LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME

MỤC LỤCPHẦN I. MỞ ĐẦU11. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI12. MỤC TIÊU22.1. Mục tiêu chung22.2. Mục tiêu cụ thể23. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU24. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU24.1. Đối tượng nghiên cứu:24.2. Nguyên liệu nghiên cứu:24.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu35. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI3PHẦN II. NỘI DUNG4CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU41. Tổng quan về gelatin và gelatinase42. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase73. Tình hình thực tế114. Các thành phần thủy phân từ da cá125. Biến nạp136. Vector biểu hiện147. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm16CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU191. Vật liệu, hóa chất, thiết bị191.1. Vật liệu191.2. Hóa chất211.3. Thiết bị222. Phương pháp nghiên cứu232.1. Phương pháp điện di trên gel agarose232.2. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)242.3. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose252.4. Tách chiết thu nhận plasmid pET32a(+) bằng phương pháp SDSkiềm252.5. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn262.6. Phương pháp nối gen272.7. Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ282.8. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli292.9. Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)302.10. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+312.11. Phương pháp điện di gel SDSPAGE322.12. Phương pháp thu enzyme gelatinase342.13. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải của gelatinase với gelatin thô352.14. Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase352.15. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn352.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phát triển sinh khối và hoạt tính enzyme gelatinase362.17. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase362.18. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase372.19. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase372.20. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu37CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN381. Nghiên cứu biểu hiện gen gelatinase trong vi khuẩn E.coli BL21381.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+ GelEA381.2. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ411.3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp432. Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase452.1. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen mã hóa gelatinase452.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp gelatinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp482.3. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ522.4. Ảnh hưởng của yếu tố pH542.5. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian nuôi cấy562.6. Ảnh hưởng các ion kim loại583. Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp593.1. Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột593.2. Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp613.3. Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp64KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ681. KẾT LUẬN682. KIẾN NGHỊ69TÀI LIỆU THAM KHẢO70

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ: KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHẠM CÔNG HOẠT

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầygiáo, cô giáo đã và đang giảng dạy tại bộ môn Di truyền học – Trường Đại Học SưPhạm Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em học tập và hoàn thành khóahọc

Cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Phạm CôngHoạt và TS Phạm Thị Tâm, là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạomọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới sự hỗ trợ về tài chính cũng như phương pháp từ đềtài cấp Nhà nước mã số KC06.15/11-15 Em xin cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Sinh,Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội, đặc biệt là tập thể cán bộ, họcviên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã chia sẻ khókhăn, giúp đỡ em để em thực hiện được các nội dung của đề tài

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài em không tránh khỏi được nhữngsai sót, kính mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn bỏ qua và đóng góp ýkiến để em hoàn thiện hơn

Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnhđộng viên và giúp đỡ em để em hoàn thành khóa học này

Hà Nội, tháng 9 năm 2014

Tác giả luận văn

Bùi Thị Thu Hằng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A : Aeromonas

AMP : Ampicillin

bp : Bazơ pair BSA : Bovine Serum Albumin

BLAST : Basis Local Aligment Search Tool

EDTA : Ethyllene diamine tetra acetic acidEtBr : Ethidium Bromide

LB : Lubria – Bertani

OD : Optical densityPBS : Phosphate bufferPCR : Polymerase Chain ReactionsIPTG : Isopropyl β-D- thiogalactoside

kD : Kilo dalton

kb : Kilo bazơ

RE : Restriction enzyme TAE : Tris - acetate - EDTA

UV : Ultra violet

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU 2

2.1 Mục tiêu chung 2

2.2 Mục tiêu cụ thể 2

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

4 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

4.1 Đối tượng nghiên cứu: 2

4.2 Nguyên liệu nghiên cứu: 2

4.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI 3

PHẦN II NỘI DUNG 4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1 Tổng quan về gelatin và gelatinase 4

2 Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase 7

3 Tình hình thực tế 11

4 Các thành phần thủy phân từ da cá 12

5 Biến nạp 13

6 Vector biểu hiện 14

7 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 16

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 19

1.1 Vật liệu 19

1.2 Hóa chất 21

1.3 Thiết bị 22

2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.1 Phương pháp điện di trên gel agarose 23

2.2 Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 24

2.3 Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose 25

2.4 Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) bằng phương pháp SDS-kiềm 25 2.5 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 26

2.6 Phương pháp nối gen 27

2.7 Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ 28

2.8 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli 29

2.9 Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E coli BL21(DE3) 30

2.10 Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni 2+ 31

2.11 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE 32

2.12 Phương pháp thu enzyme gelatinase 34

2.13 Phương pháp đánh giá khả năng phân giải của gelatinase với gelatin thô 35

2.14 Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase 35

2.15 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 35

2.16 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phát triển sinh khối và hoạt tính enzyme gelatinase 36

2.17 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase 36

2.18 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase 37

2.19 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase 37

2.20 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 37

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

1 Nghiên cứu biểu hiện gen gelatinase trong vi khuẩn E.coli BL21 38

1.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a + - GelE/A 38

1.2 Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ 41

1.3 Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 43

2 Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase 45

2.1 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen mã hóa gelatinase 45

2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp gelatinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp 48

2.3 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ 52

2.4 Ảnh hưởng của yếu tố pH 54

2.5 Ảnh hưởng của yếu tố thời gian nuôi cấy 56

2.6 Ảnh hưởng các ion kim loại 58

3 Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp 59

3.1 Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột 59

3.2 Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp 61

3.3 Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

1 KẾT LUẬN 68

2 KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Thành phần acid amin của gelatin ……… 5 Bảng 2 Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 7 Bảng 3 Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 13 Bảng 4 Ảnh hưởng của nguồn các bon và nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt

tính enzyme tái tổ hợp ……… 49

Bảng 5 Ảnh hưởng của các ion bổ sung đến khả năng phát triển sinh khối và hoạt

tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32/GelE 59

Bảng 6 Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase

……… 65

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ (Sđ)

Sđ 1 Biểu hiện gen mã hóa gelatinase (GelE) … 17

Sđ 2 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen GelE 18

Sđ 3 Xác định điều kiện tăng sinh của chủng vi khuẩn TTH pET 32a+/GelE 18

DANH MỤC CÁC BỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phân giải gelatin 60 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng phân giải gelatin 61 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của enzyme

gelatinase 66

Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của enzyme

gelatinase 67

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin 4

Hình 2a Cấu trúc gelatinase A 6

Hình 2b Cấu trúc gelatinase B 6

Hình 3 Hình thái A hydrophila………8

Hình 4 Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila……… 9

Hình 5 Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa 10

Hình 6 Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas……… ……….11

Hình 7 Sơ đồ pET32a+ dùng trong biểu hiện gen 19

Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng giữa GelE phân lập và GeneBank 38

Hình 1.2 Hình ảnh điện di gen GelE và vector pET32 a(+) cắt bằng các enzyme giới hạn Bam HI và Xho I 39

Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa gelatinase 40

Hình 1.4 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme BamHI và XhoI 41

Hình 1.5 Kết quả biến nạp vector pET32a/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3) và nuôi trên môi trường LBAmp 42

Hình 1.6 Kết quả điện di protein tái tổ hợp gelatinase trên gel SDS-PAGE 43

Hình 1.7 Điện di protein gelatinase tinh sạch trên SDS-PAGE 44

Hình 1.8 Hình ảnh phân giải gelatinase của enzyme thu được từ chủng E.coli BL21/pET 32-GelE 45

Hình 2.1 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli BL21 46

Hình 2.2 Mức độ biểu hiện protein GelE ở các nồng độ IPTG cảm ứng 47

Hình 2.3 Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nồng độ IPTG cảm ứng ………… 47

Hình 2.4 Ảnh hưởng của nguồn các bon đến khả năng sinh trưởng của chủng E.coli

BL21- pET32/GelE 50

Hình 2.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32/GelE 50

Hình 2.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 51

Hình 2.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32/GelE 52

Hình 2.8 Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nhiệt độ nuôi cấy 53

Hình 2.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 53

Hình 2.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 54

Hình 2.11 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 55

Hình 2.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 55

Hình 2.13 Mức độ biểu hiện gelatinase ở các giá trị pH khác nhau 56

Hình 2.14 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 57

Hình 2.15 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32/GelE 57

Hình 2.16 Mức độ biểu hiện gelatinase ở các giá trị OD khác nhau 58

Hình 3.1 Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin ở 370C ………60

Hình 3.2 Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí 61

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase 62

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase …… 63

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase 64

PHẦN I MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vàonhiều ngành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chấtthành sản phẩm nhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phảnứng xảy ra trong điều kiện êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phảnứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn đối với con người và thiên nhiên

Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuấtenzyme tái tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nôngnghiệp Cụ thể: Đề tài nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme cóchất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ănchăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổhợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen” Đề tài nghiên cứu công nghệsản xuất enzyme protease và lipase từ chủng vi sinh vật tái tổ hợp để ứng dụngtrong công nghệ thuộc da và sản xuất chất tẩy rửa Đề tài “Nghiên cứu sản xuấtenzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứngdụng sản xuất nước chấm”

Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác

dụng có thể thủy phân được gelatin Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn

gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không

vị, trong suốt hoặc có màu hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.

Gelatinase được tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau Pseudomonas,

Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các

liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin, tuy nhiênnguồn gelatinase này thường là tác nhân gây nên độc tố của vi khuẩn, đồng thời một

số loại vi khuẩn có thể gây hại đối với con người, động vật cây trồng như

Pseudomonasaeruginosa gây bệnh mủ xanh ở người không an toàn và hiệu quả

không cao, vì vậy sản xuất enzyme tái tổ hợp đang là hướng đi mới với mong muốntạo được nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn.

Mặt khác, để có một lượng gelatinase lớn ứng dụng trong thực tế với ngànhcông nghiệp chế biến bằng phương pháp thông thường sẽ khó chủ động, số lượngenzyme cần thiết sẽ không đáp ứng đủ Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp,

để từ đó sản xuất enzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt sẽ gópphần quan trong trong việc ứng dụng enzyme này với quy mô rộng, lớn

Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo

gelatinase tái tổ hợp và đánh giá đặc tính của enzyme ”.

1 Chế tạo được enzyme tái tổ hợp gelatinase

2 Xác định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase

3 Xác định được các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp, bao gồm: đặc tínhvật lý, hóa học của enzyme

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Nghiên cứu tạo chủng biểu hiện gen mã hóa gelatinase

2 Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa gelatinase

3 Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp

4 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

4.1 Đối tượng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp.

4.2 Nguyên liệu nghiên cứu: Gen mã hóa gelatinase nhóm A (kích thước 501bp)

được tách dòng từ 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas C4.4.1; và A.hydrophila C4.1.1.

4.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng

9/2014

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN II NỘI DUNG

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Tổng quan về gelatin và gelatinase

1.1 Gelatin

Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của

bò, lợn, cá Trong tự nhiên, gelatin đóng vai trò như một nguồn nitơ giàu dinhdưỡng, rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân giải gelatin tạo ra peptide và acidamin để xây dựng cấu trúc cơ thể của chúng Hiện nay, gelatin có nguồn gốc từ da

cá đang được xác định là nguồn cung cấp chính do nó giải quyết vấn đề xử lý chấtthải và tạo ra một sản phẩm giá trị gia tăng Gelatin được thu nhận từ sự biến tínhnhiệt phân Collagen có trong da, xương, mô liên kết của động vật, là một loạiprotein phổ biến trong giới động vật Gelatin hòa tan khi đun nóng (khoảng 40oC)

và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nước ở điều kiện bình thường có dạng sệt TheoHofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phân Collagen bởi nhiệt:

C102H149N31O38 (collagen) + H2O  C102H151N31O39 (gelatin)

Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, trong đó có 8 trên 9 acid aminthiết yếu, hàm lượng các acid amin glycelin, hydroxyproline đặc biệt cao, chiếmkhoảng 50% tổng số acid amin có trong gelatin (Hình 1)

Hình 1 Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin

Sản phẩm sau khi thủy phân gelatin bao gồm một số acid amin theo bảng sau:

Bảng 1 Thành phần acid amin của gelatin

STT Loại acid amin Tỉ lệ (% )

Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn

và động vật bậc cao Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase,

xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein vàpeptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, peptone Hoạt tính của enzymekhông chỉ phụ thuộc vào hoạt lực của nó mà còn phụ thuộc nhiều vào các tác nhânmôi trường mà nó xúc tác Enzyme này có khả năng thủy phân các cấu trúc ngoạibào như elastin, collagen và gelatin

Ở cơ thể con người, gelatinase được chia thành hai loại, đó là: gelatinase A

và gelatinase B (hình 2a, 2b) Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn được gọi là

collagenase 72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, được mã hóa bởi gen GelE có kích

thước là 501bp Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa còn được gọi là collagenase 92

kDa typ IV thuộc nhóm MMP-9, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là

615bp Enzyme này chủ yếu được sinh ra bởi các tế bào đại thực bào, tiểu cầu, bạchcầu đa nhân, bạch cầu trung tính, xơ phôi và tế bào sừng Chức năng chính củagelatinase là phối hợp với các MMPs khác để chỉnh sửa các mô sinh dưỡng, hỗ trợ

sự phát triển của phôi thai, hình thành mạch máu, tham gia quá trình rụng trứng,chữa lành vết thương, tham gia hình thành xương

Trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư, gelatinase 92kDa được sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của enzyme, còn trong chẩnđoán, gelatinase là yếu tố chỉ thị để chẩn đoán sớm sự di căn của khối u Đối vớilĩnh vực sản xuất thực phẩm, gelatinase cùng với colagentinase là những men tiêuhoá protit gân, bạc nhạc và protit liên kết thành những mạch peptit và acid amin

Hình 2a Cấu trúc gelatinase A Hình 2b Cấu trúc gelatinase B

Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lượng phân tử là 72 kDa,với trung tâm hoạt động có chứa ion Zn2+, hoạt động chính của enzyme này là thủyphân các liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn hơn và các acidamin các chủng sản sinh gelatinase (bảng 1)

Bảng 2 Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase Tên loài Hoạt tính Gelatinase

2 Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase

2.1 Vi khuẩn Aeromonas hyrophila

A.hydrophila là một loài vi khuẩn gram âm, có dạng hình que ngắn Kích

thước chiều rộng thường từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm Chúng không

có khả năng hình thành bào tử và có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4oC)

A hydrophila có khả năng di động nhờ vào tiên mao ở một đầu của vi khuẩn.

Trong một số điều kiện sinh trưởng nhất định một số tế bào có thể có tiên mao ởmột bên Chúng được xếp vào nhóm sinh vật dị dưỡng Loài này chủ yếu được tìmthấy trong các vùng khí hậu nhiệt đới như: Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, TháiLan, Úc và Việt Nam Chúng phân bố nhiều trong các vùng nước ngọt, nước lợ,mặn, ở các cửa sông ngoài ra còn có thể bắt gặp loài này trong các nguồn nước cóchứa clo và các hợp chất khác có hay không có clo Vi khuẩn này phổ biến hơntrong môi trường nuôi cá nước ngọt Nó được tìm thấy cả trong tầng nước đứng vàlớp trên cùng của lớp trầm tích (Hazen 1979) Cho tới những năm 1950, người ta

mới phân lập được loài này trên người và 1 số động vật A.hydrophila là loài được

biết đến nhiều nhất trong 6 loài thuộc Aeromonas Nó có thể tiêu hóa các vật liệu

như gelatin và hemoglobin Nó có khả năng thích nghi với các điều kiện khắc nghiệtcủa môi trường như: có thể sống được trong môi trường có chứa clo, bị làm lạnh,hay nhiệt độ thấp, vì vậy loài này rất khó bị tiêu diệt

Hình 3 Hình thái A hydrophila

A hydrophila thường được biết đến là nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ

trên cá Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ mà nó kí sinh, A hydrophila đi theo các mạch máu để đến với các tổ chức kí sinh đầu tiên, A hydrophila có thể kí sinh ở

bất cứ vị trí nào mà nó bắt gặp Khi kí sinh nó tăng sinh rất nhanh và sản sinh ra độc

tố Aerolysin Cytotoxic Enterotoxin (ACE), là loại độc tố có thể phá hoại tổ chức

mô Nó là nguyên nhân gây sự hư thối trên thực phẩm tươi sống bao gồm cả cá vàhải sản (Rustigan và Stuart, 1943; Amend và Fender, 1976; Daskalov, 2006) Tất

cả các loài A hydrophila, A caviae, A sobria đều được xem là tác nhân gây bệnh

cơ hội, nghĩa là chúng chỉ gây nhiễm khi hệ miễn dịch của kí chủ bị suy yếu

Hình 4 Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas

Phân loại khoa học

Giới (Domain): Bacteria

Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas denitrificans

Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn

Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiênmao) và không có bào tử Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linhhoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen Chúng thường sinh rasắc tố, các sắc tố này thường biểu thị cho độc tính của loại vi khuẩn này, chúng gâytổn thương hoặc làm mất hoạt tính sinh lý bình thường của các tế bào biểu mô trongđường hô hấp

Hình 5 Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở nhiều nơi trong môi trường Khả năng

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiềumôi trường khác nhau như nước, đất, trên cây, trên và trong các động vật Trong số

những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong

công nghệ sinh học

Một trong những enzyme quan trọng nhất do Pseudomonas sinh ra là

Protease Một số đề tài nghiên cứu về Protease của loại vi khuẩn này, kết quả chothấy enzyme Protease có hoạt tính cao trong canh cấy, và có các đặc tính khác nhau,

áp dụng có hiệu quả trong thực tế như đặc tính bền trong dung môi, không bị tácđộng bởi các ion kim loại, bền với chất tẩy rửa Bên cạnh đó chúng còn có khả năngtiết ra enzyme gelatinase phân giải gelatin có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp,dược phẩm, mỹ phẩm

Ở Cá, Pseudomonas thường gây nhiễm khuẩn huyết liên quan đến các stress,các thương tổn da, vẩy do các tác nhân cơ học, nuôi với mật độ cao, dinh dưỡngkém, hàm lượng ôxy giảm Chúng xâm nhập vào cơ thể cá qua các thương tổn ở

mang, da Các loài cá hay bị nhiễm khuẩn Pseudomonas là cá tra, cá basa, cá trê, cá

bống tượng, cá tai tượng gây nên những dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng đốmnhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng Bề mặt cơ thể có thểchảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất huyết vây và hậu môn

Hình 6 Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas

3 Tình hình thực tế

Theo báo cáo của Viện Nuôi trồng thủy sản II, sáu tháng đầu năm 2010,Đồng bằng sông Cửu Long đã xuất khẩu trên 300.000 tấn cá tra philê với kimngạch hơn 640 triệu đô la Mỹ Dự kiến cả năm các doanh nghiệp sẽ xuất 600.000tấn cá tra, kim ngạch đạt ít nhất 1,2 tỉ đô la Mỹ Hiện các tỉnh/thành phố vùng Đồngbằng Sông Cửu Long có 3.749 héc ta nuôi cá tra, trong đó Đồng Tháp, An Giangvới 2.340 héc ta Do có ưu điểm như dễ nuôi, lớn nhanh, thịt ngon nên tiềm năngnuôi cá tra vẫn còn khá lớn Việc phát triển nuôi cá tra sẽ làm tăng sản lượng cánuôi nước ngọt trong cả nước, tăng thêm lượng thủy sản xuất khẩu và góp phầnphát triển ổn định nghề nuôi

Tuy nhiên, so với năm 2009, trong những tháng qua, giá cá tra trên thị trườngquốc tế giảm từ 2,28 đô la Mỹ xuống còn 2,13 đôla Mỹ/kg, đã gây khó khăn không

ít cho các doanh nghiệp xuất khẩu Điều này khiến nhiều doanh nghiệp quan tâmhơn tới việc tăng doanh thu từ các nguồn khác như các mặt hàng chế biến sẵn, cácmặt hàng giá trị gia tăng, tận dụng phế phẩm của quá trình phi lê, tăng giá trị sửdụng cho phế phẩm Mặt khác, nếu không tận thu lượng phụ phẩm sau chế biến này

sẽ gây thất thoát lãng phí lớn trong sản xuất và ô nhiễm môi trường Trong khi đó,chúng ta lại hoàn toàn có thể tận dụng các phụ phẩm này thành các sản phẩm thủyphân có khả năng ứng dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, mỹ phẩm và sảnxuất nông nghiệp… đáp ứng được một lượng lớn nhu cầu ngày càng tăng cao về các

sản phẩm chống lão hóa, các sản phẩm làm đẹp, dược phẩm, thực phẩm chức năng,thức ăn nuôi trồng thủy sản hay các sản phẩm sử dụng trong nông nghiệp

Thành phần chủ yếu của phụ phẩm là các phần thừa, khó chế biến xử lý Dachứa 85% collagen, một loại protein có 19 acid amin, trong đó có 8 acid aminkhông thay thế, và có thể coi đây là một nguồn protein khá hoàn chỉnh, trong đó axitamin glycine, hydroxyproline và proline chiếm tới 50% tổng lượng acid amin trongcollagen Để xử lý nguồn phụ phẩm da cá tra thành acid amin, enzyme gelatinaseđược coi là giải pháp đem lại hiệu suất cao, tạo ra sản phẩm an toàn và ít gây ônhiễm môi trường

Như trên đã nói, hàng năm tại các nhà máy chế biến lượng da cá thải ra rấtlớn Từ thực trạng và bài toán kinh tế đó, Công ty Cổ phần Vĩnh Hoàn, Đồng Tháp

là công ty đầu tiên trong nước xây dựng nhà máy sản xuất collagen từ da cá tra/ cá

ba sa với công xuất 1000 tấn/ năm Theo dự báo kết quả kinh doanh nhà máy sảnxuất collagen của công ty này, ngay trong năm đầu hoạt động - năm 2012, lợi nhuậnsau thuế có thể đạt xấp xỉ 1,1 triệu USD, hay tỉ suất lợi nhuận trên doanh thu làkhoảng 15%

Từ collagen trong da cá, theo nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Nhãn,

2009, hiệu suất chiết tách gelatin từ da cá tra/ cá basa đạt 16%, nguồn gelatin nàyđạt các tiêu chuẩn dược điển Việt Nam III, hoàn toàn an toàn đối với vật nuôi vàcon người có thể sử dụng trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Như vậy, việc sản xuất acid amin từ da cá tra/ cá ba sa để sử dụng trongnghành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là một vấn đề khả thi và là một hướng điđúng đắn nhằm khai thác hiệu quả và triệt để hơn nghề nuôi cá tra vốn đang pháttriển rất mạnh

4 Các thành phần thủy phân từ da cá

Trên thực tế, thị phần của gelatin có nguồn gốc từ bò hoặc lợn đang dần giảm

do chi phí sản xuất cao, do dịch bệnh tai xanh ở lợn, xốp não, lở mồm long móng ở

bò (Jongjareonrak và cộng sự, 2006) Hơn nữa, chỉ có gelatin trong da cá mới đượcchấp nhận ở các quốc gia Hồi Giáo

Hiện nay, trên thế giới, gelatin có nguồn gốc từ da cá được sản xuất từ cá

tuyết, cá rô phi đen (Oreochromis mossambicus), cá rô phi đỏ (Oreochromis

nilotica), cá rô sông Nile (Lates niloticus), cá hồng (Priacanthus macracanthus), cá

mập, cá đối, ( Cheow và cộng sự, 2007)

Theo nghiên cứu của Panida và cộng sự, 2008, trong da cá rô phi sông Nile

có chứa 89,4% gelatin Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của các tác giả Go´ Guille´n và cộng sự, 2005 cho thấy: thủy phân gelatin từ da cá đã thu được 4 loạiacid amin chính, hàm lượng các acid amin này tương đương với các thành phầntrong gelatin từ da lợn (đã được thương mại hóa) (bảng 3)

mez-Bảng 3 Các thành phần acid amin chủ yếu trong da một số loại cá nước lạnh,

nước ấm và bì lợn (thành phần trong 1000g)

Loại acid amin Da cá

tuyết a

Da cá Alaska pollock b

Hake a Megrim a Cá rô

5 Biến nạp

Biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN Thông tin của

tế bào vi khuẩn nằm trên một phân tử ADN mạch kép vòng tròn đơn được gọi làgenophore, hay "nhiễm sắc thể" Gần đây đã phát hiện thấy rằng ít nhất ở một số

vi khuẩn có ADN tạo thành phức hợp với protein có tính base để hình thành sợi

nhiễm sắc như histon ở NST Eukaryote Ngoài ra ở một số vi khuẩn còn có thêmplasmid là phân tử ADN vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập.

Biến nạp được nghiên cứu kỹ nhất ở các chủng vi khuẩn Streptococcus

pneumonice, Baccilus subtilis, Haemophilus influenzae và một số nhóm vi khuẩn

khác

6 Vector biểu hiện

6.1 Vector biểu hiện

Vector biểu hiện gen là những vector được thiết kế dùng để biểu hiện một tínhtrạng hay tạo ra một loại protein Vector biểu hiện mang tất cả các đặc điểm củavector tách dòng như:

- Phải có điểm khởi đầu sao chép (origin) để có khả năng tự sao chép trong tếbào chủ

- Phải có trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ

- Có gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu…) cho phép

dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận

- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzyme giới hạn Các vị trícắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vectorban đầu

- Có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng ADN tối đa,đồng thời dễ xâm nhập vào tế bào chủ, sao chép nhanh và hiệu quả

Ngoài ra, để vector biểu hiện có thể biểu hiện được các gen trong cơ thể vậtchủ thì chúng cần có thêm các đặc điểm sau:

- Có chứa trình tự mã hóa gen chỉ thị (marker) để đảm bảo duy trì vector trong

- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong tế bào một hướng chính xác vớipromoter.

6.2 Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn E.coli

Theo Baneyx (1999), vi khuẩn E.coli là một trong những vật chủ được sử

dụng rộng rãi để tạo dòng và biểu hiện các sản phẩm protein ngoại lai từ các sinh

vật khác Hiện nay, việc tạo dòng và biểu hiện gen trong vi khuẩn E coli được ứng

dụng rất nhiều tại Việt Nam cũng như trên thế giới

E coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí, kỵ khí tùy tiện, thường gặp

trong đường ruột, phát triển dễ dàng trong các môi trường nuôi cấy thông thường,nhiệt độ tối ưu là 370C E.coli có 1 NST nằm trong thể nhân, là một chuỗi ADN trần

với khoảng 4.106 cặp base E.coli có quá trình biểu hiện gen gồm quá trình phiên

mã và giải mã xảy ra đồng thời Sau khi mARN được tổng hợp sẽ được sử dụng

ngay để dịch mã mà không qua quá trình sửa đổi sau phiên mã vì E.coli không có các intron Do sự đơn giản và tiện lợi đó mà E.coli là loại tế bào biểu hiện gen rộng

rãi nhất hiện nay thông qua quá trình sử dụng các plasmid đặc thù cho các loại sảnphẩm (protein ngoại lai) mà ta cần quan tâm

Vi khuẩn E.coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực biểu hiện gen do có

nhiều ưu điểm:

- Dễ nuôi, không đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, thiết bị, dụng cụ đơngiản, rẻ tiền góp phần hạ giá thành sản phẩm

- Trong ứng dụng là dòng E.coli đã được xử lý nên dễ dàng tiếp nhận plasmid tái tổ hợp cũng như quá trình nhân lên và biểu hiện của đoạn gen đó E.coli

dễ dàng biểu hiện rất nhiều gen có nguồn gốc cả Prokaryota và Eukaryota

- E.coli chứa một số promotor mạnh, có khả năng biểu hiện mạnh.

- E.coli có tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái

tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản phẩmprotein tái tổ hợp Khả năng tạo sản phẩm cao từ 50mg/l – 500mg/l

- Cấu trúc bộ gen của E.coli và đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu khá

đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu và sản xuất khi sử

dụng E.coli.

- Dòng tế bào E.coli được trong sản xuất tương đối an toàn, không có hoạt tính

gây bệnh, ít gây bệnh ở người và động vật

7 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

Sơ đồ 1 Biểu hiện gen mã hóa gelatinase (GelE)

Nối GelE/A vào pET32a+

Cắt bằng BamHI

và XhoI

Chuyển plasmid TTH vào E coli BL21

Tách plasmidTinh sạch gen GelE/A và pET32a+

PCR kiểm tra

Điện di SDS-PAGE

PCR kiểm tra

Sơ đồ 2 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen

GelE

Sơ đồ 3 Xác định điều kiện tăng sinh của chủng vi khuẩn TTH pET 32a + /GelE

Nuôi cấy vi sinh vật

Nhiệt độ 280C, 300C,

và 370C

Điện di SDS – PAGE

Xác định hoạt tính của gelatinase

pH  6, 7, và 8

Các ion kim loại

Nồng độ IPTG cảm ứng từ 1mM – 6mMThời gian 3h

Nồng độ Amp 100µg/ml

pH = 7

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị

1.1 Vật liệu

1.1.1 Các chủng vi sinh vật - Vi khuẩn E.coli

- Chủng E coli JM109 dễ dàng tiếp nhận và nhân lên một cách nhanh chóng

về số lượng các plasmid tái tổ hợp chứa gen ngoại lai Chủng này sống trong môitrường LB và được sử dụng làm vật chủ trong tách dòng gen

- Chủng E coli BL21(DE3) được sử dụng làm tế bào chủ biểu hiện gen gelatinase Đây là chủng được bắt nguồn từ E coli B, được phát hiện vào năm 1946,

có tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh

do có chứa promoter T7 mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã cósản phẩm protein tái tổ hợp

1.1.2 Vector sử dụng trong đề tài - Vector biểu hiện pET32a +

Hình 7 Sơ đồ pET32a + dùng trong biểu hiện gen

Vector pET32a+ là một vector thuộc hệ thống vector pET của hãng Novagen.Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao

của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E coli Vector pET32a+ (5.900 bp) thường được sửdụng với mục đích chính là biểu hiện gen

Vector pET32a+ được thiết kế để cho phép sản xuất một số lượng lớn proteinmong muốn Điều đặc biệt ở vector này là nó có chứa promoter T7 đó chính làT7ARN Polymerase hoạt động mạnh hơn rất nhiều so với promoter lac

10 g

5 g

10 gThêm nước cất vừa đủ 1.000ml

Môi trường LB thạch

Thành phần 1.000 ml

TryptonCao nấm menNaCl

Agar

10 g

5 g

10 g1,5 gThêm nước cất vừa đủ 1.000ml

Môi trường LB - Kháng sinh

Thành phần tương tự như môi trường LB lỏng, đĩa thạch

Bổ sung kháng sinh thích hợp theo tỉ lệ như sau:

Môi trường: Kháng sinh = 100ml : 100µl

Hóa chất tách plasmid từ tế bào vi khuẩn

- Solution I: Tris, HCl, EDTA, H2O

- Solution II: NaOH 5M, SDS, H2O

- Solution III: Potassium acetate, H2O

- Dung dịch Resin : Bột Resin, Guanidine hydrochloride 7M

- Cồn lạnh 700C: Cồn 960, H2O

- Dung dịch TE: 100mM Tris-HCl (pH 8,0), 10mM EDTA (pH 8,0)

Hóa chất chạy điện di gel agarose

- Dung dịch TAE 1X : Tris, Glacial acetic acid, EDTA

- Đệm nạp mẫu (ADN loading buffer 6X) : Sucrose, Bromophenol blue,Xylence cyanol FF

- Đệm TE 1X: 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 8,0)

- Dung dịch nhuộm ADN trên gel : Ethidium bromide (10mg/ml)

Hóa chất tinh sạch ADN từ gel agarose

Bao gồm: Guanidine thiocynate 6M, dung dịch Resin, cồn 700, đệm TAE

Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE

- Dung dịch pha gel: Acrylamide, Tris, HCl, SDS, Amonium persulfate,TEMED, H2O

- Dung dịch 5X Running buffer: Tris Base, Glycine, SDS, H2O

- Dung dịch 5X Sample buffer: Tris Base, HCl, Glycerol, SDS, Bromo phenolBlue, β mecraptoethanol

- Dung dịch nhuộm màu gel Staining buffer: Coomassi Brilliant Blue R250,Ethanol, acetic acid, H2O

- Dung dịch giải màu gel: Ethanol, acetic acid, H2O

1.3 Thiết bị

STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất

2 Máy ly tâm lạnh HERMLE, Đức

4 Máy hút chân không EYELA, Trung Quốc

8 Máy ly tâm ống eppendorf LABNET, Mỹ

9 Lò vi sóng SANYO, Nhật Bản

10 Tủ lạnh 4oC NATIONAL, Nhật Bản

11 Tủ lạnh -20oC FUNIKI, Nhật Bản

14 Nồi hấp tiệt trùng Trung Quốc

15 Máy quay cô chân không BUCHI, Đức

16 Máy đo pH HANNA, Italia

17 Micropipette CAPP, Đan Mạch

18 Đầu tip các loại BORENSON, Mỹ

19 Ống eppendorf BORENSON, Mỹ

20 Ống fancol JET, Trung Quốc

21 Đĩa petri, bình tam giác Trung Quốc

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc: Trong điện trường đều các phân tử axit nucleic tích điện âm sẽ

di chuyển về phía cực dương Tốc độ chuyển động của chúng trong điện trường cóhiệu điện thế không đổi phụ thuộc hai yếu tố: dạng tồn tại và kích thước của acid

nucleic Các acid nucleic có kích thước càng lớn thì chuyển động càng chậm, cácacid nucleic dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn dạng thẳng Sau mộtkhoảng thời gian dịch chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân tử có kích thước(trọng lượng) khác nhau sẽ tách xa vị trí ban đầu di chuyển những khoảng khácnhau,do đó chúng được tách Ta có thể phát hiện được chúng nhờ các kỹ thuậtnhuộm khác nhau như kỹ thuật nhuộm Ethidium Bromide (EtBr), kỹ thuật nhuộmbạc.

 Cách tiến hành:

+ Cân 0,3 gam agarose cho vào 30ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi dungdịch trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (từ 1-2 phút) Sau đó để nguộikhoảng 50º C thì bổ sung 1µl EtBr (10mg/ml) rồi đổ vào khuôn gel đã lắp sẵn lược

để tạo các giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau khi gel đã nguội hoàn toàn thì rút lược

và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel

+ Tra mẫu: lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA), trộnvới loading (giúp tạo màu dễ quan sát và giúp cho các phân tử ADN lắng xuốngtrong quá trình điện di) sau đó tra vào các giếng của gel

+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 110V, thời gian 30-40 phút

+ Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánhsáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm

2.2 Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Định nghĩa: PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction

(phản ứng trùng hợp - phản ứng khếch đại gen) được nhà bác học Kary Mullis vàcác cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và đã đoạt giải Nobel Hóa học tháng10/1993

Ðây là phương pháp invitro được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tửnhằm khuếch đại một đoạn ADN bằng cách sử dụng các cặp mồi để tổng hợp sốlượng lớn các bản sao dựa trên hoạt động của enzyme polymerase

Nguyên tắc của phương pháp PCR

Phương pháp PCR dựa trên sự hoạt động của enzyme ADN polymerase đểtổng hợp nên các phân tử ADN mới trong môi trường có bốn loạideoxyribonucleotides (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) và hai mồi trên cơ sở khuônmẫu của một đoạn ADN nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn ADNmới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kì, số lượng đoạnADN nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra,phân tích trình tự hoặc tạo dòng

Gen mã hóa gelatinase được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồiGelatinase-A và Gelatinase-B Thành phần phản ứng như sau:

STT Thành phần Thể tích (µl) Chu trình phản ứng

1 Master mix 2X 19,4 95ºC/ 5phút

95ºC/ 30 giây 60ºC/30giây 30 Cycles72ºC/ 30 giây

Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

2.3 Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose

 Nguyên tắc

Sản phẩm sau khi PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên bản gelagarose Kết thúc điện di, soi bản gel dưới đèn chiếu tia UV ta sẽ thấy thấy xuấthiện những băng vạch ADN có kích thước khác nhau trên Dựa vào kích thước củaADN chuẩn có thể chọn được băng ADN đích mong muốn Vì vậy, phải tiến hànhtinh sạch ADN từ bản gel agarose để thu được sản phẩm ADN đích bằng bộ Kithoặc sử dụng dung dịch Resin và máy hút chân không

- Tiếp đó thêm 600µl dung dịch resin, lắc đều và đưa vào chạy cột binding

column với máy hút chân không

- Cột được rửa hai lần, mỗi lần sử dụng 1 ml cồn lạnh 700, sau đó đem cột

ly tâm 10.000 vòng/phút, ở 40C trong 10 phút

- Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 20µl TE buffer, để 1-2 phút

rồi đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dung dịch chứa ADN đãtinh sạch

2.4 Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) bằng phương pháp SDS-kiềm

- Cấy chuyền các tế bào E.coli 5α có mang plasmid pET-32a(+) từ ống

nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 2 ml môi trường LB có bổ sungkanamycin nồng độ 30µg/ml Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ37°C

- Ly tâm thu sinh khối (13000 vòng/phút, 5 phút)

- Bổ sung 100 µl dung dịch I vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn, vortexthật kỹ

- Bổ sung 200 µl dung dịch II, đảo nhanh eppendorf thật nhẹ nhàng Ủ trênnước đá 5 phút

- Thêm 150 µl dung dịch III, đảo eppendorf thật kỹ cho đến khi thấy tủatrắng xuất hiện Ủ 5 phút trong đá

- Ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút - 10 phút ở 4°C Thu dịch nổi từeppendorf trên vào một eppendorf khác

- Thu nhận ADN plasmid bằng phương pháp tủa với ethanol tuyệt đối lạnh

- Hòa tủa trong 20 µl TE 1X + 2 µl RNase 10 mg/ml, bảo quản ở -20°C

2.5 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn

 Nguyên tắc

Enzyme giới hạn (Restriction enzyme = RE) là các nuclease do vi khuẩn sảnsinh ra, có khả năng nhận biết các đoạn ADN có trình tự nucleotid xác định, bámvào đoạn ADN đó và cắt cả hai sợi của phân tử ADN vào giữa hai nucleotid đốixứng nhau tại điểm cắt

 Phản ứng cắt bằng enzyme BamHI và XhoI

Phản ứng cắt plasmid pET 32a(+) và sản phẩm PCR g e l a t i n a s e

Trước khi tiến hành phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET 32a (+)/GelE, thựchiện phản ứng cắt plasmid pET-32a(+) và sản phẩm PCR g e l a t i n a s e , t h à n h

p h ầ n p h ả n ứ n g t h e o b ả n g s a u :

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện xử lý

pET-32a(+) /sản phẩm PCR 10

Phản ứng được thựchiện ở 37°C - 4 giờ,sau đó được ủ ở65°C - 10 phút

Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả

 Phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pET 32a (+)/GelE để kiểm tra sự có

2.6 Phương pháp nối gen

Nguyên tắc

Enzyme ADN ligase là loại enzyme xúc tác hình thành các liên kếtphosphoeste nối các đoạn ADN với nhau Mỗi loại enzyme ADN ligase có tính chấtđặc trưng riêng, có khả năng nối các đoạn ADN đầu bằng hoặc đầu so le Ví dụ,

enzyme E coli ADN ligase chỉ nối các đoạn ADN có đầu cắt so le.

 Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp giữa GelE với vector pET32a+

Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn sẽ được ghép nối với nhau nhờ phản ứng nối có thành phần và điều kiện trong bảng sau:

Thành phần phản ứng Thể tích(µl) Điều kiện xử lý

Ủ ở 40C qua đêm

GelE cắt bằng BamHI và XhoI 10

pET 32a(+) cắt bằng BamHI và XhoI 7

Tổng thể tích 20

Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả

2.7 Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ

Nguyên tắc

Tế bào khả biến là những tế bào đã được xử lý làm cho thành của tế bào mỏng

và xốp hơn Do vậy, khi bị sốc nhiệt đột ngột, màng của tế bào giãn ra, tạo điềukiện cho ADN chui qua lỗ màng vào tế bào chất dễ dàng Các tế bào khả biến saukhi nhận được ADN tái tổ hợp sẽ được chọn lọc và phát hiện trên môi trường chọnlọc riêng biệt Để biến nạp được vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ cần phảithực hiện tạo tế bào khả biến rồi biến nạp vào tế bào vật chủ bằng phương pháp sốcnhiệt

Phương pháp tạo tế bào khả biến

Các bước chuẩn bị tế bào khả biến bằng phương pháp hóa học sử dụng CaCl2

được tiến hành như sau:

 Tăng sinh cấp một:

- Chủng vi khuẩn được cấy ria trong môi trường LB đặc đã bổ sung kháng sinhphù hợp và nuôi qua đêm ở 370C.

- Lấy 1 khuẩn lạc E coli vào 3ml môi trường LB lỏng được chứa trong ống

fancol 15ml Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 370C, lắc 200 vòng/phút, thờigian 12-16 giờ

 Tăng sinh cấp hai:

- Cấy chuyền 500µl dịch nuôi cấy trên vào 50ml môi trường LB lỏng trongbình tam giác 250ml đã bổ sung kháng sinh thích hợp

- Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, 370C cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấyđạt khoảng 0,6 – 0,8

 Tạo tế bào khả biến:

- Chuyển dịch nuôi cấy vào ống fancol 50ml Ngâm trong nước đá 5-10 phút

- Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4 000 vòng/phút trong 10 phút, 40C Bỏ dịch

- Hòa tan sinh khối tế bào trong 10-15ml nước cất khử trùng đã được để lạnh

Phương pháp biến nạp vào tế bào chủ bằng phương pháp sốc nhiệt

- Đặt ống eppendorf chứa tế bào khả biến vào nước đá ngay sau khi lấy ra khỏi

tủ lạnh

- Bổ sung 2 - 5µl ADN plasmid vào, trộn đều Giữ trong nước đá 30 phút

- Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 420C trong 60 giây

- Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào nước đá để 1-2 phút

- Cho vào 500 µl môi trường LB lỏng Nuôi cấy lắc ở 370C, 200 vòng/phúttrong 1 giờ

- Lấy dịch cấy trang trên môi trường LB chứa X-gal, IPTG và kháng sinh thíchhợp Nuôi qua đêm ở 370C.

2.8 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli

 Nguyên tắc : Vi khuẩn được nuôi và nhân lên đến cuối giai đoạn log Tế bào

được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh, plasmid được thu lại bằngcách tủa với ethanol

 Quy trình :

1 Chọn các khuẩn lạc mọc trên đĩa LB+Ampicilin 100 µg/ml nuôi trong 3mlmôi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicilin với nồng độ 100µg/ml,nuôi lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút

2 Ly tâm (ống fancol 15ml) 5.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, loại dịch thusinh khối tế bào

3 Bổ sung 200µl Sol I (Glucoza 50mM; Tris-HCl 50mM, pH = 8,0; EDTA10mM, pH = 8,0 ), mix đều

4 Bổ sung 400µl Sol II (NaOH 200mM; SDS 1% ), đảo nhẹ bằng tay

5 Ly tâm 9.500 vòng/phút trong 10 phút, làm 2 lần

6 Hút 650µl – 700µl dịch nổi (không lẫn cặn) sang ống eppendorf mới

7 Bổ sung 650µl – 700µl Resin, lắc đều khoảng 2 phút

8 Lắp cột tách ADN vào máy hút chân không, rửa cột bằng nước cất 2 lần đãhấp, rửa 2 lần

9 Bơm hỗn hợp ADN: Resin vào cột tách, rồi tiến hành chạy cột

10 Rửa cột bằng 1 000µl ethanol 70% đã để lạnh, rửa 2 lần

11 Ly tâm 9.500 vòng/phút trong 10 phút để loại cồn

12 Bổ sung vào cột 30 µl nước deion, để yên trong 2 phút

13 Thay tube, rồi ly tâm 9 500 vòng/ phút, trong 10 phút ở 40C, thu được ADN

plasmid từ vi khuẩn E.coli Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

2.9 Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E coli

BL21(DE3)

1 Nuôi tăng sinh một khuẩn lạc E coli BL21 có chứa vector pET32a+- gen mãhóa gelatinase (vector pET32a+ có chứa gene mã hóagelatinase) trong ốngfancol chứa 3 ml môi trường LB-Amp (100mg/ml) lỏng ở 370C với tốc độlắc 150 vòng/phút, để qua đêm (14-16h).

2 Chuyển 800 µl dịch nuôi từ ống fancol sang bình tam giác có chứa 50 ml môitrường LB-Amp (100mg/ml) lỏng, tiếp tục nuôi ở 370C với tốc độ lắc 150vòng/phút trong khoảng từ 1-2h

3 Khi OD600 = 0,6-0,8 Lấy 1,3 ml dịch nuôi cho vào ống effendof mới để làmmẫu chuẩn Sau đó bổ sung IPTG cho tới khi nồng độ đạt 1mM vào dịchnuôi, tiếp tục nuôi lắc ở 300C, trong 6h tiếp theo

4 Tại các thời điểm sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h Lấy 1,3 ml dịch nuôi chovào ống effendorf mới để thu protein

5 Ly tâm thu tế bào Bổ sung từ 50-60µl dung dịch Sample buffer Vortex đểhòa tan tế bào Ngâm trong nước sôi từ 10-15p

6 Tiến hành điện di protein bằng phương pháp SDS-PAGE để định tính và địnhlượng protein sinh ra

2.10 Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni 2+

Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có đuôi His - tag gồm 6 axitamin histidin được mã hóa bởi các bộ ba mã hóa nằm trên vector pET-32a(+) donhà sản xuất thiết kế có ái lực mạnh với Ni2+ Do đó, protein tái tổ hợp dễ dàngđược tinh sạch thông qua phương pháp sắc ký ái lực sử dụng cột Nikel Quy trìnhtinh sạch bao gồm các bước:

- Ly tâm 400 ml dịch tế bào đã kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp vớitốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút rồi tiến hành thu cặn

- Thêm 15 ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer), ủ trong đá 5 phút

- Tiến hành ly tâm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 30 giây/lần, nghỉ 30 giâytrong 20 phút