Gen mã hóa gelatinase đã được nhóm nghiên cứu của khoa Công nghệ Sinh học, viện Đại học Mở Hà Nội xác định trình tự. Trình tự thu được có độ tương đồng 99% với trình tự gen GelE của GeneBank có mã số: DQ845100.1 (hình 1.1).
36
Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng giữa GelE phân lập và GeneBank Enterococcus faecalis GelE (gelE) gene, partial cds
Sequence ID: gb|DQ845100.1|Length: 580Number of Matches: 1
Score Expect Identities Gaps Strand Frame 1044 bits(565) 0.0 580/586(99%) 6/586(1%) Plus/Plus
Features:
Query 1 GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1 GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT 60 Query 61 ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 61 ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT 120 Query 121 TCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAACCTAGGTTCAAACGAAGAAGGTTTCGAA 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 121 TCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAACCTAGGTTCAAACGAAGAAGGTTTCGAA 180 Query 181 GTAATCATCGAAGCTATCGAAAAAGCTGGCTATGTTCCTGGTAAAGACGTTGTTCTTGCT 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 181 GTAATCATCGAAGCTATCGAAAAAGCTGGCTATGTTCCTGGTAAAGACGTTGTTCTTGCT 240 Query 241 ATGGATGCTGCCTCTTCAGAATTCTACGACAAAGAAAAAGGCGGTTACGTTTTAGCTGAC 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 241 ATGGATGCTGCCTCTTCAGAATTCTACGACAAAGAAAAAGGCGGTTACGTTTTAGCTGAC 300 Query 301 TCAGGCGAAGGTGGCGAAAATACAACTGTAGATATGATCGCGTTCTACGTAGTAAAATTA 360 ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||
Sbjct 301 TCAGGCGAA---GGCGAAAATACAACTGTAGATATGATCGCGTTCTACGTAGT---ATTA 354 Query 361 GTTTCTATATACCCAATCATTTCTATCGAAGACGGCTTAGACGAAAACGACTGGGACGGA 420 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 355 GTTTCTATATACCCAATCATTTCTATCGAAGACGGCTTAGACGAAAACGACTGGGACGGA 414 Query 421 TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC 480 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 415 TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC 474 Query 481 GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA 540 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 475 GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA 534 Query 541 ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA 586
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 535 ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA 580
Trong nghiên cứu này, vector pET 32a+ được lựa chọn làm vector biểu hiện gen GelE/A. Plasmid pJET 1.2 – GelE/A chứa trình tự đoạn gen GelE/A được tinh sạch và sử dụng trực tiếp để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen GelE/A.
Vector biểu hiện pET 32a+ là vector được thiết kế cho việc biểu hiện các gen ngoại lai trong vi khuẩn E. coli với nhiều ưu điểm. Vector này được rất nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới cũng như trong nước sử dụng trong việc sản xuất protein tái tổ hợp.
E. coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram âm được ưa chuộng nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp. Một trong những lý do là vì những thao tác kỹ thuật với E. coli khá dễ dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm. Thông thường, tất cả các chủng E. coli dùng trong biểu hiện đều xuất phát từ chủng E. coli K-12 hay B. Trong đề tài này, chúng tôi đã chọn chủng E. coli BL21(DE3) làm chủng biểu hiện.
Gen GelE/A và vector pET 32a+ được cắt lần lượt với enzyme BamHI rồi được điện di và tinh sạch. Sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt với XhoI. Sản phẩm xử lý enzyme cuối cùng sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%
(Hình 1.2) trước khi thực hiện phản ứng ghép nối với nhau (Hình 1.3).
Hình 1.2. Hình ảnh điện di gen GelE và vector pET 32a+ cắt bằng các enzyme giới hạn Bam HI và Xho I
M: thang chuẩn 10kb, 1: sản phẩm cắt gen GelE, 2: sản phẩm cắt vector pET 32a+ Kết quả điện di cho thấy sản phẩm cắt enzyme của gen GelE và vector pET 32a+ xuất hiện 1 băng duy nhất, có kích thước khoảng 0,5 kb và 5,9 kb, tương tự như kích thước lý thuyết của gen và vector. Kết quả này chứng tỏ, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn Bam HI và Xho I có chất lượng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích thước ban đầu của gen.
38
Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa gelatinase
Để kiểm tra sự tạo thành vector tái tổ hợp pET32a+ - GelE/A, vector tái tổ hợp pET32a+ - GelE/A được biến nạp vào tế bào chủng vi khuẩn khả biến E.coli JM109 bằng phương pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin với nồng độ 100 μg/ml, nuôi ở 370C, trong thời gian 16h.
Sau 16h nuôi cấy, trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc. Tiến hành nuôi các khuẩn lạc này trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp (100μg/ml), nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/ phút ở 370C, trong thời gian 16h. Sau đó tiến hành tách chiết ADN plasmid và cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Kết quả sau khi cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. (Hình 1.4).
Hình 1.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme BamHI và XhoI
M: thang chuẩn 10kb; 1: Sản phẩm PCR gen GelE; 2: sản phẩm cắt pET 32a+/ GelE với enzyme BamHI và XhoI
Kết quả điện di cho thấy: các enzyme giới hạn đã cắt plasmid thành hai băng có kích thước tương ứng với kích thước của gen GelE/A và vector pET 32a+. Để khẳng định gen GelE/A đã được chèn vào vector biểu hiện trên đúng khung và chiều đọc, không xuất hiện lỗi trong quá trình sao chép ADN, vector pET 32a+ - GelE/A được tinh sạch để xác định lại trình tự nucleotide và so sánh với trình tự cADN của GenBank. Sau khi phân tích trình tự dòng plasmid tái tổ hợp này, đoạn ADN mã hóa gelatinase có kích thước khoảng 501 bp và khung dịch mã được xác định với chuỗi polypeptide cắt đoạn tín hiệu đầu N tương ứng với 167 amino acid.
Như vậy có thể kết luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a+-GelE/A.
1.2. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ
Sau khi tạo thành công vector tái tổ hợp pET 32a+ - GelE/A, vector được biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu hiện là vi khuẩn E.coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi cấy trên đĩa LB có chứa kháng sinh ampicillin (100μg/ml) ở 37oC, qua đêm (16h). Kết quả nuôi cấy vi khuẩn được thể hiện ở hình 1.5.
40
Hình 1.5. Kết quả biến nạp vector pET 32a+/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3) và nuôi trên môi trường LBAmp
Nuôi tăng sinh bốn khuẩn lạc thuộc bốn dòng đã lựa chọn ở trên trong 3ml mụi trường LB-Amp (100àg/ml), nuụi lắc ở 370C. Sau 16 giờ nuụi cấy, dựng pipette hỳt lấy 500àl dịch nuụi tăng sinh sang bỡnh tam giỏc cú chứa 50ml mụi trường lỏng LB-Amp (100àg/ml). Nuụi lắc đến khi OD600nm của dịch nuụi đạt từ 0,5-0,6 thì tiến hành bổ sung chất cảm ứng IPTG đến khi đạt nồng độ 3mM và tiếp tục nuôi lắc ở nhiệt độ 280C với tốc độ lắc là 150 vòng/phút. Lấy mẫu tại các thời điểm chưa bổ sung IPTG, sau khi bổ sung IPTG 4h.
Điều kiện cảm ứng IPTG là 370C trên máy lắc với tốc độ 150rpm trong 4 giờ.
Đoạn gen mã hoá cho protein gelatinase được chèn vào vùng MCS của vector pET 32a+ và sự biểu hiện protein với sự kiểm soát của T7 promoter (hình 7). Trên vector pET 32a+ có chứa gen lacI mã hoá cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG.
Protein gelatinase sẽ được biểu hiện theo cơ chế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Protein GelE được biểu hiện ở dạng dung hợp đầu C với đoạn 6xHis. Sự biểu hiện protein GelE trong E coli BL21(DE3) bước đầu được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE.
Hình 1.6. Kết quả điện di protein tái tổ hợp gelatinase trên gel SDS-PAGE (M: thang chuẩn; giếng 1: E.coli BL21- pET32a+/GelE không cảm ứng với IPTG;
giếng 2-3: E.coli BL21- pET32+/GelE cảm ứng với IPTG; giếng 4: E.coli BL21- pET32+).
So sánh giữa hình ảnh điện di đồ của các mẫu có và không có chất cảm ứng IPTG, đồng thời so sánh kích thước với thang protein chuẩn ta thấy: các mẫu có cảm ứng với IPTG (đường chạy số 2-3) xuất hiện một băng protein mới có kích thước nằm ở khoảng giữa 72 kDa (tương ứng với kích thước lý thuyết của protein gelatinase có gắn đuôi His-tag) còn ở mẫu không cảm ứng với IPTG (đường chạy số 1) không thấy xuất hiện băng này. Hơn nữa, ở mẫu nuôi E.coli BL21- pET 32a+ cũng không bổ sung IPTG (đường chạy số 4) không thấy xuất hiện băng protein trên. Như vậy, băng protein xuất hiện mới này khả năng lớn chính là protein tái tổ hợp đích mà chúng tôi cần biểu hiện.
1.3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp
Chủng vi khuẩn biểu hiện gelatinase E.coli BL21- pET 32a+/GelE được nuôi cấy tăng sinh trong mụi trường LB cú nồng độ Amp 100 àg/ml; nhiệt độ nuụi cấy 37oC, thời gian tăng sinh 10 giờ sau đó bổ sung IPTG với nồng độ 3 mM để cảm
42
ứng trong 4 giờ, dịch nuôi cấy vi khuẩn được thu, tinh sạch và kiểm tra khả năng phân giải gelatinase.
Protein gelatinase tái tổ hợp có gắn với 6 histidine ở đầu N, có ái lực mạnh với Ni2+ vì vậy, có thể tinh chế bằng cột sắc ký ái lực Nikel- Chelating Resin. Sau khi phá tế bào bằng siêu âm, protein tái tổ hợp ở pha hoàn tan được đưa lên cột ProbondTM Nickel-Chelating Resin (Invitrogen). Các protein bám không đặc hiệu được loại bỏ bằng cách rửa cột nhiều lần với đệm rửa có nồng độ Immidazol là 70mM. Ở nồng độ này, hầu hết các protein bám không đặc hiệu bị đẩy ra khỏi cột, và giữ lại gelatinase. Protein này được tách ra khỏi cột bằng dung dịch thẩm tách có chứa 400 mM Immidazole. Các phân đoạn protein thu được sau khi tách ra khỏi cột được kiểm tra trên SDS-PAGE, kết quả thể hiện ở hình 1.7.
Hình 1.7. Điện di protein gelatinase tinh sạch trên SDS-PAGE M: Thang protein chuẩn, 1-4: gelatinase thu ở pha 1, 2, 3, 4
Kết quả điện di trên hình 1.7 cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thước 72 kDa, tương ứng với kích thước lý thuyết của gelatinase A. Kết quả này chứng tỏ rằng đã tinh sạch thành công protein gelatinase. Theo báo cáo của Vu và công sự 1998, kích thước của gelatinase A cũng có kích thước 72 kDa, tương tự với kích thước của protein tái tổ hợp được tạo ra bởi nghiên cứu này.
Nhằm chứng minh hoạt tính của gelatinase sau tinh sạch, chúng tôi sử dụng 4 phân đoạn tinh sạch từ dịch nuôi cấy, cảm ứng chủng E.coli BL21/pET 32a+-GelE rồi đánh giá mức độ phân giải gelatin của enzyme. Kết quả thể hiện trong hình 1.8
Hình 1.8. Hình ảnh phân giải gelatinase của enzyme thu được từ chủng E.coli BL21/pET 32-GelE
1: phân đoạn 1; 2: phân đoạn 3; 3: phân đoạn 4; 4-6: phân đoạn 2
Kết quả hình 1.8 cho thấy, enzyme sau quá trình tinh sạch trên cột sắc ký ProbondTM Nickel-Chelating Resin (Invitrogen) đảm bảo hoạt tính.