Nghiên cứu chế tạo bộ panel ứng dụng trong đánh giá độ nhạy của kỹ thuật realtime RT PCR chẩn đoán virus ebola

VIN I HC M H NI KHOA CễNG NGH SINH HC KHểA LUN TT NGHIP ti: NGHIấN CU CH TO B PANEL NG DNG TRONG NH GI NHY CA K THUT REALTIME RT-PCR CHN ON VIRUS EBOLA Ngi hng dn:TS Hong Xuõn S Sinh viờn thc tp: Nguyn Thựy Linh Lp: 12-01 - Khoa cụng ngh sinh hc H NI - 2016 i LI CM N hon thnh c khúa lun ny, u tiờn, em xin trõn trng gi li cm n n Tin s Hong Xuõn S ó tn tỡnh giỳp , ch bo v hng dn em sut quỏ trỡnh hc tp, nghiờn cu ti Trung tõm nghiờn cu Y Dc hc Quõn s - Hc vin Quõn y Em xin chõn thnh cm n Tin s H Hu Th, Thc s inh Th Thu Hng, c nhõn Phm Vn Quyn cựng cỏc thy cụ v nhõn viờnphũng Vi sinh vt v cỏc mm bnh sinh hc, phũng Cụng ngh gen v di truyn t bo Trung tõm nghiờn cu Y Dc hc Quõn s - Hc vin Quõn y ó nhit tỡnh giỳp em quỏ trỡnh nghiờn cu v thc hin ti ny Em xin gi li cm n n cỏc thy, cụ giỏo ti khoa Cụng ngh sinh hc - Vin i hc M H Ni ó ht lũng ging dy kin thc cho em quỏ trỡnh hc v nghiờn cu ti trng Cui cựng, em xin gi li cỏm n ti b m ó sinh thnh, nuụi nng, giỳp v ng viờn giỳp em trung thc hin v hon thnh c khúa lun ny Trong quỏ trỡnh thc cng nh hon thnh khúa lun, kin thc v kinh nghim cũn hn ch nờn em khú trỏnh sai sút, rt mong nhn c ý kin úng gúp ca cỏc thy, cụ khúa lun ca em c hon chnh hn H Ni, ngy 20 thỏng 05 nm 2016 Sinh viờn Nguyn Thựy Linh ii MC LC DANH MC CH VIT TT DANH MC BNG DANH MC HèNH NH M U PHN - TNG QUAN TI LIU 1.1 Tỡnh hỡnh v dch bnh Ebola 1.1.1 Tỡnh hỡnh dch bnh Ebola trờn th gii 1.1.2 Tỡnh hỡnh dch bnh ti Vit Nam 1.2 Gii thiu virus Ebola 15 16 1.2.1 Phõn loi 16 1.2.2 c im hỡnh dng, cu trỳc h gen 17 1.3 Cỏc triu chng, ng lõy truyn v bin phỏp phũng bnh 18 1.3.1 Cỏc triu chng 18 1.3.2 Con ng lõy truyn 19 1.3.3 Bin phỏp phũng bnh 21 1.4 Cỏc phng phỏp chn oỏn xột nghim virus Ebola 23 1.4.1 Phng phỏp huyt hc 23 1.4.2 Phng phỏp sinh hc phõn t 24 1.5 Hiu bit v panel 26 1.5.1 Khỏi nim 26 1.5.2 Cỏc loi panel 26 1.6 K thut PCR 27 iii 1.6.1 Nguyờn lý 27 1.6.2 Cỏc yu t nh hng n phn ng PCR 27 1.6.3 Cỏc giai on ca phn ng PCR 29 PHN - PHNG PHP NGHIấN CU 30 2.1 Vt liu, húa cht v trang thit b 30 2.1.1 Vt liu, sinh phm, húa cht 30 2.1.2 Dng c v trang thit b 31 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 32 2.2.1 K thut phn ng PCR 32 2.2.2 To vector tỏi t hp cha gen NP ca virus Ebola 33 2.2.3 K thut tỏch v tinh sch plasmid 34 2.2.4 K thut ct enzyme gii hn 36 2.2.5 K thut gii trỡnh t gen 37 2.2.6 K thut phn ng realtime RT-PCR 38 2.3 a im, thi gian nghiờn cu 42 2.3.1 Thi gian nghiờn cu 42 2.3.2 a im nghiờn cu 42 PHN - KT QU V BN LUN 3.1 Nhõn dũng gen NP ca virus Ebola chng Zaire 43 43 3.1.1 Kim tra plasmid cha gen NP bng PCR 43 3.1.2 Thit lp h vector tỏch dũng mang gen NP 43 3.1.3 Kim tra plasmid mang gen mó húa cho NP 44 3.2 Tng hp ARN in-vitro 3.2.1 Tng hp mu i chng ARN 46 46 iv 3.2.2 Tng hp ARN ca virus Ebola 3.3 Xõy dng b panel nhy 3.3.1 Xõy dng b panel nhy 47 48 48 3.3.2 ỏnh giỏ ngng phỏt hin k thut realtime RT-PCR chn oỏn virus Ebola trờn b panel nhy 51 PHN - KT LUN V KIN NGH 52 4.1 Kt lun 52 4.2 Kin ngh 52 TI LIU THAM KHO 53 v DANH MC CH VIT TT ADN acid deoxyribonucleic ARN acid ribonucleic bp Base pair BEBOV Bundibugyo cADN complementary acid deoxyribonucleic CDC Center for Disease Control and Prevention CIEBOV Cụte dIvore dNTP 3-deoxyribonucleotide-5-triphosphate dATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate ddNTP dideoxynucleotide E.Coli Escherichia Coli ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay GP Glycoprotein kb kilobase L Polymerase ARN NAT Nucleic acid amplification NIBSC National Institute for Biological Standards and Control NP nucleoprotein PCR Polymerase Chain Reaction REBOV Reston ebolavirus RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction sGP Solute Glycoprotein SEBOV Sudan ebolavirus VP24 virion protein 24 VP40 virion protein 40 VP30 virion protein 30 VP35 virion protein 35 WHO World Health Organization ZEBOV Zaire ebolavirus àl Micro lớt DANH MC BNG Bng Cỏc v dch virus Zaire 12 Bng Cỏc v dch virus Sudan 14 Bng Cỏc v dch virus Cụte dIvore 14 Bng Cỏc v dch virus Reston 15 Bng Cỏc v dch virus Bundibugyo (BEBOV) 15 Bng Trang, thit b s dng ti 32 Bng Chu k luõn nhit 33 Bng Chu trỡnh realtime 42 Bng S lng bn copies/phn ng 50 DANH MC HèNH NH Hỡnh Dch bnh Ebola chõu Phi Hỡnh Dch bnh Ebola gia biờn gii Gabon v Cng hũa Cụng-gụ 10 Hỡnh H gen ca virus Ebola 17 Hỡnh Cu trỳc plasmid pIDTBlue cha trỡnh t gen chng virus EBOV 30 Hỡnh Quy trỡnh tỏch v tinh sch plasmid 35 Hỡnh C ch m vũng ca plasmid 39 Hỡnh Sn phm PCR cha gen NP ca virus Ebola 43 Hỡnh Cỏc khun lc mu trng cha plasmid ngoi lai 44 Hỡnh Kt qu kim tra sn phm PCR 44 Hỡnh 10 Kt qu ct bng enzyme gii hn 45 Hỡnh 11 Nng mu i chng ARN 46 Hỡnh 12 Kt quỏ kim tra kớch thc sn phm 47 Hỡnh 13 Nng ARN ca virus Ebola 47 Hỡnh 14 Kim tra sn phm tng hp ARN 48 Hỡnh 15 Pha loóng nng 49 Hỡnh 16 Tớnh toỏn s lng bn copies/phn ng 49 Hỡnh 17 ng chun ỏnh giỏ panel 50 Hỡnh 18 ỏnh giỏ ngng phỏt tớn hiu ca panel 51 M U Tớnh cp thit Dch bnh Ebola bựng phỏt Tõy Phi gn õy l v dch Ebola ln nht vi 28.637 ca c chn oỏn, 11.315 ca t vong tớnh n ngy thỏng nm 2015[1] Tõm dch Ebolavirus l Guinea (bt u t thỏng 2/2014), lan sang Liberia (thỏng 3), Sierra Leone (thỏng 5), cựng cỏc nc khỏc Tõy Phi nh Nigeria (cui thỏng 7) v Senegal[2] Chõu u v M cng ó c bỏo cỏo nh l nhng vựng b nh hng khụng thng xuyờn[3] Chớnh vỡ vy, WHO tuyờn b dch Ebola Tõy Phi l s kin y t khn cp c u tiờn hng u theo quy nh y t quc t (nm 2005) v c tớnh s cú khong 20000 ngi b nhim cỏc thỏng sau ú n thỏng thỏng 9, 2014 chớnh ph M ó ng ý cung cp khon kinh phớ 500 triu USD v trin khai 3000 lớnh M n vựng dch h tr kim soỏt dch[4] Nghiờn cu virus hc ó xỏc nh virus ebola chng Zaire (ZEBOV) l tỏc nhõn gõy dch bnh hin ti v nghiờn cu phõn tớch trỡnh t y genome v cõy phõn loi ó ch rng ZEBOV c phõn lp t Guinea ny l mt nhỏnh tỏch bit vi chng ó c bit trc õy t Cng hũa Dõn ch Congo v Gabon[5] Do tim nng nh hng ln n sc khe cng ng, tin trin bnh nhanh v t l t vong cao, ZEBOV c phõn loi vo nhúm A cỏc tỏc nhõn sinh hc cú nguy c s dng khng b sinh hc, cn c xỏc nh chớnh xỏc v kp thi Con ng lõy lan chớnh ca ebola l tip xỳc vi cỏc dch c th nh qua ng bm kim tiờm khụng m bo, tip xỳc trc tip vi mu dch hay mụ ngi bnh hay tip xỳc gn vi bnh nhõn.Trong nhiu trng hp, phõn loi thớch hp bnh nhõn ph thuc chớnh vo vic chn oỏn nhanh v chớnh xỏc[6] Chn oỏn nhim virus Ebola giai on sm thng gp nhiu khú khn cỏc triu chng lõm sng khụng c hiu v thng phi da vo khai thỏc yu t dch t hc nh bnh nhõn va quay tr v t vựng dch ang lu hnh PHN - KT QU V BN LUN 3.1 Nhõn dũng gen NP ca virus Ebola chng Zaire 3.1.1 Kim tra plasmid cha gen NP bng PCR Plasmid pIDTBlue cha trỡnh t gen NP ca chng ZairevirusEbolacú kớch thc 1306 bp Trc thc hin tỏch dũng cn kim tra plasmid bng PCR vi cp mi M13 Sn phm ny cú kớch thc 1525 bp s c kim tra trờn gel agarose 1,2% Hỡnh 7.Sn phm PCR cha gen NP ca virus Ebola M: Marker kb; 1: sn phm PCR on gen NP ca virus Ebola chng Zaire Kt qu cho thy sn phm cú kớch thc ging vi chiu di so vi lý thuyt nờn cú th c s dng to dũng 3.1.2 Thit lp h vector tỏch dũng mang gen NP Mc ớch: Vector tỏch dũng l mt phõn t ADN cú kớch thc nh cho phộp gn mt on ADN ngoi lai nhm mc ớch nhõn on ADN ngoi lai lờn vi s lng ln Cỏc vector ny s c a vo t bo E coli Theo c ch chn lc khỏng sinh, cỏc t bo E colikhụng cha plasmid ngoi lai s b tiờu dit v 43 ch nhng plasmid bin np c vo t bo mi sinh trng v phỏt trin c trờn mụi trng LB chn lc Hỡnh Cỏc khun lc mu trngcha plasmid ngoi lai Qua hỡnh nh kt qu cho thy xut hin nhiu khun lc mc trờn mụi trng LB cú b sung ampicilin Cỏc khun lc ny c la chn ngu nhiờn kim tra theo cỏ phng phỏp: PCR khun lc, ct bng enzyme gii hn v gii trỡnh t 3.1.3 Kim tra plasmid mang gen mó húa cho NP 3.1.3.1 PCR khun lc Hỡnh Kt qu kim tra sn phm PCR 44 Sn phm PCR c kim tra trờn gel agarose 1,2 % xut hin cỏc band c hiu cú kớch thc 1,5 kb ỳng theo d tớnh chng t khun lc ó mang plasmid ngoi lai 3.1.3.2 Kim tra bng enzyme gii hn Ct kim tra bng enzyme BglII v XmnI, in di kim tra trờn gel agarose 1,2% cho band cú kớch thc l 2473 bp v phn cũn li ca vector cú kớch thc tng ng l 1784 bp Hỡnh 10 Kt qu ct bng enzyme gii hn Hỡnh nh in di cho thy trờn cỏc ging u cho band phõn bit cú kớch thc khỏc Trong ú band cú kớch thc nh (khong 1,7 kb) tng ng vi kớch thc mt phn on gen NP cú gn thờm trỡnh t vector Qua ú thy c t bo ó mang chớnh xỏc plasmid tỏi t hp pIDTBlue Qua cỏc kt qu trờn ta ó cú th khng nh c vector pIDTBlue ó c to dũng thnh cụng t bo E coli 3.1.3.3 Gii trỡnh t cỏc plasmid tỏi t hp Cỏc dũng plasmid tỏi t hp ó c kim tra c gii trỡnh t (thụng qua sn phm tỏch dũng) Kt qu gii trỡnh t trờn mỏy ABI System 3130, s dng phn mm BioEdit, phõn tớch d liu bng cụng c Blast trờn NCBI (D liu khụng trỡnh by) 45 Kt qu gii trỡnh t cho thy tt c cỏc trỡnh t l ca gen nucleoprotein ca virus Ebola (D liu khụng trỡnh by) 3.2 Tng hp ARN in-vitro 3.2.1 Tng hp mu i chng ARN Trc tng hp ARN ca virus Ebola t plasmid cha gen NP ca Ebolavirrus trc tiờn chỳng tụi tin hnh thc hin tng hp mu i chng ca nh sn xut xỏc nh c hiu sut sau ú tin hnh quỏ trỡnh tng hp mu ARN ca virus Ebola t plasmid Hỡnh 11 Nng mu i chng ARN Sn phm sau c tinh sch c o OD vi bc súng 260/280 xỏc nh nng ARN cú àl th tớch dung dch Hỡnh 12 cho thy nng ARN o c l 1798,2 ng/àl vi tinh sch 2,14 46 Hỡnh 12 Kt quỏ kim tra kớch thc sn phm RNA Ladder: Marker ARN ;RNA transcript: Sn phm tng hp mu i chng ARN in di kim tra kớch thc sn phm: Sau in di, sn phm cú kớch thc tng ng vi nh sn xut a l plasmid ó c to mch thng cú kớch thc 5066 bp, on phiờn mó cú kớch thc 2223 bp 3.2.2 Tng hp ARN ca virus Ebola Hỡnh 13 Nng ARN ca virus Ebola 47 ARN ca virus Ebola c tng hp in-vitro t plasmid sau c tinh sch s tin hnh o OD xỏc nh nng ARN cú àl th tớch dung dch Hỡnh 14 cho thy nng ARN ca virus Ebola o c l 1400,3 ng/àl So vi nng ca mu i chng ARN chng t thao tỏc tng hp v tinh sch khỏ tt Mu ny c s dng lm chng dng, chia cỏc ng eppendorf v bo qun -80oC Hỡnh 14.Kim tra sn phm tng hp ARN Sn phm tinh sch sau in di cho thy sn phm cú chiu di 1806 bp ỳng theo chiu di lý thuyt chng t quỏ trỡnh tng hp ARN ca virus Ebola ó thnh cụng 3.3 Xõy dng b panel nhy 3.3.1 Xõy dng b panel nhy Sn phm ARN c tng hp in vitro cú chiu di 1806 bp v nng sau tinh sch c xỏc nh l 1400,3 ng/àl, nng ny c s dng lm stock T lng phõn t l 586409,4 g/mol ta tớnh c s bn copies cú àl th tớch mu theo cụng thc: 48 nARN = = , , = 2,388 x 10-12 (mol) Do cú: mol cú 6,022 x 1023copies (h s chuyn i Avogadro) Nh vy, àl th tớch cú: 6,022 x 1023 x 2,388 x 10-12 = 1,438 x 1012 (copies/àl) Chỳng tụi tin hnh pha loóng thnh nng 1010 v tip tc pha loóng 10 ln to b panel nhy gm cỏc di nng t 100 n 1010 copies/àl Hỡnh 15.Pha loóng nng Sau xõy dng panel nhy chỳng tụi tin hnh ỏnh giỏ b panel nhy bng k thut realtime onestep RT-PCR Kt qu chỳng tụi ó thu c s lng bn copies cú mt phn ng c trỡnh by bng 9: Hỡnh 16 Tớnh toỏn s lng bn copies/phn ng 49 Nng ARN S lng copies/phn ng 102 394 103 1.912 104 16.316 105 118.870 106 1.559.914 107 17.415.725 108 188.238.701 109 2.533.483.066 1010 27.021.112.118 Bng S lng bn copies/phn ng Tựy thuc vo s bn copies ARN mt th tớch nht nh v tựy thuc vo tng th tớch khuụn mu c s dng cho mi phn ng m pha loóng dung dch cú s copies c s dng lm khuụn mu cho mi phn ng l 1010 - 100/n v th tớch Bng l s lng copies ca mi phn ng vi àl ARN Hỡnh 17 ng chun ỏnh giỏ panel 50 ng chun sau c thit lp cú h s tng quan R2= 0,996 v hiu sut E = 0,65 3.3.2 ỏnh giỏ ngng phỏt hin k thut realtime RT-PCR chn oỏn virus Ebola trờn b panel nhy Hỡnh 18 ỏnh giỏ ngng phỏt tớn hiu ca panel Chng dng ARN c tng hp in-vitro t plasmid c pha loóng t nng 1010 n 100 v c ỏnh giỏ bng k thut realtime onestep RTPCR.Ti nng 102,k thut realtime onestep RT-PCRvn phỏt hin c tớn hiu chng trealtime onestep RT-PCR bao phdi nng t 1010-102 copies/àl 51 PHN - KT LUN V KIN NGH 4.1 Kt lun T nm 2014 n nm 2015, s ngi b nhim virus Ebola liờn tc tng Tõy Phi iu ny to thnh mi quan tõm ca cng ng Quc t, rt nhiu quc gia ó giỳp v ng h cho cỏc khu vc b nh hng bi dch bnh Ebola kim soỏt v ngn chn dch Tuy nm khu vc cú kh nng lõy nhim virus Ebola thp nhng Vit Nam cng tham gia thc hin nghiờn cu gúp phn no quỏ trỡnh chn oỏn sm v phũng nga lõy lan dch bnh Ebola Qua quỏ trỡnh nghiờn cu v thc hin em ó thu c nhng kt qu sau: - To c vector tỏi t hp mang gen NP ca virus Ebola chng Zaire - Ch to c chng dng ca virus Ebola chng Zaire bng phng phỏp tng hp ARN in-vitro t plasmid mang gen NP ca virus Ebola chng Zaire - Xõy dng c b panel nhy gm cỏc di nng t 100-1010ng dng chn oỏn sm chng Zaire ca virus Ebola - ỏnh giỏ b panel nhy bng k thut onestep realtime RT-PCR cho kt qu ngng phỏt hin l 102 copies/phn ng 4.2 Kin ngh Sau thit lp c b panel nhy ng dng chn oỏn sm virus Ebola: - So sỏnh vi b panel chun quc t th gii ca WHO - B panel ny cú th c s dng rng rói cỏc phũng thớ nghim nh mt bn tham chiu chun xõy dng ng chun v ỏnh giỏ v kim nh cỏc b kit chn oỏn virus Ebola 52 TI LIU THAM KHO [1] M Flint, C H Goodman, S Bearden, D M Blau, B R Amman, A J Basile, J A Belser, ẫ Bergeron, M D Bowen, A C Brault, S Campbell, A K Chakrabarti, K A Dodd, B R Erickson, M M Freeman, A Gibbons, L W Guerrero, J D Klena, R R Lash, M K Lo, L K McMullan, G Momoh, J L Massally, A Goba, C D Paddock, R A Priestley, M Pyle, M Rayfield, B J Russell, J S Salzer, A J Sanchez, A J Schuh, T K Sealy, M Steinau, R A Stoddard, C Taboy, M Turnsek, D Wang, G E Zemtsova, M Zivcec, C F Spiropoulou, U Strửher, J S Towner, S T Nichol, and B H Bird, Ebola Virus Diagnostics: The US Centers for Disease Control and Prevention Laboratory in Sierra Leone, August 2014 to March 2015, J Infect Dis., vol 212 Suppl 2, pp S350-358, Oct 2015 [2] M J Martớnez, A M Salim, J C Hurtado, and P E Kilgore, Ebola Virus Infection: Overview and Update on Prevention and Treatment, Infect Dis Ther., vol 4, no 4, pp 365390, Dec 2015 [3] G Wang, R Zhang, Y Han, L Chang, D Zhang, L Zhang, X Yang, C Liu, J Ding, K Zhang, G Lin, X Jiehong, and J Li, The evaluation of commercial real-time PCR kits for Zaire ebolavirus using virus-like particle-encapsulated EBOV RNA, Diagn Microbiol Infect Dis., vol 83, no 4, pp 355358, Dec 2015 [4] Z J Miller, U.S to Commit $500 Million, Deploy 3,000 Troops in Ebola Fight, Time, 16-Sep-2014 [5] S Baize, D Pannetier, L Oestereich, T Rieger, L Koivogui, N Magassouba, B Soropogui, M S Sow, S Keùta, H De Clerck, A Tiffany, G Dominguez, M Loua, A Traorộ, M Koliộ, E R Malano, E Heleze, A Bocquin, S Mộly, H Raoul, V Caro, D Cadar, M Gabriel, M Pahlmann, D Tappe, J Schmidt-Chanasit, B Impouma, A K Diallo, 53 P Formenty, M Van Herp, and S Gỹnther, Emergence of Zaire Ebola virus disease in Guinea, N Engl J Med., vol 371, no 15, pp 1418 1425, Oct 2014 [6] T R Gibb, D A Norwood, N Woollen, and E A Henchal, Development and evaluation of a fluorogenic nuclease assay to detect and differentiate between Ebola virus subtypes Zaire and Sudan, J Clin Microbiol., vol 39, no 11, pp 41254130, Nov 2001 [7] P Cherpillod, M Schibler, G Vieille, S Cordey, A Mamin, P Vetter, and L Kaiser, Ebola virus disease diagnosis by real-time RT-PCR: A comparative study of 11 different procedures, J Clin Virol Off Publ Pan Am Soc Clin Virol., vol 77, pp 914, Apr 2016 [8] X Pourrut, B Kumulungui, T Wittmann, G Moussavou, A Dộlicat, P Yaba, D Nkoghe, J.-P Gonzalez, and E M Leroy, The natural history of Ebola virus in Africa, Microbes Infect Inst Pasteur, vol 7, no 78, pp 10051014, Jun 2005 [9] J J Muyembe-Tamfum, S Mulangu, J Masumu, J M Kayembe, A Kemp, and J T Paweska, Ebola virus outbreaks in Africa: past and present, Onderstepoort J Vet Res., vol 79, no 2, p 451, 2012 [10] E D Johnson, B K Johnson, D Silverstein, P Tukei, T W Geisbert, A N Sanchez, and P B Jahrling, Characterization of a new Marburg virus isolated from a 1987 fatal case in Kenya, Arch Virol Suppl., vol 11, pp 101114, 1996 [11] T Muyembe and M Kipasa, Ebola haemorrhagic fever in Kikwit, Zaire International Scientific and Technical Committee and WHO Collaborating Centre for Haemorrhagic Fevers, Lancet Lond Engl., vol 345, no 8962, p 1448, Jun 1995 [12] J Amblard, P Obiang, S Edzang, C Prehaud, M Bouloy, and B L Guenno, Identification of the Ebola virus in Gabon in 1994, Lancet Lond Engl., vol 349, no 9046, pp 181182, Jan 1997 54 [13] A J Georges, E M Leroy, A A Renaut, C T Benissan, R J Nabias, M T Ngoc, P I Obiang, J P Lepage, E J Bertherat, D D Bộnoni, E J Wickings, J P Amblard, J M Lansoud-Soukate, J M Milleliri, S Baize, and M C Georges-Courbot, Ebola hemorrhagic fever outbreaks in Gabon, 1994-1997: epidemiologic and health control issues, J Infect Dis., vol 179 Suppl 1, pp S65-75, Feb 1999 [14] E M Leroy, S Souquiốre, P Rouquet, and D Drevet, Re-emergence of ebola haemorrhagic fever in Gabon, Lancet Lond Engl., vol 359, no 9307, p 712, Feb 2002 [15] P Formenty, E M Leroy, A Epelboin, F Libama, M Lenzi, H Sudeck, P Yaba, Y Allarangar, P Boumandouki, V B Nkounkou, C Drosten, A Grolla, H Feldmann, and C Roth, Detection of Ebola virus in oral fluid specimens during outbreaks of Ebola virus hemorrhagic fever in the Republic of Congo, Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am., vol 42, no 11, pp 15211526, Jun 2006 [16] Ebola haemorrhagic fever fact sheet revised in May 2004, Relevộ ẫpidộmiologique Hebd Sect Hygiốne Secrộtariat Sociộtộ Nations Wkly Epidemiol Rec Health Sect Secr Leag Nations, vol 79, no 49, pp 435439, Dec 2004 [17] Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Outbreak of Ebola hemorrhagic fever Uganda, August 2000-January 2001, MMWR Morb Mortal Wkly Rep., vol 50, no 5, pp 7377, Feb 2001 [18] Poliomyelitis eradication in Africa update on importations, Relevộ ẫpidộmiologique Hebd Sect Hygiốne Secrộtariat Sociộtộ Nations Wkly Epidemiol Rec Health Sect Secr Leag Nations, vol 79, no 28, pp 253254, Jul 2004 [19] Ebola Outbreaks 2000-2014 | Ebola Hemorrhagic Fever | CDC. [Online] Available: 55 http://www.cdc.gov/vhf/ebola/outbreaks/history/summaries.html [Accessed: 19-May-2016] [20] C G Albariủo, T Shoemaker, M L Khristova, J F Wamala, J J Muyembe, S Balinandi, A Tumusiime, S Campbell, D Cannon, A Gibbons, E Bergeron, B Bird, K Dodd, C Spiropoulou, B R Erickson, L Guerrero, B Knust, S T Nichol, P E Rollin, and U Strửher, Genomic analysis of filoviruses associated with four viral hemorrhagic fever outbreaks in Uganda and the Democratic Republic of the Congo in 2012, Virology, vol 442, no 2, pp 97100, Aug 2013 [21] 2014 Ebola Outbreak in West Africa | Ebola Hemorrhagic Fever | CDC. [Online] http://www.cdc.gov/vhf/ebola/outbreaks/2014-west-africa/ Available: [Accessed: 19-May-2016] [22] Bach Mai - WHO ỏnh giỏ nguy c lõy nhim Ebola Vit Nam rt thp. [Online] Available: http://bachmai.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=1 193 [Accessed: 19-May-2016] [23] VnExpress, Bnh nhõn Nng õm tớnh vi Ebola - VnExpress, Tin nhanh VnExpress [Online] Available: http://vnexpress.net/tin-tuc/thoisu/benh-nhan-o-da-nang-am-tinh-voi-ebola-3101650.html [Accessed: 19-May-2016] [24] T Nguyn, I DCH EBOLA - Ni ỏm nh ca ton nhõn loi, Hng nghip v hũa nhp, p p: 33 [25] Sanchez, A., A S Khan, et al, Filoviridae: Marburg and Ebola viruses, in Fields virology, Philadelphia: Lippincott-Raven, 2001, pp 12791304 [26] S F Dowell, R Mukunu, T G Ksiazek, A S Khan, P E Rollin, and C J Peters, Transmission of Ebola hemorrhagic fever: a study of risk factors in family members, Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 56 1995 Commission de Lutte contre les Epidộmies Kikwit, J Infect Dis., vol 179 Suppl 1, pp S87-91, Feb 1999 [27] World Health Organization Division of Emerging and other Communicable Diseases Surveillance and Control, WHO recommended guidelines for epidemic preparedness and response: Ebola haemorrhagic fever (EHF), Geneva: World Health Organization, 1997 [28] WHO | Ebola virus disease, WHO [Online] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs103/en/ Available: [Accessed: 19- May-2016] 57 [...]... 2 Mục tiêu Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu chế tạo bộ panel ứng dụng trong đánh giá độ nhạy của kỹ thuật realtime RT- PCR chẩn đoán virus Ebola chủng Zaire” nhằm các mục tiêu: - Chế tạo được bộ panel độ nhạy ứng dụng trong chẩn đoán virus Ebola chủng Zaire bằng kỹ thuật realtime RT- PCR - Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật realtime RT- PCR chẩn đoán virus Ebola chủng Zaire trên bộ panel độ nhạy 6 PHẦN 1 - TỔNG... mẫu ARN của bệnh nhân không bị nhiễm virus Ebola, được sử dụng như những chứng âm Dùng để đánh giá độ đặc hiệu của các bộ sinh phẩm chẩn đoán tương ứng 26 - Panel độ nhạy: Là panel pha loãng với nhiều nồng độ được hiệu chỉnh theo mẫu chuẩn quốc tế dùng để đánh giá độ nhạy của bộ sinh phẩm chẩn đoán tương ứng Tuy nhiên, virus Ebola được phân loại vào nhóm A các tác nhân sinh học có nguy cơ sử dụng để... nhiễm virus Ebola Chính vì vậy chẩn đoán xét nghiệm đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán sớm và xác định nhiễm virus Ebola bao gồm xét nghiệm phát hiện sự xuất hiện của virus trong máu bằng kỹ thuật realtime RT- PCR và chẩn đoán huyết thanh học xác định IgG và IgM bằng kỹ thuật ELISA, trong khi đó phân lập virus chỉ được phép thực hiện ở phòng an toàn sinh học cấp 4 Các xét nghiệm chẩn đoán dựa... ARN, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ phân tử của gene Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus ARN Nguyên tắc: bước đầu tiên của phản ứng RT- PCR là quá trình phiên mã ngược từ khuôn mẫu ARN để tạo ra cADN, rồi sau đó sẽ dùng PCR để... nữa việc sử dụng Mn2+ trong phản ứng sẽ làm cho quá trình tổng hợp cADN có độ đặc hiệu thấp 1.5 Hiểu biết về panel 1.5.1 Khái niệm Panel là một bộ mẫu chuẩn bao gồm các các mẫu huyết thanh hay các mẫu ARN của bệnh nhân bị nhiễm virus được pha loãng với các nồng độ từ cao đến thấp để đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán mật độ virus Ebola có trong cơ thể bệnh nhân 1.5.2 Các loại panel - Panel chuyển... huyết thanh của bệnh nhân Ebola chỉ được thực hiện trong các phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 4 do WHO và CDC kiểm soát để tránh nguy cơ lây nhiễm trong phòng thí nghiệm từ đó làm bùng nổ đại dịch mới Vì thế, trong chẩn đoán virus Ebola tại Việt Nam chỉ có thể sử dụng panel độ nhạy hoặc panel độ đặc hiệu vì việc trực tiếp xử lý huyết thanh của bệnh nhân rất nguy hiểm 1.6 Kỹ thuật PCR 1.6.1 Nguyên... dựng kế hoạch sẵn sàng ứng phó khi dịch bệnh thâm nhập và xuất hiện ở Việt Nam[24] 1.2 Giới thiệu virus Ebola 1.2.1 Phân loại EBOV được phân thành 5 chủng bao gồm: virus Zaire (Zaire ebolavirus - ZEBOV), virus Sudan (Sudan ebolavirus - SEBOV), virus Côte 16 d’Ivoire (Côte d’Ivoire ebolavirus - TAFV), virus Bundibugyo (Bundibugyo ebolavirus - BEBOV) và virus Reston(Reston ebolavirus - REBOV) Những chủng... không tạo ra được đáp ứng miễn dịch hiệu quả chống lại sự xâm nhập của virus Ebola[ 28] 22 1.4 Các phương pháp chẩn đoán xét nghiệm virus Ebola Trước khi chẩn đoán được bệnh Ebola cần loại trừ một số bệnh có những triệu chứng tương tự như: sốt rét, thương hàn, sốt vàng da, viêm màng não, viêm gan và các bệnh sốt xuất huyết do các virus khác Có nhiều loại xét nghiệm có thể chẩn đoán xác định nhiễm virus Ebola. .. với độ nhạy và độ đặc hiệu cao đã được công nhận là công cụ hữu hiệu trong điều trị lâm sàng và kiểm soát dịch bệnh này[1] Những xét nghiệm này được ứng dụng cả trong chẩn đoán và phân biệt bệnh do virus Ebola với các bệnh nhiệt đới khác cũng như quản lý những bệnh nhân nhiễm virus Ebola không triệu chứng trước khi xuất viện Trên thế giới, một số xét nghiệm NAT in-house được phát triển cho chẩn đoán virus. .. Nguyên lý: Realtime PCR là một phương pháp PCR mới Nó kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm (chu kỳ) của quá trình khuếch đại đoạn gen của virus Ebola, trái ngược với PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm được khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại - Realtime PCR là một phản ứng động - Cho phép phát