3. Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp 1. Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột
3.2. Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi
60
trường. Gelatinase tái tổ hợp sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở các nhiệt độ 300C, 370C, 450C, 500C, 600C, 700C, 800C trong 10h-60h. Ảnh hưởng của nhiệt độ được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so sánh tỷ lệ hoạt độ của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng âm không bổ sung các ion.
Theo dừi thớ nghiệm trong 12 giờ với cỏc mẫu enzyme được xử lý ở 300C, 370C, 450C, 500C, 600C, 700C, 800C chúng tôi thu được kết quả như hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase Kết quả hình 3.3 cho thấy: Khi có ion Ca2+ thì hoạt tính enzyme cao nhất ở 45°C, đạt 96%, tuy nhiên trong khoảng từ 370C-500C, hoạt tính của enzyme đạt trong khoảng 85-96%. Khi không có Ca2+ hoạt tính của gelatinase luôn thấp hơn, khi xử lý mẫu ở 37-500C, hoạt tính của enzyme đạt trong khoảng 68-89%, nhiệt độ phù hợp nhất là 45°C với hoạt tính tương đối đạt 88%. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy, nhiệt độ từ 370C đến 50°C không làm thay đổi vùng liên kết với Ca2+ của enzyme. Nhiệt độ càng tăng thì các liên kết trong cấu trúc (liên kết hydro, liên kết Van der Wall, lực hút tĩnh điện) có thể đã thay đổi, vì vậy, ion Ca2+ không có tác động tích cực, hoạt tính của enzyme được xử lý ở nhiệt độ trên 50°C trong điều kiện có và không có Ca2+ làtương tự nhau, đều giảm tuyến tính theo mức độ tăng của nhiệt độ ủ. Gelatinase là enzyme ổn nhiệt.
Độ bền nhiệt của gelatinase theo dừi trong 60 giờ ở điều kiện xử lý nhiệt là 50°C, cứ mỗi 6 giờ, enzyme lại được đánh giá hoạt tính một lần, chúng tôi thu được kết quả như hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase Kết quả hình 3.4 cho thấy: Hoạt tính enzyme ổn định trong 12 giờ đầu, sau đó, thời gian ủ càng lâu thì hoạt tính càng giảm, đến 60 giờ thì khả năng thủy phân gelatin cho còn đạt 8-12% so với hoạt tính ban đầu. Điều đáng quan tâm đó là khi bổ sung ion Ca2+ thì hoạt tính của enzyme giảm chậm hơn, hoạt tính tương đối của enzyme xử lý bổ sung Ca2+ ở thời điểm 36 giờ tương đương với hoạt tính tương đối của enzyme không bổ sung Ca2+ ở thời điểm 24 giờ. Kết quả này một lần nữa chứng minh rằng ion Ca2+ có ảnh hưởng lớn đến độ bền của cấu trúc cũng như hoạt tính của gelatinase.
Từ các kết quả trên, chứng tỏ,enzyme gelatinase hoạt động tốt nhất ở 500C trong 12 giờ xử lý.
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase
Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của enzyme làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme– cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme. Hoạt tớnh của enzyme phụ thuộc rừ rệt vào pH mụi trường do ảnh hưởng đến mức độ ion
62
hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó, phức hệ enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2), hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng xung quanh giá trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ.
Dưới đây là biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối của gelatinase (Hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase
Kết quả hình 3.5 cho thấy: Sự bổ sung ion Ca2+ có vai trò trong việc ổn định hoạt tính của enzyme ở pH từ 7-7,5. So sánh về ảnh hưởng của ion Ca2+ và độ pH đến hoạt tính enzyme cũng chứng tỏ rằng pH = 7 thích hợp nhất đối với hoạt tính của gelatinase. Với kết quả nghiên cứu này cho phép kết luận rằng gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease trung tính, đặc tính này của gelatinase cũng tương tự các enzyme khác của họ metalloprotease. Độ bền pH của gelatinase tái tổ hợp tương tự với enzyme tự nhiên.