LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME

MỤC LỤCPHẦN I. MỞ ĐẦU11. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI12. MỤC TIÊU22.1. Mục tiêu chung22.2. Mục tiêu cụ thể23. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU24. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU24.1. Đối tượng nghiên cứu:24.2. Nguyên liệu nghiên cứu:24.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu35. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI3PHẦN II. NỘI DUNG4CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU41. Tổng quan về gelatin và gelatinase42. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase73. Tình hình thực tế114. Các thành phần thủy phân từ da cá125. Biến nạp136. Vector biểu hiện147. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm16CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU191. Vật liệu, hóa chất, thiết bị191.1. Vật liệu191.2. Hóa chất211.3. Thiết bị222. Phương pháp nghiên cứu232.1. Phương pháp điện di trên gel agarose232.2. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)242.3. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose252.4. Tách chiết thu nhận plasmid pET32a(+) bằng phương pháp SDSkiềm252.5. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn262.6. Phương pháp nối gen272.7. Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ282.8. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli292.9. Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)302.10. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+312.11. Phương pháp điện di gel SDSPAGE322.12. Phương pháp thu enzyme gelatinase342.13. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải của gelatinase với gelatin thô352.14. Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase352.15. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn352.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phát triển sinh khối và hoạt tính enzyme gelatinase362.17. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase362.18. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase372.19. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase372.20. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu37CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN381. Nghiên cứu biểu hiện gen gelatinase trong vi khuẩn E.coli BL21381.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+ GelEA381.2. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ411.3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp432. Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase452.1. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen mã hóa gelatinase452.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp gelatinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp482.3. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ522.4. Ảnh hưởng của yếu tố pH542.5. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian nuôi cấy562.6. Ảnh hưởng các ion kim loại583. Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp593.1. Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột593.2. Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp613.3. Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp64KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ681. KẾT LUẬN682. KIẾN NGHỊ69TÀI LIỆU THAM KHẢO70

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI  - BÙI THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME LUẬN VĂN THẠC SĨ: KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI  - BÙI THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ: KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHẠM CÔNG HOẠT LỜI CẢM ƠN HÀ NỘI, NĂM 2014 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể thầy giáo, cô giáo giảng dạy môn Di truyền học – Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi em học tập hoàn thành khóa học Cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Công Hoạt TS Phạm Thị Tâm, thầy cô trực tiếp hướng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới hỗ trợ tài phương pháp từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC06.15/11-15 Em xin cảm ơn tập thể cán Khoa Sinh, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội, đặc biệt tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội chia sẻ khó khăn, giúp đỡ em để em thực nội dung đề tài Trong trình học tập thực đề tài em không tránh khỏi sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh chị bạn bỏ qua đóng góp ý kiến để em hoàn thiện Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình, bạn bè bên cạnh động viên giúp đỡ em để em hoàn thành khóa học Hà Nội, tháng năm 2014 Tác giả luận văn Bùi Thị Thu Hằng DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A AMP : Aeromonas : Ampicillin bp : Bazơ pair BSA : Bovine Serum Albumin BLAST : Basis Local Aligment Search Tool EDTA : Ethyllene diamine tetra acetic acid EtBr : Ethidium Bromide LB : Lubria – Bertani OD : Optical density PBS : Phosphate buffer PCR : Polymerase Chain Reactions IPTG : Isopropyl β-D- thiogalactoside kD : Kilo dalton kb : Kilo bazơ RE : Restriction enzyme TAE : Tris - acetate - EDTA UV : Ultra violet MỤC LỤC PHẦN I MỞ ĐẦU 1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI .1 MỤC TIÊU 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 4.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan gelatin gelatinase Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase .7 Tình hình thực tế 10 Các thành phần thủy phân từ da cá 12 Biến nạp 13 Vector biểu .13 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm .15 17 17 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 18 1.1 Vật liệu 18 1.2 Hóa chất 20 1.3 Thiết bị 21 Phương pháp nghiên cứu 22 2.1 Phương pháp điện di gel agarose 22 2.2 Kiểm tra mang gen vector tái tổ hợp phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 23 2.3 Phương pháp tinh ADN từ gel agarose 24 2.4 Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) phương pháp SDS-kiềm 24 2.5 Phương pháp cắt enzyme giới hạn .25 2.6 Phương pháp nối gen 26 2.7 Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ 27 2.8 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli 28 2.9 Phương pháp biểu gen mã hóa genatinase vi khuẩn E coli BL21(DE3) 29 2.10 Tinh protein tái tổ hợp cột lực Ni2+ .30 2.11 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE 31 2.12 Phương pháp thu enzyme gelatinase 33 2.13 Phương pháp đánh giá khả phân giải gelatinase với gelatin thô .33 2.14 Phương pháp xác định hoạt tính gelatinase 33 2.15 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 34 2.16 Phương pháp xác định ảnh hưởng ion kim loại đến khả phát triển sinh khối hoạt tính enzyme gelatinase 35 2.17 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính gelatinase 35 2.18 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính gelatinase 36 2.19 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase 36 2.20 Phương pháp thu thập xử lý số liệu .36 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 Nghiên cứu biểu gen gelatinase vi khuẩn E.coli BL21 36 1.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+ - GelE/A .36 1.2 Biểu gen mã hóa gelatinase tế bào vật chủ 40 1.3 Tinh đánh giá hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 42 Xác định điều kiện thích hợp để biểu gen mã hóa gelatinase 44 2.1 Ảnh hưởng chất cảm ứng IPTG đến kết biểu gen mã hóa gelatinase .44 2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp gelatinase chủng vi khuẩn tái tổ hợp .47 2.3 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ .51 2.4 Ảnh hưởng yếu tố pH .53 2.5 Ảnh hưởng yếu tố thời gian nuôi cấy .55 2.6 Ảnh hưởng ion kim loại 57 Xác định đặc tính gelatinase tái tổ hợp 58 3.1 Đánh giá hoạt tính gelatinase gelatin bột .58 3.2 Xác định đặc tính vật lý gelatinase tái tổ hợp 60 3.3 Xác định đặc tính hóa học gelatinase tái tổ hợp 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ .68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Thành phần acid amin gelatin ………………… Bảng Một số loài vi khuẩn có khả sinh gelatinase Bảng Một số loài vi khuẩn có khả sinh gelatinase 13 Bảng Ảnh hưởng nguồn bon nitơ đến khả sinh trưởng hoạt tính enzyme tái tổ hợp …………………… 49 Bảng Ảnh hưởng ion bổ sung đến khả phát triển sinh khối hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET32/GelE 59 Bảng Ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính gelatinase …………………………………………………………… 65 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ (Sđ) Sđ Biểu gen mã hóa gelatinase (GelE) … 17 Sđ Ảnh hưởng chất cảm ứng IPTG đến kết biểu gen GelE .18 Sđ Xác định điều kiện tăng sinh chủng vi khuẩn TTH pET 32a +/GelE 18 DANH MỤC CÁC BỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả phân giải gelatin 60 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng thời gian tới khả phân giải gelatin 61 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme gelatinase 66 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme gelatinase 67 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Cấu trúc chuỗi acid amin gelatin Hình 2a Cấu trúc gelatinase A Hình 2b Cấu trúc gelatinase B Hình Hình thái A hydrophila……………………………………………………………8 Hình Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila………………………………………………… Hình Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa 10 Hình Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas…………… …………………………….11 Hình Sơ đồ pET32a+ dùng biểu gen 19 Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng GelE phân lập GeneBank .38 Hình 1.2 Hình ảnh điện di gen GelE vector pET32 a(+) cắt enzyme giới hạn Bam HI Xho I .39 Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt trình thiết kế vector biểu gen mã hóa gelatinase 40 Hình 1.4 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme BamHI XhoI 41 Hình 1.5 Kết biến nạp vector pET32a/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3) nuôi môi trường LBAmp .42 Hình 1.6 Kết điện di protein tái tổ hợp gelatinase gel SDS-PAGE 43 Hình 1.7 Điện di protein gelatinase tinh SDS-PAGE .44 Hình 1.8 Hình ảnh phân giải gelatinase enzyme thu từ chủng E.coli BL21/pET 32-GelE 45 Hình 2.1 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli BL21 46 Hình 2.2 Mức độ biểu protein GelE nồng độ IPTG cảm ứng 47 Hình 2.3 Mức độ biểu gelatinase nồng độ IPTG cảm ứng ………… 47 Hình 2.4 Ảnh hưởng nguồn bon đến khả sinh trưởng chủng E.coli BL21- pET32/GelE 50 Hình 2.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET32/GelE 50 Hình 2.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 51 Hình 2.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET32/GelE 52 Hình 2.8 Mức độ biểu gelatinase nhiệt độ nuôi cấy 53 Hình 2.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 53 Hình 2.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 54 Hình 2.11 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 55 Hình 2.12 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính gelatinase sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 55 Hình 2.13 Mức độ biểu gelatinase giá trị pH khác 56 Hình 2.14 Ảnh hưởng thời gian tăng sinh đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE .57 Hình 2.15 Ảnh hưởng thời gian tăng sinh đến hoạt tính gelatinase sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE .57 Hình 2.16 Mức độ biểu gelatinase giá trị OD khác 58 Hình 3.1 Kết phản ứng biure thủy phân gelatin 370C …………………60 Hình 3.2 Kết phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí 61 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase 62 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính gelatinase …… 63 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính gelatinase 64 PHẦN I MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong năm gần enzyme hướng ứng dụng vào nhiều ngành khác đem lại nhiều hiệu với ưu điểm chuyển hóa chất thành sản phẩm nhanh hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản ứng xảy điều kiện êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn người thiên nhiên Mặt khác, nay, Việt Nam có số công trình nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp với mục đích sử dụng công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp Cụ thể: Đề tài nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu sử dụng thức ăn chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase yếu tố hoạt hóa plasminogen” Đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme protease lipase từ chủng vi sinh vật tái tổ hợp để ứng dụng công nghệ thuộc da sản xuất chất tẩy rửa Đề tài “Nghiên cứu sản xuất enzyme protease tái tổ hợp hệ thống lên men quy mô pilot thử nghiệm ứng dụng sản xuất nước chấm” Gelatinase enzyme nghiên cứu với tác dụng thủy phân gelatin Gelatin polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen da, xương bò, lợn, cá; loại protein không mùi, không vị, suốt có màu hơi vàng, gelatin sử dụng rộng rãi ngành thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Gelatinase tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động enzyme thủy phân liên kết peptit gelatin để tạo đoạn peptit ngắn axit amin, nhiên nguồn gelatinase thường tác nhân gây nên độc tố vi khuẩn, đồng thời số loại vi khuẩn gây hại người, động vật trồng Pseudomonasaeruginosa gây bệnh mủ xanh người không an toàn hiệu Hình 2.16 Mức độ biểu gelatinase giá trị OD khác Hình ảnh điện di đồ: 1-3: protein tổng số mẫu mẫu tăng sinh sau 12, 16 24 giờ; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin enzyme tái tổ hợp thu từ mẫu tăng sinh sau 12, 16 24 Kết hình ảnh điện di cho thấy: Cả đường chạy 1, xuất băng tương ứng với kích thước lý thuyết gelatinase 72 kDa, độ đậm băng khác biệt lớn Kiểm tra hoạt tính enzyme mẫu tăng sinh cho thấy, sau 12h, 16h 24h tăng sinh kích thước vùng phân giải mẫu tăng sinh sau 16 lớn so với kích thước vùng phân giải mẫu tăng sinh sau 12 24 Từ kết xác định thời gian tăng sinh chủng biểu 16h 2.6 Ảnh hưởng ion kim loại Các ion kim loại có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phát triển sinh khối trình sản xuất hoạt tính enzyme Hoạt tính nhóm enzyme khác kích thích bị ức chế ion khác Trong nghiên cứu này, nuôi cấy vi khuẩn biểu gen mã hóa gelatinase E.coli BL21- pET32/GelE môi trường LB modified, thành phần môi trường gồm: 10 g tryptone, 10 g yeast extract, 10 g peptone, 5g glucose, 10 g NaCl, ampicillin 100 µg/ml bổ sung 1mM MnSO4, ZnSO4, CaCl2, FeSO4, CoCl2 MgSO4 Kết thí nghiệm trình bày bảng 57 Bảng Ảnh hưởng ion bổ sung đến khả phát triển sinh khối hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE Kết thí nghiệm cho thấy, ion Ca 2+ có khả tăng cường hoạt tính gelatinase tái tổ hợp mật độ sinh khối chủng biểu E.coli BL21pET32/GelE Các ion Mg Mn2+ bổ sung ion vào môi trường nuôi cấy vai trò đáng kể việc tăng hoạt tính kết hợp với ion Ca2+ lại có tác dụng làm tăng đáng kể hoạt tính enzyme mật độ sinh khối Với kết thu từ mối tương quan tỷ lệ thuận mật độ sinh khối hoạt tính enzyme tái tổ hợp cho thấy, ion Ca 2+ + Mg2+ + Mn2+ có tác dụng kích thích tăng trưởng quần thể chủng biểu dẫn tới lượng enzyme tổng hợp nhiều để làm nên hoạt tính enzyme mạnh Ngược lại, ion Fe 2+, Co2+, Zn2+ lại ức chế hoàn toàn khả sinh trưởng chủng E.coli BL21- pET32/GelE đồng nghĩa với việc không tổng hợp enzyme Xác định đặc tính gelatinase tái tổ hợp 3.1 Đánh giá hoạt tính gelatinase gelatin bột Để đánh giá hoạt tính galatinase enzyme tái tổ hợp, thực thí nghiệm với loại enzyme: 1) gelatinase tái tổ hợp 2) gelatinase thương mại (Sigma Aldrich) Mẫu chứa hỗn hợp enzyme gelatin bột khảo sát mức nhiệt độ 25, 30, 37, 41 50⁰C 36h nhằm đánh giá ảnh hưởng 58 nhiệt độ tới hoạt tính phân giải enzyme Kết thể biểu đồ 3.1 hình 3.1 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả phân giải gelatin ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp) Hình 3.1 Kết phản ứng biure thủy phân gelatin 370C ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC: không bổ sung enzyme) Kết cho thấy, gelatinase có khả hoạt động mạnh mức nhiệt độ 37⁰C với hàm lượng gelatin thủy phân 77.4 80 mg/ml Ở ngưỡng nhiệt độ khác, gelatinase có khả hoạt động hoạt tính Tiếp tục xác định thời gian thủy phân gelatin enzyme tái tổ hợp thực thí nghiệm phân giải gelatin hai loại enzyme khoảng thời gian 12, 18, 24, 36, 48h Kết đồ thị 3.2 hình 3.2 59 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng thời gian tới khả phân giải gelatin ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp) Hình 3.2 Kết phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC: không bổ sung enzyme) Kết khảo sát cho thấy, khoảng thời gian từ 18-36h, lượng gelatin thủy phân tăng nhanh đạt tối đa 36h Sau khoảng thời gian này, lượng gelatin mẫu có biến động không đáng kể Như vậy, hiệu xuất thủy phân gelatinase cao sau 36-48h xử lý 3.2 Xác định đặc tính vật lý gelatinase tái tổ hợp 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme Nhiệt độ tối ưu enzyme phụ thuộc nhiều vào có mặt chất, pH, lực ion môi 60 trường Gelatinase tái tổ hợp sau tinh sử dụng để xử lý gelatin nhiệt độ 300C, 370C, 450C, 500C, 600C, 700C, 800C 10h-60h Ảnh hưởng nhiệt độ xác định hoạt độ tương đối tính cách so sánh tỷ lệ hoạt độ mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng âm không bổ sung ion Theo dõi thí nghiệm 12 với mẫu enzyme xử lý 300C, 370C, 450C, 500C, 600C, 700C, 800C thu kết hình 3.3 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase Kết hình 3.3 cho thấy: Khi có ion Ca2+ hoạt tính enzyme cao 45°C, đạt 96%, nhiên khoảng từ 370C-500C, hoạt tính enzyme đạt khoảng 85-96% Khi Ca2+ hoạt tính gelatinase thấp hơn, xử lý mẫu 37-500C, hoạt tính enzyme đạt khoảng 68-89%, nhiệt độ phù hợp 45°C với hoạt tính tương đối đạt 88% Kết thí nghiệm cho thấy, nhiệt độ từ 370C đến 50°C không làm thay đổi vùng liên kết với Ca2+ enzyme Nhiệt độ tăng liên kết cấu trúc (liên kết hydro, liên kết Van der Wall, lực hút tĩnh điện) thay đổi, vậy, ion Ca2+ tác động tích cực, hoạt tính enzyme xử lý nhiệt độ 50°C điều kiện có Ca2+ tương tự nhau, giảm tuyến tính theo mức độ tăng nhiệt độ ủ Gelatinase enzyme ổn nhiệt 61 Độ bền nhiệt gelatinase theo dõi 60 điều kiện xử lý nhiệt 50°C, giờ, enzyme lại đánh giá hoạt tính lần, thu kết hình 3.4 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính gelatinase Kết hình 3.4 cho thấy: Hoạt tính enzyme ổn định 12 đầu, sau đó, thời gian ủ lâu hoạt tính giảm, đến 60 khả thủy phân gelatin cho đạt 8-12% so với hoạt tính ban đầu Điều đáng quan tâm bổ sung ion Ca2+ hoạt tính enzyme giảm chậm hơn, hoạt tính tương đối enzyme xử lý bổ sung Ca2+ thời điểm 36 tương đương với hoạt tính tương đối enzyme không bổ sung Ca2+ thời điểm 24 Kết lần chứng minh ion Ca2+ có ảnh hưởng lớn đến độ bền cấu trúc hoạt tính gelatinase Từ kết trên, chứng tỏ,enzyme gelatinase hoạt động tốt 500C 12 xử lý 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính gelatinase Sự biến đổi ion hóa nhóm chức chuỗi polypeptid enzyme làm thay đổi điện tích cần thiết cho tạo thành phức hợp enzyme– chất trì cấu hình ba chiều nguyên thủy chuỗi polypeptid enzyme Hoạt tính enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion 62 hóa chất, enzyme trung tâm hoạt động nó, phức hệ enzyme – chất ảnh hưởng đến độ bền enzyme Mỗi enzyme có pH tối ưu khác nhau, acid (từ 1,5 -2), kiềm (9,5 – 10) pH tối ưu đa số enzyme vào khoảng xung quanh giá trị trung tính (6 – 8) Tuy nhiên pH tối ưu enzyme không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác chất nồng độ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ Dưới biểu đồ ảnh hưởng pH đến hoạt tính tương đối gelatinase (Hình 3.5) Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính gelatinase Kết hình 3.5 cho thấy: Sự bổ sung ion Ca2+ có vai trò việc ổn định hoạt tính enzyme pH từ 7-7,5 So sánh ảnh hưởng ion Ca2+ độ pH đến hoạt tính enzyme chứng tỏ pH = thích hợp hoạt tính gelatinase Với kết nghiên cứu cho phép kết luận gelatinase enzyme thuộc nhóm protease trung tính, đặc tính gelatinase tương tự enzyme khác họ metalloprotease Độ bền pH gelatinase tái tổ hợp tương tự với enzyme tự nhiên 3.3 Xác định đặc tính hóa học gelatinase tái tổ hợp 3.3.1 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính gelatinase Các ion kim loại có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme thông qua việc tham gia vào hình thành cấu trúc enzyme ảnh hưởng đến 63 hoạt tính enzyme mức độ giữ vững cấu hình không gian, hay làm tăng tốc độ phản ứng thông qua việc tạo phức với chất tham gia làm cầu nối kết hợp chất với trung tâm hoạt tính enzyme Trong nghiên cứu này, để đánh giá ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính gelatinase, ion Ca 2+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Fe2+, Mg2+, EDTA β-mercaptoetanol pha loãng nồng độ – 10 mM bổ sung vào dịch enzyme ủ 50 0C Dưới bảng tổng kết ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính enzyme gelatinase Bảng Ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính gelatinase STT Ion bổ sung Ca2+ Cu2+ Co2+ Mn2+ Fe2+ Mg2+ EDTA β-mercaptoetanol Nồng độ ion (mM) Không bổ sung Hoạt tính tương đối (%) 100 111 103 100 105 96 100 110 102 100 101 99 100 105 110 100 101 103 100 100 0 10 115 95 92 97 104 100 0 Kết bảng cho thấy ion Mg2+, Ca2+, Fe2+ không làm ảnh hưởng làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme gelatinase, hoạt tính giữ mức 100% 115% Trong ion như: Cu2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính enzyme nồng độ -10 mM, nồng độ thấp mM hoạt tính gelatinase không bị ảnh hưởng nhiều Còn trường hợp EDTA β-mercaptoetanol gây kìm hãm mạnh hoạt tính enzyme gelatinase Cụ thể nồng độ thấp mM hoạt tính enzyme gelatinase giảm xuống 0% βmercaptoetanol 4% EDTA 3.3.2 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính gelatinase Khảo sát ảnh hưởng số chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme gelatinase bao gồm: Tween 20, Triton X-100, SDS nồng độ 0,3%, 0,5%, 1% Dưới biểu đồ biểu thị ảnh hưởng số chất tẩy rửa đến hoạt tính 64 enzyme gelatinase xử lý nồng độ 0,3%, 0,5% 1% ủ với enzyme thời gian 50ºC Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme gelatinase Qua biểu đồ 3.3 ta thấy: Tween 20 nồng độ 0,3 – % không ảnh hưởng đến hoạt tính gelatinase Hoạt tính gelatinase giữ 97 – 90% Triton X-100 nồng độ 1% có ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính gelatinase, nồng độ hoạt tính gelatinase đạt 87% so với hoạt tính ban đầu Ở nồng độ thấp enzyme gelatinase không bị ảnh hưởng hoạt tính trì mức 97 – 98% Tuy nhiên SDS hoạt tính gelatinase bị ảnh hưởng rõ rệt Với nồng độ SDS cao hoạt tính gelatinase thấp, dù nồng độ thấp 0,3 % hoạt tính gelatinase bị giảm mạnh 53% Thông thường, SDS ức chế mạnh hoạt động enzyme nói chung SDS có khả hình thành lớp điện tích dấu (-) xung quanh phân tử protein enzyme làm thay đổi cấu trúc phân tử enzyme dẫn đến khả liên kết phân giải hữu 3.3.3 Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase Tiến hành khảo sát ảnh hưởng số dung môi đến hoạt tính enzyme gelatinase bao gồm: MtOH, EtOH, IsOH, Act nBtOH nồng độ 10%, 20%, 30% Dưới biểu đồ biểu thị ảnh hưởng dung môi hữu 65 đến hoạt tính enzyme gelatinase xử lý nồng độ 10%, 20% 30% thời gian nhiệt độ 50ºC Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme gelatinase Qua biểu đồ 3.4 ta thấy: n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính enzyme gelatinase Hoạt tính enzyme gelatinase giảm mạnh xuống 75% nồng độ 10% n-butanol 64% nồng độ 20% 30% Các dung môi hữu khác methanol, ethanol, isopropanol aceton không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme, hoạt tính enzyme tăng nhẹ lên 103% giảm nhẹ xuống 90% nồng độ thí nghiệm 10 – 30% KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tạo thành công chủng E.coli BL21- pET32/GelE biểu gen mã hóa enzyme gelatinase, kích thước protein tái tổ hợp khoảng 72 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết enzyme gelatinase A Đã xác định điều kiện phù hợp để biểu gen mã hóa gelatinase: 2.1 Nồng độ chất cảm ứng IPTG phù hợp 1mM 2.2 Điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn tái tổ hợp E.coli BL21(DE3) - pET 32a(+)/GelE là: 66 - Môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ bon): + Glucose nguồn bon phù hợp cho phát triển hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE + Nguồn nitơ hữu (yeast extract peptone) phù hợp cho phát triển chủng tái tổ hợp E.coli BL21- pET 32a+/GelE - Chủng E.coli BL21-pET32a+/GelE phát triển tốt hoạt tính gelatinase mạnh 370C - pH = pH phù hợp để biểu gen mã hóa gelatinase - Thời gian tăng sinh chủng biểu 16h - Sự phối hợp ion phù hợp cho tăng sinh chủng vi khuẩn tái tổ hợp E.coli BL21(DE3) - pET 32a(+)/GelE 1mM Ca 2+ + 1mM Mg2+ + 1mM Mn2+ Đã xác định đặc tính gelatinase tái tổ hợp 3.1 Khả phân giải gelatin bột enzyme tái tổ hợp enzyme thương mại Sigma tương đương, hiệu suất phân giải đạt 90% 3.2 Enzyme gelatinase tái tổ hợp hoạt động tốt 500C 12 xử lý độ pH phù hợp cho hoạt động enzyme 3.3 Ảnh hưởng ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase là: - Các ion Mg2+, Ca2+, Fe2+ không làm ảnh hưởng làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme gelatinase, Các ion như: Cu 2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính enzyme nồng độ cao, nồng độ thấp hoạt tính gelatinase không bị ảnh hưởng nhiều Với EDTA β-mercaptoetanol gây kìm hãm mạnh hoạt tính enzyme gelatinase - Tween 20 không ảnh hưởng đến hoạt tính gelatinase Triton X100 có ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính gelatinase SDS nồng độ cao hoạt tính gelatinase thấp, dù SDS nồng độ thấp hoạt tính gelatinase bị giảm mạnh 67 - n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính enzyme gelatinase làm hoạt tính enzyme gelatinase giảm mạnh Các dung môi hữu khác methanol, ethanol, isopropanol aceton không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện thu hồi enzyme để thu gelatinase có hoạt tính cao - Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân phụ phẩm chế biến cá da trơn để sản xuất sản phẩm chất lượng cao dùng cho thực phẩm, mỹ phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lý Nguyễn Bình, 2005 Công nghệ protein & enzyme, Đại Học An Giang Phạm Công Hoạt, 2012 Tuyển chọn chủng Pseudomonas có hoạt tính gelatinase phục vụ phân giải phụ phẩm giết mổ thành axit amin Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn số 5, 74-80 68 Lê Gia Hy, 2010 Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme protease lipase từ chủng vi sinh vật tái tổ hợp để ứng dụng công nghệ thuộc da sản xuất chất tẩy rửa Đề tài cấp nhà nước 2009 – 2010 Viện Công nghệ sinh học chủ trì Nguyễn Hoàng Lộc, 2011 Nghiên cứu sản xuất enzyme protease tái tổ hợp hệ thống lên men quy mô pilot thử nghiệm ứng dụng sản xuất nước chấm Đề tài cấp nhà nước 2010 – 2011, Đại học Huế chủ trì Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, 1995 Sản xuất chế phẩm kỹ thuật & y dược từ phế liệu thủy sản, Nhà xuất Nông nghiệp Tp HCM Trần Thanh Nhãn, 2009 Hóa sinh học Nhà xuất Giáo dục Việt Nam 239tr Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình, 2009 Nghiên cứu ứng dụng enzyme Protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis để thủy phân phụ phẩm cá Tra Kỷ yếu khoa học thủy sản toàn quốc, 2009 Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm TPHCM Tr 448 – 458 Đỗ Minh Phụng, Đặng Văn Hiệp, 1997 Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản, Đại Học Thủy Sản Nha Trang Phan Thị Thanh Quế, 2005 Giáo trình Công nghệ chế biến thủy hải sản, Đại học Cần Thơ 10 Quyền Đình Thi, 2010 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase yếu tố hoạt hóa plasminogen Đề tài cấp nhà nước, 2009 – 2010 Viện Công nghệ sinh học chủ trì II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11 C.S.Cheow, M.S Norizad, Z.Y.Kyaw, N.K.Howell, 2007 Preparation and characterisation of gelatins from the skins of sin croaker (Jonius dussumieri) and shortfin scad (Decapterus macrosoma), Food Chemistry, 101, 2007, p386 – 391 12 B Gime´ nez, M.C Go ´ mez-Guille´ n, P Montero, 2005 The role of salt washing of fish skins in chemical and rheological properties of gelatin extracted Food Hydrocolloids 19 (2005) page: 951–957 13 B Gime´ nez, J Turnay, M.A Lizarbe, P Montero, M.C Go ´ mez-Guille´ n, 2005 69 Use of lactic acid for extraction of fish skin gelatin Food Hydrocolloids 19 (2005) page: 941–950 14 Go` mez-Guille` n, M C., Turnay, J., Ferna´ ndez-Diaz, M D., Ulmo, N., Lizarbe, M A., & Montero, P (2002) Structural and physical properties of gelatin extracted from different marine speices: a comparative study Food Hydrocolloids, 16, 25–34 15 M.C Gómez-Guillén, B Giménez, P Montero, 2005 Extraction of gelatin from fish skins by high pressure treatment, 2005, Food Hydrocolloids, 19, 5, 923-928 16 B Jamilah, K.G Harvinder, 2002 Properties of gelatins from skins of fishblack tilapia ( Oreochromis mossambicus) and red tilapia (Oreochromis nilotica) Food Chemistry 77 (2002) page: 81–84 17 Jongjareonrak, A., Benjakul, S., Visessanguan, W., Prodpran, T., & Tanaka, M (2006) Characterization of edible films from skin gelatin of brownstripe red snapper and bigeye snapper, chemical and rheological properties of gelatin extracted, Food Hydrocolloids, 20, 2006, page: 492 – 501 18 J.H Muyonga, C.G.B Cole, K.G Duodu, 2004 Extraction and physicochemical characterisation of Nile perch (Lates niloticus ) skin and bone gelatin Food Hydrocolloids 18 (2004) page: 581–592 19 Jan Arne Arnesen, Asbjørn Gildberg, 2007 Extraction and characterisation of gelatine from Atlantic salmon ( Salmo salar) skin Bioresource Technology 98 (2007) page: 53–57 20 Kolodziejska I., E Skierka, M Sadowska W.Kolodziejska and C Niecikowska 2008 Effect of extracting time and temperature on yield of gelatin from different fish offal Food Chem 107: 700-706 21 M.C Gómez-Guillén, B Giménez, P Montero, 2005 Extraction of gelatin from fish skins by high pressure treatment, 2005, Food Hydrocolloids, 19, 5, 923-928 22 Muyonga, J.H., C.G.B Cole and K G Duodu 2004 Characterisation of acid soluble collagen from skins of young and adult nile perch ( Lates niloticus ) Food Chem 85: 81-89 70 23 Nor Fazliyana Mohtar, Conrad Perera, Siew-Young Quek, 2010 Optimisation of gelatine extraction from hoki ( Macruronus novaezelandiae) skins and measurement of gel strength and SDS–PAGE Food Chemistry 122 (2010) page: 307–313 24 P.M.Gilsenan and S.B.ross-Murphy, Rheological characterisation of gelatin from mammalian and marine sources, Food Hydrocolloids, 14, 2000, p191 – 195 25 Prabjeet Singh, Soottawat Benjakul, Sajid Maqsood, Hideki Kishimura, 2011 Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish ( Pangasianodon hypophthalmus ) Food chemistry 124: page 97 – 105 III TRANG WEB www.fistenet.gov.vn 71