2. Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp gelatinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ và các bon) đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa gelatinase E.coli BL21- pET32a+/GelE và hoạt tính của enzyme gelatinase được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4. Ảnh hưởng của nguồn các bon và nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme tái tổ hợp
Các thông số sinh trưởng
Các bon Nitơ
Glucos
e Sucrose Lactose Yeast
extract Peptone NH4Cl NH4(SO2)4 Urea Mật độ
sinh khối (OD600)
2.57 ± 0.03
2.23 ±
0.09 0.79 ±
0.02 3.17 ±
0.03 3.18 ±
0.01 1.23 ±
0.00 1.25 ± 0.14
0.41
± 0.01
D-d
(mm) 8.12 7.33 1.34 8.22 8.48 3.52 3.92 1.59
Kết quả trong bảng cho thấy, glucose là cơ chất cacbon phù hợp hơn cả cho sự phát triển của chủng vi khuẩn biểu hiện, với hàm lượng sinh khối là 2.57 g/L.
Đường sucrose cũng tương đối phù hợp cho sự phát triển của chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE, với nồng độ sinh khối sau tăng sinh đạt 2.23 g/L. Đường lactose không hoàn toàn phù hợp cho sinh trưởng phát triển của chủng, với hàm lượng sinh khối thấp nhất, chỉ đạt 0.79 g/L. Bờn cạnh đú, theo dừi động thỏi học sinh trưởng của sinh khối chủng biểu hiện trong 16 giờ, với 2 giờ kiểm tra nồng độ sinh khối 1 lần cho kết quả trong hình 2.4.
48
Hình 2.4. Ảnh hưởng của nguồn các bon đến khả năng sinh trưởng của chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (◊: glucose, sucrose, ∆: lactose)
Kết quả trong hình 2.4 cho thấy có sự khác biệt lớn về tốc độ tăng trưởng của sinh khối vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có bổ sung glucose và sucrose so với sinh khối vi khuẩn được nuôi trong môi trường bổ sung lactose.
Đánh giá về hoạt tính gelatinase của chủng biểu hiện, kết quả thể hiện trong hình 2.5.
Hình 2.5. Ảnh hưởng của nguồn các bon đến hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (◊: glucose, sucrose, ∆: lactose)
Kết quả hình 2.5 cho thấy: Bắt đầu sau 8 giờ tăng sinh, hoạt tính của enzyme đạt ở ngưỡng cao nhất và giảm không đáng kể sau 16 giờ. Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung glucose và sucrose, hoạt tính gelatinase của vi khuẩn vượt trội hơn so với hoạt tính của mẫu tăng sinh trong lactose, trong đó hoạt tính của mẫu tăng sinh trong glucose đạt cao nhất. Từ các kết quả này chứng tỏ, glucose là nguồn các bon phù hợp nhất cho sự phát triển cũng như hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE.
Về ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE được đánh giá với hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ. Trong đó, nguồn nitơ vô cơ: urea, NH4Cl và (NH4)2SO4, nguồn nitơ hữu cơ sử dụng là yeast extract và peptone. Kết quả theo dừi ảnh hưởng của cỏc loại cơ chất nitơ được thể hiện trong hình 2.6.
Hình 2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: yeast extract, ■: peptone, ∆: NH4Cl,
Ο: (NH4)2SO4, : urea)
Kết quả hình 2.6 cho thấy: Nguồn nitơ hữu cơ là phù hợp hơn cho sự phát triển của chủng tái tổ hợp E.coli BL21- pET 32a+/GelE. Nồng độ sinh khối tăng sinh trong môi trường bổ sung yeast extract và peptone đạt 3.17 và 3.18 g/L trong khi đó, nồng độ sinh khối tăng sinh trong các môi trường bổ sung NH4Cl, (NH4)2SO4 và urea chỉ đạt: 1.23, 1.25 và 0.41 g/L. Kết quả này chứng tỏ, nguồn nitơ hữu cơ có vai trò tăng cường khả năng tăng trưởng của sinh khối chủng biểu hiện.
Bên cạnh các amino acid, yeast extract và peptone còn chứa các chất khoáng thiết yếu cho sự phát triển của E.coli BL21- pET32a+/GelE, hơn nữa, môi trường bổ sung yeast extract thường có độ pH ổn định, không gây tác động xấu cho sự sinh sản của quần thể.
Theo dừi hoạt tớnh gelatinase của cỏc mẫu E.coli BL21- pET32a+/GelE được tăng sinh trong môi trường có cơ chất nitơ khác nhau cho kết quả thể hiện trong hình 2.7.
50
Hình 2.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: yeast extract, ■: peptone,∆: NH4Cl,Ο: (NH4)2SO4, :
urea)
Kết quả hình 2.7 thể hiện hoạt tính phân giải gelatin của các mẫu vi khuẩn tăng sinh trong môi trường có chứa yeast extract hoặc peptone cao hơn 2-5 lần so với hoạt tính của các mẫu tăng sinh trong môi trường chứa nitơ vô cơ.