1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vào nhiều ngành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm nhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản ứng xảy ra trong điều kiện êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn đối với con người và thiên nhiên. Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp. Cụ thể: Đề tài nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen”. Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác dụng có thể thủy phân được gelatin. Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không vị, trong suốt hoặc có màu hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Gelatinase được tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin, tuy nhiên nguồn gelatinase này thường là tác nhân gây nên độc tố của vi khuẩn, đồng thời một số loại vi khuẩn có thể gây hại đối với con người, động vật cây trồng như Pseudomonasaeruginosa gây bệnh mủ xanh ở người không an toàn và hiệu quả không cao, vì vậy sản xuất enzyme tái tổ hợp đang là hướng đi mới với mong muốn tạo được nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn. Mặt khác, để có một lượng gelatinase lớn ứng dụng trong thực tế với ngành công nghiệp chế biến bằng phương pháp thông thường sẽ khó chủ động, số lượng enzyme cần thiết sẽ không đáp ứng đủ. Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp, để từ đó sản xuất enzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt sẽ góp phần quan trong trong việc ứng dụng enzyme này với quy mô rộng, lớn. Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo gelatinase tái tổ hợp và đánh giá đặc tính của enzyme ”.
Trang 1PHẦN I MỞ ĐẦU
1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vào nhiềungành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩmnhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản ứng xảy ra trong điều kiện
êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toànđối với con người và thiên nhiên
Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuất enzyme tái
tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp Cụ thể: Đề tàinghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vậttái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựngquy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóaplasminogen”
Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác dụng có thể
thủy phân được gelatin Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của
da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không vị, trong suốt hoặc có màu hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Gelatinase được tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau Pseudomonas,
Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các liên kết
peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin, tuy nhiên nguồngelatinase này thường là tác nhân gây nên độc tố của vi khuẩn, đồng thời một số loại vi
khuẩn có thể gây hại đối với con người, động vật cây trồng như Pseudomonasaeruginosa
gây bệnh mủ xanh ở người không an toàn và hiệu quả không cao, vì vậy sản xuất enzyme tái
tổ hợp đang là hướng đi mới với mong muốn tạo được nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn
Mặt khác, để có một lượng gelatinase lớn ứng dụng trong thực tế với ngành côngnghiệp chế biến bằng phương pháp thông thường sẽ khó chủ động, số lượng enzyme cầnthiết sẽ không đáp ứng đủ Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp, để từ đó sản xuấtenzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt sẽ góp phần quan trong trongviệc ứng dụng enzyme này với quy mô rộng, lớn
Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo gelatinase tái
tổ hợp và đánh giá đặc tính của enzyme ”.
Trang 22 Xác định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase
3 Xác định được các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp, bao gồm: đặc tính vật lý,hóa học của enzyme
3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1 Nghiên cứu tạo chủng biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2 Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa gelatinase
3 Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp
4 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
4.1 Đối tượng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp.
4.2 Nguyên liệu nghiên cứu: Gen mã hóa gelatinase nhóm A (kích thước 501bp) được
tách dòng từ 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas C4.4.1; và A.hydrophila C4.1.1.
4.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng 9/2014.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại
Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn,
cá Gelatin hòa tan khi đun nóng (khoảng 40oC) và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nước ởđiều kiện bình thường có dạng sệt Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phânCollagen bởi nhiệt:
C102H149N31O38 (collagen) + H2O C102H151N31O39 (gelatin)
Trang 3Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, trong đó có 8 trên 9 acid amin thiết yếu(Hình 1).
Hình 1 Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin
Sản phẩm sau khi thủy phân gelatin bao gồm một số acid amin theo bảng sau:
Bảng 1 Thành phần acid amin của gelatin
Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn và động
vật bậc cao Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase, xúc tác cho quá
trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acidamin tự do, một ít peptid ngắn, peptone Enzyme này có khả năng thủy phân các cấu trúcngoại bào như elastin, collagen và gelatin
Trang 4Ở cơ thể con người, gelatinase được chia thành hai loại, đó là: gelatinase A vàgelatinase B (hình 1a, 1b) Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn được gọi là collagenase
72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là 501bp.
Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa còn được gọi là collagenase 92 kDa typ IV thuộc nhóm
MMP-9, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là 615bp
Hình 2a Cấu trúc gelatinase A Hình 2b Cấu trúc gelatinase B
Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lượng phân tử là 72 kDa, với trungtâm hoạt động có chứa ion Zn2+ (bảng 1)
Bảng 2 Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase
2 Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase
2.1 Vi khuẩn Aeromonas hyrophila
A.hydrophila là một loài vi khuẩn gram âm, có dạng hình que ngắn Kích thước chiều
rộng thường từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm Chúng không có khả năng hìnhthành bào tử và có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4oC)
Trang 5Hình 3 Hình thái A hydrophila
A hydrophila thường được biết đến là nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ trên cá.
Hình 4 Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas
Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas denitrificans
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn Gram
âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên mao) và không cóbào tử
Hình 5 Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa
Một trong những enzyme quan trọng nhất do Pseudomonas sinh ra là Protease Bên
cạnh đó chúng còn có khả năng tiết ra enzyme gelatinase phân giải gelatin có ý nghĩa rất lớntrong công nghiệp, dược phẩm, mỹ phẩm
Các loài cá hay bị nhiễm khuẩn Pseudomonas là cá tra, cá basa, cá trê, cá bống
tượng, cá tai tượng gây nên những dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng đốm nhỏ trên da,
Trang 6xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng Bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớtnhưng không xuất huyết vây và hậu môn.
Hình 6 Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas
Hake a Megrim a Cá rô
6 Vector biểu hiện
6.1 Vector biểu hiện
6.2 Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn E.coli
7 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm
Trang 7CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị
1.1 Vật liệu
1.1.1 Các chủng vi sinh vật - Vi khuẩn E.coli
1.1.2 Vector sử dụng trong đề tài - Vector biểu hiện pET32a +
Hình 7 Sơ đồ pET32a + dùng trong biểu hiện gen 1.1.3 Mồi
Hóa chất tách plasmid từ tế bào vi khuẩn
Hóa chất chạy điện di gel agarose
Hóa chất tinh sạch ADN từ gel agarose
Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE
1.3 Thiết bị
Trang 82 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Phương pháp điện di trên gel agarose
2.2 Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase ChainReaction)
2.3 Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose
2.4 Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) bằng phương pháp SDS-kiềm
2.5 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
2.6 Phương pháp nối gen
2.7 Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ
2.8 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli
2.9 Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E coli BL21(DE3)
2.10 Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
2.11 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE
2.12 Phương pháp thu enzyme gelatinase
2.13 Phương pháp đánh giá khả năng phân giải của gelatinase với gelatin thô
2.14 Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase
2.15 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
2.16 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phát triển sinhkhối và hoạt tính enzyme gelatinase
2.17 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase2.18 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase
2.19 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase2.20 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Trang 9CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Nghiên cứu biểu hiện gen gelatinase trong vi khuẩn E.coli BL21
1.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a + - GelE/A
Gen mã hóa gelatinase đã được nhóm nghiên cứu của khoa Công nghệ Sinh học, việnĐại học Mở Hà Nội xác định trình tự Trình tự thu được có độ tương đồng 99% với trình tựgen GelE của GeneBank có mã số: DQ845100.1 (hình 1.1)
Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng giữa GelE phân lập và GeneBank
Enterococcus faecalis GelE (gelE) gene, partial cds
Sequence ID: gb|DQ845100.1|Length: 580Number of Matches: 1
Score Expect Identities Gaps Strand Frame
1044 bits(565) 0.0 580/586(99%) 6/586(1%) Plus/PlusFeatures:
Gen GelE/A và vector pET 32a+ được cắt lần lượt với enzyme BamHI rồi được điện
di và tinh sạch Sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt với XhoI Sản phẩm xử lý enzyme cuối
cùng sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 1.2) trước khi thựchiện phản ứng ghép nối với nhau (Hình 1.3)
Trang 10Hình 1.2 Hình ảnh điện di gen GelE và vector pET 32a + cắt bằng các enzyme giới
hạn Bam HI và Xho I
M: thang chuẩn 10kb, 1: sản phẩm cắt gen GelE, 2: sản phẩm cắt vector pET 32a+ Kết quả điện di cho thấy sản phẩm cắt enzyme của gen GelE và vector pET 32a+
xuất hiện 1 băng duy nhất, có kích thước khoảng 0,5 kb và 5,9 kb, tương tự như kích thước
lý thuyết của gen và vector Kết quả này chứng tỏ, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng hai
enzyme cắt giới hạn Bam HI và Xho I có chất lượng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích
thước ban đầu của gen
Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa gelatinase
Hình 1.4 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzyme BamHI và XhoI
M: thang chuẩn 10kb; 1: Sản phẩm PCR gen GelE; 2: sản phẩm cắt pET 32a + / GelE
với enzyme BamHI và XhoI
Trang 11Kết quả điện di cho thấy: các enzyme giới hạn đã cắt plasmid thành hai băng có kíchthước tương ứng với kích thước của gen GelE/A và vector pET 32a+ Như vậy có thể kếtluận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a+-GelE/A.
1.2 Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ
Kết quả nuôi cấy vi khuẩn được thể hiện ở hình 1.5
Hình 1.5 Kết quả biến nạp vector pET 32a +/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3)
và nuôi trên môi trường LBAmp
Sự biểu hiện protein GelE trong E coli BL21(DE3) bước đầu được phân tích bằng
phương pháp SDS-PAGE
Hình 1.6 Kết quả điện di protein tái tổ hợp gelatinase trên gel SDS-PAGE
(M: thang chuẩn; giếng 1: E.coli BL21- pET32a + /GelE không cảm ứng với IPTG; giếng 3: E.coli BL21- pET32 + /GelE cảm ứng với IPTG; giếng 4: E.coli BL21- pET32 + ).
2-So sánh giữa hình ảnh điện di đồ của các mẫu có và không có chất cảm ứng IPTG,đồng thời so sánh kích thước với thang protein chuẩn ta thấy: các mẫu có cảm ứng với IPTG(đường chạy số 2-3) xuất hiện một băng protein mới có kích thước nằm ở khoảng giữa 72kDa (tương ứng với kích thước lý thuyết của protein gelatinase có gắn đuôi His-tag) còn ởmẫu không cảm ứng với IPTG (đường chạy số 1) không thấy xuất hiện băng này Hơn nữa,
ở mẫu nuôi E.coli BL21- pET 32a+ cũng không bổ sung IPTG (đường chạy số 4) khôngthấy xuất hiện băng protein trên Như vậy, băng protein xuất hiện mới này khả năng lớnchính là protein tái tổ hợp đích mà chúng tôi cần biểu hiện
Trang 121.3 Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp
Các phân đoạn protein thu được sau khi tách ra khỏi cột được kiểm tra trên PAGE, kết quả thể hiện ở hình 1.7
SDS-Hình 1.7 Điện di protein gelatinase tinh sạch trên SDS-PAGE
M: Thang protein chuẩn, 1-4: gelatinase thu ở pha 1, 2, 3, 4
Kết quả điện di trên hình 1.7 cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều chỉxuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thước 72 kDa, tương ứng với kích thước lýthuyết của gelatinase A Kết quả này chứng tỏ rằng đã tinh sạch thành công proteingelatinase Theo báo cáo của Vu và công sự 1998, kích thước của gelatinase A cũng có kíchthước 72 kDa, tương tự với kích thước của protein tái tổ hợp được tạo ra bởi nghiên cứunày
Nhằm chứng minh hoạt tính của gelatinase sau tinh sạch, chúng tôi sử dụng 4 phân
đoạn tinh sạch từ dịch nuôi cấy, cảm ứng chủng E.coli BL21/pET 32a+-GelE rồi đánh giámức độ phân giải gelatin của enzyme Kết quả thể hiện trong hình 1.8
Hình 1.8 Hình ảnh phân giải gelatinase của enzyme thu được từ chủng E.coli
BL21/pET 32-GelE
1: phân đoạn 1; 2: phân đoạn 3; 3: phân đoạn 4; 4-6: phân đoạn 2
Kết quả hình 1.8 cho thấy, enzyme sau quá trình tinh sạch trên cột sắc kýProbondTM Nickel-Chelating Resin (Invitrogen) đảm bảo hoạt tính
Trang 132 Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2.1 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen mã hóa gelatinase
Kết quả biến nạp được thể hiện ở hình 2.1
Hình 2.1 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli BL21
Chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE được nuôi cấy ở các điều kiện pH = 7, thời giantăng sinh 3 giờ, nhiệt độ tăng sinh 370C, nồng độ kháng sinh ampicillin là 100 g/ml, nồng
độ IPTG cảm ứng là 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM Kết quả thí nghiệm được kiểmtra bằng điện di SDS – PAGE, thể hiện ở hình 2.2
Hình 2.2 Mức độ biểu hiện protein GelE ở các nồng độ IPTG cảm ứng
M: thang protein chuẩn, 1-6: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E.coli pET32a + /GelE được cảm ứng với các nồng độ IPTG là 6, 5, 4, 3, 2, 1mM, 7: không cảm
BL21-ứng IPTG
Kết quả điện di cho thấy, nồng độ IPTG từ 1-6mM đều cảm ứng sinh gelatinase.Trên hình ảnh điện di đồ, cả 6 mẫu này đều xuất hiện vạch tương ứng với kích thước 72kDa,tương ứng với trọng lượng lý thuyết của enzyme gelatinase
Dịch tăng sinh của chủng vi khuẩn biểu hiện được cảm ứng với IPTG và không cảmứng với IPTG được tách để định xác định hoạt tính gelatinase Kết quả thí nghiệm được thểhiện ở hình 2.3
Trang 14Hình 2.3 Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nồng độ IPTG cảm ứng
Hình 2.3 cho thấy: Các mẫu được cảm ứng với IPTG nồng độ 1 và 2mM có hoạt lựcgelatinase mạnh hơn các mẫu cảm ứng với IPTG nồng độ 3-6mM Kết quả này chứng tỏ,hàm lượng IPTG là 1mM là phù hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp gelatinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ và các bon) đến sự sinh
trưởng của chủng vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa gelatinase E.coli BL21- pET32a+/GelE vàhoạt tính của enzyme gelatinase được trình bày trong bảng 4
Bảng 4 Ảnh hưởng của nguồn các bon và nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính
enzyme tái tổ hợp Các
thông
số sinh
trưởng
Glucose Sucrose Lactose Yeast
extract Peptone NH4Cl NH4(SO2)4 Urea
0.79 ±0.02
3.17 ±0.03
3.18 ±0.01
1.23 ±0.00
1.25 ±0.14
0.41
±0.01
D-d
Kết quả trong bảng cho thấy, glucose là cơ chất cacbon phù hợp hơn cả cho sự pháttriển của chủng vi khuẩn biểu hiện Bên cạnh đó, theo dõi động thái học sinh trưởng củasinh khối chủng biểu hiện trong 16 giờ, với 2 giờ kiểm tra nồng độ sinh khối 1 lần cho kếtquả trong hình 2.4