũng ng tin chn lc c sau chuyn gen KT LUN Mt s cỏc thụng s quy trỡnh chuyn gen cho cõy ng tin Ferrari nh vi khun Agrobacterium tumefacien ó c xỏc nh Cht khỏng sinh cefotaxime b sung vo mụi trng nuụi cy dit vi khun Agrobacterium tumefaciens c xỏc inh nng 500mg/lớt Nng PPT dựng cho chn lc l 2,5mg/lớt cho callus v 3,0ppm tr lờn c dựng lm nng cho chn lc cỏc cõy ng tin ú c chuyn gen khỏng PPT iu kin nuụi cy in vitro Mụi trng ng nuụi cy vi khun v callus ng tin l: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 2mg/l BA, 0,3mg/l kinetin, 0,1mg/l IAA, 1g/l cassamino acid, 20mg/l AS, 7,0 gram agar/lớt pH = 5,4 Sau chn lc ln, ó cú s biu hin ca gen gus callus ng tin Ferrari Trờn mụi trng cú b sung PPT nng 3,0 mg/lớt, ó tỏi sinh c cõy ng tin sau chn lc Kt qu in di sau nhõn on gen nos cho phộp khng nh ó thu c hai cõy ng tin chuyn gen TI LIU THAM KHO ng Trng Lng (2001) Nghiờn cu ỏp dng k thut chuyn gen nh vi khun Agrobacterium tumerfacien nhm gúp phn to vt liu chn ging bp ci khỏng sõu Vit Nam Lun ỏn tin s nụng nghip Trang 9- 13 Lờ Trn Bỡnh (2005) Nghiờn cu ỏp dng cụng ngh gen to cõy chuyn gen nõng cao sc chng chu i vi sõu bnh v ngoi cnh bt li Bỏo cỏo tng kt khoa hc v k thut ti trang 9-15 Nguyn Quang Thch, Nguyn Th Lý Anh, Hong Th Nga, Nguyn Th Phng Hoa (2002) Nghiờn cu quy trỡnh nhõn nhanh cõy hoa ng tin Bỏo cỏo tng kt ti, 2002 Purnima Tyagi and S L Kothari, (2004) Rapid in vitro regeneration of Gerbera jamesonii from different explants Indian Journal of Biotechnology Vol 3, October 2004, pp 584-588 Teresa Orlikowska, Elzbieta Nowak, Agnieszka Marasek, Danuta Kucharska (1999) Effects of growth regulators and incubation period on in vitro regeneration of adventitious shoots from gerbera petioles, Plant Cell Tissue and Organ Culture V Nagaraju, G.S.L.Srinivas v G.Lakshmi Sita (1998) Agrobacterium-mediiated genetic transformation in Gerbera hybrida Current science, Vol.74, No.7,10 April 1998 Y.Hoshi, M.Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashi, (2004) Production of transgenic lily plants by Agrobacteriummediated transformation, Plant Cell Rep (2004) 22: trang 359-364