3. Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp 1. Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột
3.3. Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp
3.3.1. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase
Các ion kim loại có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của bất kỳ enzyme nào thông qua việc tham gia vào hình thành cấu trúc của enzyme hoặc ảnh hưởng đến
hoạt tính của enzyme ở mức độ giữ vững cấu hình không gian, hay làm tăng tốc độ phản ứng thông qua việc tạo phức với cơ chất hoặc tham gia làm cầu nối kết hợp cơ chất với trung tâm hoạt tính của enzyme. Trong nghiên cứu này, để đánh giá ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase, các ion Ca2+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Fe2+, Mg2+, EDTA và β-mercaptoetanol được pha loãng ở nồng độ 2 – 10 mM được bổ sung vào dịch enzyme rồi ủ ở 500C trong 1 giờ. Dưới đây là bảng tổng kết ảnh hưởng của ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của enzyme gelatinase.
Bảng 6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase
Kết quả bảng 6 cho thấy các ion Mg2+, Ca2+, Fe2+ không làm ảnh hưởng hoặc làm tăng nhẹ hoạt tính của enzyme gelatinase, hoạt tính được giữ ở mức 100% - 115%. Trong khi đó các ion như: Cu2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính của enzyme ở nồng độ 5 -10 mM, còn ở nồng độ thấp 2 mM thì hoạt tính của gelatinase không bị ảnh hưởng nhiều. Còn đối với trường hợp của EDTA và β-mercaptoetanol thì gây kìm hãm rất mạnh đối với hoạt tính của enzyme gelatinase. Cụ thể là ở nồng độ rất thấp là 2 mM thì hoạt tính của enzyme gelatinase đã giảm xuống 0% đối với β- mercaptoetanol và 4% đối với EDTA.
3.3.2. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase
Khảo sát ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính của enzyme gelatinase bao gồm: Tween 20, Triton X-100, SDS tại các nồng độ 0,3%, 0,5%, 1%.
Dưới đây là biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính của
64 STT Ion bổ sung
Nồng độ ion (mM)
Không bổ sung 2 5 10
Hoạt tính tương đối (%)
1 Ca2+ 100 111 103 115
2 Cu2+ 100 105 96 95
3 Co2+ 100 110 102 92
4 Mn2+ 100 101 99 97
5 Fe2+ 100 105 110 104
6 Mg2+ 100 101 103 100
7 EDTA 100 4 0 0
8 β-mercaptoetanol 100 0 0 0
enzyme gelatinase khi xử lý ở các nồng độ 0,3%, 0,5% và 1% ủ với enzyme trong thời gian 1 giờ ở 50ºC.
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của enzyme gelatinase
Qua biểu đồ 3.3 ta thấy: Tween 20 nồng độ 0,3 – 1 % hầu như không ảnh hưởng đến hoạt tính của gelatinase. Hoạt tính của gelatinase vẫn giữ được 97 – 90%. Triton X-100 ở nồng độ 1% có ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính của gelatinase, tại nồng độ này thì hoạt tính của gelatinase đạt 87% so với hoạt tính ban đầu. Ở nồng độ thấp hơn thì enzyme gelatinase hầu như không bị ảnh hưởng và hoạt tính vẫn còn duy trì ở mức 97 – 98%. Tuy nhiên đối với SDS thì hoạt tính của gelatinase bị ảnh hưởng rừ rệt. Với nồng độ SDS càng cao thỡ hoạt tớnh gelatinase càng thấp, và dù ở nồng độ rất thấp là 0,3 % thì hoạt tính của gelatinase cũng bị giảm mạnh chỉ còn 53%. Thông thường, SDS ức chế rất mạnh hoạt động của các enzyme nói chung do SDS có khả năng hình thành một lớp điện tích cùng dấu (-) xung quanh phân tử protein enzyme và làm thay đổi cấu trúc của phân tử enzyme dẫn đến mất khả năng liên kết và phân giải hữu cơ.
3.3.3. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số dung môi đến hoạt tính của enzyme gelatinase bao gồm: MtOH, EtOH, IsOH, Act và nBtOH tại các nồng độ 10%, 20%, 30% . Dưới đây là biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ
đến hoạt tính của enzyme gelatinase khi xử lý ở các nồng độ 10%, 20% và 30%
trong thời gian 1 giờ tại nhiệt độ 50ºC.
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của enzyme gelatinase.
Qua biểu đồ 3.4 ta thấy: n-butanol (nBtOH) cú ảnh hưởng ức chế rừ rệt hoạt tính của enzyme gelatinase. Hoạt tính enzyme gelatinase giảm mạnh xuống còn 75% tại nồng độ 10% n-butanol và 64% tại các nồng độ 20% và 30%. Các dung môi hữu cơ khác như methanol, ethanol, isopropanol và aceton hầu như không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzyme, hoạt tính của enzyme tăng nhẹ lên 103% và giảm nhẹ xuống 90% ở nồng độ thí nghiệm là 10 – 30%.