CHUYÊN ĐỀ 4: SINH SẢN Ở THỰC VẬT

Khái niệm về Công nghệ Sinh học trong sinh sản của thực vật - Theo liên đoàn Công nghệ Sinh học châu Âu EFB: Công nghệ Sinh học là sự ứng dụng tổng hợp của Sinh hoá học, vi sinh vật học

1

CHUYÊN ĐỀ 4: SINH SẢN Ở THỰC VẬT

I Nội dung chuyên đề

1 Khái niệm về Công nghệ Sinh học trong sinh sản của thực vật

- Theo liên đoàn Công nghệ Sinh học châu Âu (EFB): Công nghệ Sinh học

là sự ứng dụng tổng hợp của Sinh hoá học, vi sinh vật học và các khoa học về công nghệ để đạt đến sự ứng dụng công nghiệp các năng lực của vi sinh vật, của tế bào các tổ chức nuôi cấy và các thành phân của chúng

- Các nhà khoa học Nhật Bản hình dung Công nghệ Sinh học như một cái thân cây mà rễ của cây này là vi sinh học, di truyền học, sinh hoá học, điện tử học, nông học, công nghệ học và trên tán lá xanh chi chít nhiều quả chín Những quả chín này chính là các sản phẩm phục vụ con người bao gồm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, phân bón vi sinh vật, kích thích tố sinh trưởng cho cây trồng và vật nuôi, các thuốc trừ sâu sinh học, dung môi hữu cơ, axit amin, chất kháng sinh, vitamin, hoócmôn

- Các nhà khoa học Anh, Mĩ, Thụy Sĩ cho Công nghệ Sinh học là một ngành khoa học hội tụ các thành tựu của vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, công nghệ thực phẩm, công nghệ sinh hoá học, công nghệ hoá học, công nghệ cơ khí và điện tử học

- Những lĩnh vực khoa học đã đạt được những thành tựu khoa học mới mẻ

và quan trọng thuộc Công nghệ Sinh học bao gồm:

+ Công nghệ di truyền: Kĩ thuật tái tổ hợp ADN

+ Xúc tác sinh học gồm enzim (tách, cố định, ổn định) và tế bào nguyên vẹn (cố định, ổn định)

+ Miễn dịch học (chủ yếu là các kháng thể đơn dòng)

+ Công nghệ lên men (sản xuất và chế biến phế thải)

+ Sinh điện hoá học

Tính đến năm 2000, số doanh thu hàng năm rất lớn trên các lĩnh vực sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học

Công nghệ Sinh học trong sinh sản thực vật đã giải quyết nhiều vấn đề cốt yếu của đời sống nhân loại như nguồn thức ăn, nguồn năng lượng, hàng tiêu dùng, bảo vệ môi trường với những sản phẩm sản xuất ở quy mô lớn, giá thành rẻ, có ý nghĩa trong sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, y học và đời sống

3

Hình 1 Cấu trúc tế bào thực vật

Năm 1902, lần đầu tiên người ta nuôi cấy thành công những tế bào thực vật trên các môi trường nhân tạo và đến 1934 kĩ thuật nuôi cấy mô mới chính thức ra đời Kĩ thuật này cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay từ những

mô phân sinh tạo nên những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm (gọi là nuôi cấy in vitro) (hình 2)

Công nghệ tế bào thực vật đã giúp nhân nhanh các giống cây trồng quý (nhân sâm) hoặc giúp làm sạch mọi mầm virut gây bệnh cây trồng Các cây trồng trong ống nghiệp đã được thực hiện: Khoai tây, cà chua, củ cải đường, bắp cải, chè, chanh, nho, mía, táo, dâu, thông, phong lan

Từ mô phân sinh của khoai tây sau một thời gian ngắn có thể thu được 2 tỉ

củ khoai tây (trồng được trên 40 ha), tốc độ trồng có thể nhanh hơn 100000 lần so với trồng từ hạt khoai tây Trong 1 năm có thể nhân từ một ống nghiệm nuôi cấy một mô cây cọ dầu (Elanis guineensis) thành 5000000 cây con mang tính chống bệnh giun chỉ và cho năng suất dầu 6 tấn/ha

Công nghệ tế bào động vật cho phép nhân thành các dòng tế bào của người

và động vật, từ đó sản xuất dễ dàng các loại vacxin virut hay sản xuất các tế bào đơn dòng sử dụng rộng rãi trong y học

Hình 2 Nuôi cấy in vitro

2 Sinh sản bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Có thể nêu lên các giai đoạn chính sau đây:

4

Giai đoạn 1: Từ năm 1932 White và Robbins đã nghiên cứu khả năng sinh trưởng của các đoạn rễ cây đậu non và thấy tất cả các loại rễ đều cần thiamin, rễ cây đậu cần niaxin, rễ cà chua cần piriđôxin

Giai đoạn 2: Từ năm 1937 với công trình của Gausherat và Nobecourt nghiên cứu nuôi mô rễ cà rốt và thấy rằng mô rễ cà rốt cần auxin, các rễ cây khác không cần auxin

Giai đoạn 3: Từ 1950 với các công trình của Steward và Skoog nghiên cứu tác dụng tác dụng của nước dừa lên sinh trưởng của mô cà rốt và thuốc lá Người ta đã phát hiện ra ADN tách từ tinh trùng cá thu có thể thay nước dừa trong môi trường nuôi cây mô thực vật Nếu xử lý nhiệt đối với ADN làm cho ADN có hoạt tính ổn định và dẫn đến phát hiện được Kinetin:

ADN  Chất hoạt tính  Kinetis

Nghiên cứu tỉ lệ auxin/kinetis lên sinh trưởng mô dẫn cho thấy khi tỉ lệ này cao sẽ hình thành rễ; tỉ lệ thấp sẽ tạo chồi, tỉ lệ trung bình tạo mô sẹo (callus) (hình 3)

Hình 3 Quan hệ giữa các chất điều hoà sinh trưởng auxin và xitokinin

5

Muir và Hildetrandt đã tái sinh được mô sẹo từ tế bào đơn, một số tế bào đơn độc không sinh trưởng được vì mất chất sinh trưởng, nhưng nếu giữ các tế bào đó trong môi trường có đầy đủ chất sinh trưởng thì phát triển tốt

Giai đoạn hiện nay: Là giai đoạn nghiên cứu về protoplast (tế bào trần) E.C.Cooking (1960) đã dùng enzim thuỷ phân thành tế bào thu được một lượng lớn các tế bào trần, có đầy đủ chức năng sống có thể dùng tạo cơ thể mới

2.2 Cơ sở sinh lý của công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Quá trình phát sinh hình thái các bộ phận của cây được thực hiện trên cơ sở của sự phân chia, phân hoá tế bào Các sự kiện này được phối hợp, chi phối và điều chỉnh nhờ thông tin định sẵn trong ADN và một phần của các chất điều chỉnh sinh trưởng Hệ gen chứa thông tin này tiềm tàng và có vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển thực vật Cơ sở sinh lý của công nghệ nuôi cấy mô thực vật dựa vào tính toàn năng và khả năng phân hoá, hình thành các mô và cơ quan phân hoá và mất phân hoá chuyển sang trạng thái phân chia (tế bào mô phân sinh) Tính toàn năng (tổng năng – totipotence): Là khả năng của một tế bào hình thành lại một cây hoàn chỉnh

Tất cả sự phức tạp, sai biệt của tất cả các mô và cơ quan đều từ một tế bào chứa thông tin di truyền cho toàn bộ chu kì sống hoàn chỉnh Điều đó có nghĩa là tất cả tế bào có một bộ ADN hoàn chỉnh F.C Steward và cộng sự (1964) đã thành công trong nuôi cây cà rốt từ một tế bào đơn lẻ tách riêng từ nuôi cấy mô sẹo rễ cà rốt

Nó đặt nền tảng cho nuôi cấy mô in vitro (hình 4)

Hình 4 Kĩ thuật nuôi cấy mô libe ở củ cà rốt (Daucus carota)

6

Các gen không hoạt động trong tất cả các thời kì sinh trưởng và phát triển

Do đó các protein, các enzim khác nhau có mặt trong các trạng thái khác nhau

Chẳng hạn như một trứng thụ tinh trong túi noãn hay trong túi phôi, nó hô hấp, dùng năng lượng sinh sản ra để tổng hợp tế bào chất và các chấtcủa thành tế bào Nó chứa một hệ enzim cần thiết Nó phân chia rất nhanh trong phôi và xuất hiện các cơ quan chuyên biệt (tế bào lá mầm chứa chất dinh dưỡng, các tế bào dẫn,

và tiếp theo là tế bào cứng (bảo vệ), tế bào chứa diệp lục, tế bào tiết v.v ) Nó diễn

ra các hoạt động và phản ứng hoá học, tổng hợp và phân giải Các enzin mới xuất hiện cho sự phát triển, phân hoá thành mô này, mô khác, cơ quan này, cơ quan khác, mang những đặc điểm sau đây:

Bản chất prôtein của của các xúc tác sinh học tập trung sự thành tạo đa dạng vật chất tế bào ở axit nuclêic

Nhân của trứng là kho di truyền hoàn chỉnh quy định mọi con đường hoá học diễn ra suốt đời sống của cây: ADN  ARN  protein  enzim  chuỗi trao đổi chất (chuỗi chuyển hoá vật chất)  sinh trưởng và phát triển

Tóm tắt lại tính toàn năng của tế bào sinh vật bao gồm một hệ thống các quá trình dẫn đến sự hình thành rễ, thân, lá và cơ quan khác Các giai đoạn và sự kiên

cơ bản của quá trình sinh trưởng và phát triển đó là:

- Mỗi tế bào chứa đựng một bộ thông tin di truyền toàn vẹn, một bộ ADN hoàn chỉnh

- Các gen không cùng hoạt động trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng Cơ chế hoạt động gen thay đổi trong chu kì sống của cây

- Sự tổng hợp protêin, enzim và quá trình chuyển hoá được điều chỉnh do tín hiệu của môi trường

- Các chất điều hoà sinh trưởng (hoocmôn) làm thay đổi chiều hướng của sinh trưởng

- Môi trường sống của cây làm biến đổi đáng kể sự sinh trưởng và phát triển của cây

- Sự phát sinh một cây từ một trứng, một bào tử hay 1 tế bào nào đó gồm 3 dạng trạng thái cùng tồn tại trong một tổng thể khó phân tách riêng biệt

7

- Sự phân hoá các dạng tế bào (phân hoá tế bào): xuất hiện các mô khác nhau

và một số mô chuyên hoá (lông, lỗ khí ở tế bào biểu bì)

- Xuất hiện các cơ quan mới: rễ, thân, lá, hoa (sự hình thành cơ quanvới đặc điểm giải phẫu hình thái riêng (tỷ lệ gỗ và libe: nguồn gốc sự phân nhánh )

- Phát triển từng loại cơ quan, từng loại mô (sự phát sinh hình thái)

- Sự phát sinh hình thái được quan niệm đó là:

+ Sự phân hoá mô và cơ quan

+ Sự hình thành các dạng riêng biệt (nhóm các mô, hình thái cơ quan thuộc các thể, họ, bộ

Tất cả các đặc tính đó được xác định bằng một đặc điểm di truyền, nhưng có

sự thay đổi môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến đặc tính đó

Vai trò các yếu tố di truyền: Nó điều khiển sự tổng hợp các enzim, các protein Nó đại diện cho cường độ sinh trưởng của những tiến trình phân hoá

Gen tạo nên hình mẫu theo không gian ba chiều, số lượng các vật liệu tế bào và giải phóng các gen “kích thước”

Vai trò nhân đối với sự phát sinh hình thái được chứng minh ở tảo lục đơn bào có kích thước lớn Acetabularia Tảo này giống như một mũ được nâng đỡ bằng cán và rễ giả phân nhánh Là tế bào có nhiều nhân nhưng chỉ có một nhân lớn nằm

ở rễ giả Các loại tảo khác nhau bởi hình dạng và kích thước mũ (Acetabularia mediterranea và A.Wettsteni) Khi cắt các mũ và ghép vào phần rễ giả có nhân thì

mũ mới sẽ hình thành giống như mũ cũ Nếu cắt cả mũ, cán và rễ (có một nhân) từ loài này ghép vào tảo loại thứ hai thì mũ mới giống với mũ gốc ghép Như vậy là nhân điều khiển việc tạo thành mũ mới, chứ không phải là tế bào chất của cán Do ADN thông tin tồn tại tương đối ngắn nên sự tổng hợp protêin đòi hỏi ARN thông tin mới được tổng hợp mà dùng ADN nhân làm khuôn mẫu để sao chép thông tin Như vậy sự phân hoá phụ thuộc vào nhân

2.3 Nguyên tắc nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Nuôi cấy mô bao gồm việc nuôi cấy các mô cách li, các tế bào riêng biệt, các lạp thể cách li, các hạt phấn và các cơ quan thực vật

2.3.1 Nuôi cấy mô thực vật

8

Khả năng của tế bào có thể phân hoá hoặc mất phân hoá chuyển sang phân chia Quá trình phân hoá được bắt đầu từ sự phân huỷ các bào quan chuyển hoá (lục lạp, sắc lạp) Cấu trúc tế bào gia tăng những biến đổi và phát triển mạng lưới nội chất, tăng số lượng ribôsôm tăng quá trình tổng hợp ARN, protêin có nghĩa là toàn bộ cấu trúc tế bào trở nên gần giống với tế bào mô phân sinh

Sự xuất hiện và hình thành protein mới chứng tỏ trong sự phân hoá hoạt tính của bộ gen có thay đổi Vai trò của các phytohoocmôn (auxin và xitokinin), sự phân chia tế bào đã loại bỏ sự phân hoá dẫn đến hình thành mô sẹo (callus)

Sau khi hình thành mô sẹo trong các điều kiện và thành phần dinh dưỡng xác định bắt đầu quá trình phân hoá thứ sinh (là sự phân hoá mô) tạo nên cơ thể mới Trong quá trình phát triển tế bào không mất lượng thông tin di truyền mà chỉ mất khả năng biểu hiện thông tin đó Như vậy là mỗi tế bào thực vật chứa một lượng thông tin di truyền toàn vẹn

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thực hiện đối với rễ cách li (lúa mì, ngô, cà chua,

đậu Hà Lan) được tiến hành trong các bình chứa dung dịch dinh dưỡng đến 1/3 bình Dung dịch dinh dưỡng gồm muối khoáng, xacarozơ hay glucôzơ, tiamin

Hình 5 Nuôi cấy rễ

Các đỉnh rễ dài 1cm của cây non đang nảy mầm đặt lên trên bề mặt củ dung dịch Sau 10 ngày đã có nhiều rễ tóc đủ để cấy tiếp (hình 5) Đối với đỉnh thân: Thực hiện khó hơn, phải bổ sung xitokinin và giberelin Điều lí thú là cây được tái sinh hoàn toàn nguyên vẹn từ các đỉnh sinh trưởng của rễ và thân là không bị nhiễm virut Ngay cả trong trường hợp cây đã bị nhiễm virut (thược dược, khoai tây, lan – thí nghiệm của Morel và Martin 1954, 1963) cũng

có thể tái sinh các dòng sạch bệnh

9

Nuôi cấy mô của cơ quan tách rời từ các củ (cà rốt), thân hay cuống lá (nho), cành non vào thời điểm dâng nhựa (liễu): Dùng môi trường dinh dưỡng thạch trắng (thạch trắng 1%, glucôzơ 3%, muối khoáng, AIA 3.10-8 g/ml) Thường cấy chuyền hai tháng một lần (hình 7, 8, 9) Từ các cây sạch bệnh đem nuôi mô trong môi trường thạch sau một thời gian sẽ tạo thành cây con Sau đó đem nhân cây con ra đồng ruộng

Nhận xét:

Nuôi cấy mô bằng nuôi cấy cơ quan đã tạo nên hàng loạt các cá thể vẫn giữ nguyên tính trạng của cây mẹ Sự tái sinh cây nguyên vẹn từ nuôi cấy tế bào hay sử dụng mô callus để tạo ra những cá thể thích hợp nhưng ít được sử dụng để tạo ra các dòng xoma Ngược lại, nuôi cấy mô phân sinh đỉnh đạt kết quả rõ ngay từ đầu (VD ở cây phong lan, cẩm chướng, hoa hồng, phúc bồn tử, )

Ví dụ các mô phân sinh đỉnh của phong lan có đặc tính sản sinh ra một cách

tự nhiên các phôi xôma Tiến hành tách và cấy chuyển trên môi trường mới sẽ tạo

ra gần 1 triệu “cây ống nghiệm” trong 10 tháng Từ một mô phân sinh tách từ đỉnh cây cẩm chướng với 4 lóng cành giấm sản sinh 50.000 cây ống nghiệm so với phương pháp thông thường chỉ đạt 50 cây con Trong nuôi cấy mô phân sinh việc xác định một tỉ lệ giữa xitokinin và auxin là cốt yếu, dẫn đến sự phân hoá rễ (vai trò auxin) và chồi (vai trò xitôkinin) (hình 3) Những mảnh mô nuôi cấy được tách rời

từ những cơ quan khác nhau cũng cho phép tái sinh thành cây nguyên vẹn Ví dụ cụm hoa (tỏi tây, súp lơ), lá (thu hải đường, rau diếp xoăn ) Nuôi cấy các mảnh từ

lá hay từ phôi lá đã được tiến hành để nhân giống cà phê, cọ dầu

Nuôi cấy mô sẹo từ hạt phấn: Vào khoảng 1965, việc nuôi cấy bao phấn đã

thành công, hạt phấn đã chín, tiếptheo sự phân hoá dẫn đến hình thành cây đơn bội

và được gọi là đơn bội lưỡng bội hoá do sự tái sinh cơ thể thực vật từ nuôi cấy hạt phấn đơn tính đực hay từ mảnh của túi phôi Những cây tái sinh là đơn bội sẽ bị loại bỏ vì nó luôn ở trạng thái bất thụ Chỉ cây nào có bộ nhiễm sắc thể đa bội mới thụ tinh (thường xử lí bằng conxixin để có cá thể đa bội) Các cá thể thu được là

“cá thể đơn bội kép” ở cá thể đơn bội kép các tính trạng lặn không bị che lấp bởi lưỡng bội nên có lợi cho phân tích di truyền

2.3.2 Nguyên tắc nuôi cấy mô - tế bào thực vật bằng tế bào trần

10

Dung hợp là khả năng sử dụng protoplast (tế bào trần) làm nguyên liệu lí tưởng trong nghiên cứu các vấn đề sinh học hiện đại: mọi tế bào thực vật đèu được bao bọc xung quanh bởi một thành tế bào bằng xenlulozơ nên tế bào có hình dạng nhất định Ví dụ: tế bào thực vật trong các mô thường có 14 mặt (8mặt hình 6 cạnh và 6 mặt hình 4 cạnh) Nếu phá vỡ thành tế bào bằng enzim (xenlulaza + proteinaza) và tác nhân gây co nguyên sinh (manitol) thì toàn bộ các chất bên trong sẽ thoát ra, tạo thành một khối hình cầu, bên ngoài bao bằng một màng mỏng, đàn hồi gọi là màng

tế bào chất Khối hình cầu này được gọi là tế bào trần Ngày nay người ta có thể nuôi dễ dàng các tế bào tràn này trên các môi trường nhân tạo (dịch thể) Chúng có thể tăng kích thước đến một mức độ nào đó rồi phân chia thành các tế bào trần mới Đáng chú ý là khi đưa hai loại tế bào trần lại gần nhau, các loại tế bào trần này có thể trộn lẫn với nhau để tạo thành một tế bào trần mới, có kích thước lớn hơn và mang đặc tính di truyền của hai loại tế bào này Đó là quá trình dung hợp tế bào trần Tế bào lai được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng sẽ tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào con, cháu của thế hệ sau Các tế bào này khi nuôi cấy trên môi trường thạch, với điều kiện thích hợp có thể tái tạo ra những cây hoàn chỉnh

Nếu lai một tế bào trần có nhân bất hoạt (thể cho) với một tế bào trần bình thường (thể nhận) có thể tạo thành thế hệ tế bào lai không mang nhân của tế bào cho, nhưng vẫn có thể mang các đặc tính của lục lạp, ti thể tế bào cho (nhờ các gen tế bào chất của thể cho vẫn tồn tại trong tế bao dung hợp) Từ đó có thể chuyển gen chống chịu với thuốc diệt cỏ với thuốc kháng sinh, gen kháng nấm bệnh, chống virut, gen bất thụ vào tế bào nhân Phương pháp lai tế bào trần còn gọi là lai tế bào xôma được dùng rộng rãi trong di truyền chọn giống cây trồng

Các nhà khoa học đã thực hiện việc chuyển trên 100 gen khác nhau giữa các loài thực vật (kế cả các loài có quan hệ xa nhau) và chuyển gen của vi khuẩn vào tế bào thực vật để tạo ra những cây trồng có khả năng tự diệt sâu bọ phá hoại Hiện có

3 phương pháp thường dùng:

- Phương pháp Cocking dùng NaNO3 0,25M để kích thích dung hợp

- Phương pháp Keller và Melchers dùng pH cao và nồng độ CaH cao (pH = 10,5)

- Phương pháp Kao và Gambẻg dùng polietilengicol (PEG)

2.4 Quy trình nuôi cấy mô từ protoplast

11

2.4.1 Dùng protoplast trong kĩ thuật nhân giống vô tính

Nuôi cấy tế bào trần (thể nguyên sinh – protoplast) Biện pháp nuôi cấy này đực sử dụng trong sinh lí thực vật để nghiên cứu vai trò của vách tế bào Trong các điều kiện xác định các tế bào trần được cách li có thể tái sinh thành cây nguyên vẹn

Từ cây sạch bệnh, tế bào phá vỡ thành để có protoplast, tạo callus và tạo nên cây mới

2.4.2 Dùng protoplast trong kĩ thuật lai giống vô tính

Năm 1971 Karlson đã thành công trong việc lai vô tính hai hoa thuốc lá Nicotiana glauca và Nicotiana langsdorffi với số NST là 24 và 18 đã nhận được cây lai có số NST là 42 và có những tính trạng hoàn toàn giống cây lai hữu tính Về mặt hình thái thì cây lai này nằm giữa cây bố và cây mẹ Công trình này đã thúc đẩy mạnh mẽ công tác nghiên cứu tế bào xôma và protoplast thực vật

Năm 1974 Melchers và Labbit đã thành công trong lai vô tính protoplast tách rời từ bao phấn:

Bao phấn  protoplast loại cây số 1

Bao phấn  protoplast loại cây số 2

Trộn vào chứa tế bào lai

2.4.3 Dùng protoplast để nghiên cứu trao đổi chất dựa vào hiện tượng ẩm bào của protoplast ẩm bào (pinocytosis) là một quá trình của tế bào lấy các chất từ bên ngoài

12

Ledoux, Huart và Jacob (1974) đã nuôi cấy rễ cây Arabidopsis trên môi trường thạch và gây đột biến, đã nhận thấy có sự chuyển hoá và chuyển gen ở vi khuẩn

Năm 1967 Haus cũng đã thí nghiệm dùng cây Pectunia albin và ADN của cây Pectunia red Tiêm ADN của cây Pectunia red vào lá mầm của cây Pectunia albin, kết quả nhận được một số cây bạch tạng và các cây này di truyền sang đời sau

Thí nghiệm chuyển gen được thực hiện bằng cách nuôi callus cà chua trên môi trường galactôzơ và callus không phát triển được vì thiếu enzim; nhưng callus

cà chua chỉ mọc được trên môi trường xacarozơ

Dùng protoplast để tạo các loại cây chứa lượng axit amin cao

Nghiên cứu trên cà rốt và thuốc lá nuôi protoplast trong môi trường chứa 5 – metyltryptophan Chất này giết chết phần lớn tế bào Số sống sót vì có hàm lượng tryptophan cao khắc phục được tác động kìm hãm của 5 – metyltryptophan Có thể dùng phương pháp đột biết bằng tia X, tia tử ngoại để nghiên cứu theo hướng này Tốt nhất là dùng EMS (etyl metyl sulfonat) xử lý protoplast vài phút, rửa sạch và đem nuôi trong môi trường thích hợp

Tế bào trần còn dùng nghiên cứu cơ chế cộng sinhcủa vi khuẩn cố định N2

3 Điều kiện cần thiết để thực hiện sinh sản bằng nuôi cấy mô thực vật

Sự sinh trưởng của callus thể hiện rõ rệt theo thời gian nuôi cấy Sự tiến triển của sự sinh trưởng đó có dạng hình chữ S

3.1 Môi trường nuôi cấy

- Các môi trường nuôi cấy thường chỉ khác nhau về thành phần như N, Ca

và về nồng độ ion Môi trường nuôi cấy bao gồm:

- Các nguyên tố đa lượng: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Fe, S, Na (mmol)

- Các nguyên tố vi lượng: B, Mn, Zn, Cu, Mo, Co (àmol)

- Nguồn Cacbon chủ yếu: xacarôzơ (mmol)

- Chất điều hoà sinh trưởng: auxin, xitokinin, giberilin (mmol)

- Chất điều tiết sinh trưởng: inositol, axit nicotinic, thiamin, pyridoxin (mmol)

13

- Axit amin: glyxin, xistein (mmol)

- Một số chất dinh dưỡng: sữa dừa, casein hydrolysat (ml, g, mg/l)

- Tác nhân làm đông: agar, gelrit, gelcarin GP812 (g/l)

- Các chất khác

Các nguyên tố đa lượng thường đảm bảo nồng độ > 0,5 mmol/l

Các nguyên tố vi lượng < 0,5 mmol/l

Trong quá trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy thường pha các dung dịch đậm đặc, khi cần thì pha loãng

Một vài môi trường nuôi cấy mô - tế bào thực vật

- Môi trường White - Môi trường Murashige và Skoog

1650

370

1900

14

KNO3

NaH2PO4

80 16,5

Axit nicotinic

Pyridoxin HCl

0,1 0,5 0,11

Thiamin HCl Axit nicotinic Pyridoxin HCl inositol

0,1 0,5 0,5 100,0

Agar (thạch) (g/l) Casein hydro (g/l) IAA (àmol)

Kinetin (àmol)

10,0 1,0 5,71 –

171 0,18 – 46,5

3.2 Ánh sáng