CHUYÊN ĐỀ 4: SINH SẢN Ở THỰC VẬT

CHUYÊN ĐỀ 4: SINH SẢN Ở THỰC VẬT I Nội dung chuyên đề Khái niệm Công nghệ Sinh học sinh sản thực vật - Theo liên đoàn Công nghệ Sinh học châu Âu (EFB): Công nghệ Sinh học ứng dụng tổng hợp Sinh hoá học, vi sinh vật học khoa học công nghệ để đạt đến ứng dụng công nghiệp lực vi sinh vật, tế bào tổ chức nuôi cấy thành phân chúng - Các nhà khoa học Nhật Bản hình dung Công nghệ Sinh học thân mà rễ vi sinh học, di truyền học, sinh hoá học, điện tử học, nông học, công nghệ học tán xanh chi chít nhiều chín Những chín sản phẩm phục vụ người bao gồm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, phân bón vi sinh vật, kích thích tố sinh trưởng cho trồng vật nuôi, thuốc trừ sâu sinh học, dung môi hữu cơ, axit amin, chất kháng sinh, vitamin, hoócmôn - Các nhà khoa học Anh, Mĩ, Thụy Sĩ cho Công nghệ Sinh học ngành khoa học hội tụ thành tựu vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, công nghệ thực phẩm, công nghệ sinh hoá học, công nghệ hoá học, công nghệ khí điện tử học - Những lĩnh vực khoa học đạt thành tựu khoa học mẻ quan trọng thuộc Công nghệ Sinh học bao gồm: + Công nghệ di truyền: Kĩ thuật tái tổ hợp ADN + Xúc tác sinh học gồm enzim (tách, cố định, ổn định) tế bào nguyên vẹn (cố định, ổn định) + Miễn dịch học (chủ yếu kháng thể đơn dòng) + Công nghệ lên men (sản xuất chế biến phế thải) + Sinh điện hoá học Tính đến năm 2000, số doanh thu hàng năm lớn lĩnh vực sản xuất sản phẩm công nghệ sinh học Các sản phẩm hoá học 1,8 tỉ USD Các sản phẩm lượng 24 tỉ USD Các sản phẩm thực phẩm 24 tỉ USD Các sản phẩm y dược học 16 tỉ USD Các sản phẩm khai thác, dầu mỏ, tuyển khoáng, xử lý phế thải 30 tỉ USD Tổng cộng 112 tỉ USD Kĩ thuật lai ứng dụng rộng rãi việc tạo giống vi sinh vật, giống trồng, giống vật nuôi Nhờ phương pháp dung hợp tức phương pháp trộn lẫn hai tế bào sống, người ta tạo nên kháng thể đơn dòng (sử dụng để chẩn đoán chữa trị bệnh hiểm nghèo) Công nghệ Sinh học sinh sản thực vật giải nhiều vấn đề cốt yếu đời sống nhân loại nguồn thức ăn, nguồn lượng, hàng tiêu dùng, bảo vệ môi trường với sản phẩm sản xuất quy mô lớn, giá thành rẻ, có ý nghĩa sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, y học đời sống Công nghệ tế bào thực vật Tế bào đơn vị thể sống Tế bào sinh vật có nhân thật (gồm tất loại sinh vật, trừ vi khuẩn) có kích thước phạm vi 10 – 100 micromét (1 micromét=1/1000 milimét) Một có khoảng 20 triệu tế bào Một có 200 nghìn có tới 4000 tỉ tế bào (hình 1) Hình Cấu trúc tế bào thực vật Năm 1902, lần người ta nuôi cấy thành công tế bào thực vật môi trường nhân tạo đến 1934 kĩ thuật nuôi cấy mô thức đời Kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng tế bào thực vật hay từ mô phân sinh tạo nên khối tế bào hay hoàn chỉnh ống nghiệm (gọi nuôi cấy in vitro) (hình 2) Công nghệ tế bào thực vật giúp nhân nhanh giống trồng quý (nhân sâm) giúp làm mầm virut gây bệnh trồng Các trồng ống nghiệp thực hiện: Khoai tây, cà chua, củ cải đường, bắp cải, chè, chanh, nho, mía, táo, dâu, thông, phong lan Từ mô phân sinh khoai tây sau thời gian ngắn thu tỉ củ khoai tây (trồng 40 ha), tốc độ trồng nhanh 100000 lần so với trồng từ hạt khoai tây Trong năm nhân từ ống nghiệm nuôi cấy mô cọ dầu (Elanis guineensis) thành 5000000 mang tính chống bệnh giun cho suất dầu tấn/ha Công nghệ tế bào động vật cho phép nhân thành dòng tế bào người động vật, từ sản xuất dễ dàng loại vacxin virut hay sản xuất tế bào đơn dòng sử dụng rộng rãi y học Hình Nuôi cấy in vitro Sinh sản công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật: Có thể nêu lên giai đoạn sau đây: Giai đoạn 1: Từ năm 1932 White Robbins nghiên cứu khả sinh trưởng đoạn rễ đậu non thấy tất loại rễ cần thiamin, rễ đậu cần niaxin, rễ cà chua cần piriđôxin Giai đoạn 2: Từ năm 1937 với công trình Gausherat Nobecourt nghiên cứu nuôi mô rễ cà rốt thấy mô rễ cà rốt cần auxin, rễ khác không cần auxin Giai đoạn 3: Từ 1950 với công trình Steward Skoog nghiên cứu tác dụng tác dụng nước dừa lên sinh trưởng mô cà rốt thuốc Người ta phát ADN tách từ tinh trùng cá thu thay nước dừa môi trường nuôi mô thực vật Nếu xử lý nhiệt ADN làm cho ADN có hoạt tính ổn định dẫn đến phát Kinetin: ADN  Chất hoạt tính  Kinetis Nghiên cứu tỉ lệ auxin/kinetis lên sinh trưởng mô dẫn cho thấy tỉ lệ cao hình thành rễ; tỉ lệ thấp tạo chồi, tỉ lệ trung bình tạo mô sẹo (callus) (hình 3) Hình Quan hệ chất điều hoà sinh trưởng auxin xitokinin Muir Hildetrandt tái sinh mô sẹo từ tế bào đơn, số tế bào đơn độc không sinh trưởng chất sinh trưởng, giữ tế bào môi trường có đầy đủ chất sinh trưởng phát triển tốt Giai đoạn nay: Là giai đoạn nghiên cứu protoplast (tế bào trần) E.C.Cooking (1960) dùng enzim thuỷ phân thành tế bào thu lượng lớn tế bào trần, có đầy đủ chức sống dùng tạo thể 2.2 Cơ sở sinh lý công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật Quá trình phát sinh hình thái phận thực sở phân chia, phân hoá tế bào Các kiện phối hợp, chi phối điều chỉnh nhờ thông tin định sẵn ADN phần chất điều chỉnh sinh trưởng Hệ gen chứa thông tin tiềm tàng có vai trò quan trọng sinh trưởng phát triển thực vật Cơ sở sinh lý công nghệ nuôi cấy mô thực vật dựa vào tính toàn khả phân hoá, hình thành mô quan phân hoá phân hoá chuyển sang trạng thái phân chia (tế bào mô phân sinh) Tính toàn (tổng – totipotence): Là khả tế bào hình thành lại hoàn chỉnh Tất phức tạp, sai biệt tất mô quan từ tế bào chứa thông tin di truyền cho toàn chu kì sống hoàn chỉnh Điều có nghĩa tất tế bào có ADN hoàn chỉnh F.C Steward cộng (1964) thành công nuôi cà rốt từ tế bào đơn lẻ tách riêng từ nuôi cấy mô sẹo rễ cà rốt Nó đặt tảng cho nuôi cấy mô in vitro (hình 4) Hình Kĩ thuật nuôi cấy mô libe củ cà rốt (Daucus carota) Các gen không hoạt động tất thời kì sinh trưởng phát triển Do protein, enzim khác có mặt trạng thái khác Chẳng hạn trứng thụ tinh túi noãn hay túi phôi, hô hấp, dùng lượng sinh sản để tổng hợp tế bào chất chấtcủa thành tế bào Nó chứa hệ enzim cần thiết Nó phân chia nhanh phôi xuất quan chuyên biệt (tế bào mầm chứa chất dinh dưỡng, tế bào dẫn, tế bào cứng (bảo vệ), tế bào chứa diệp lục, tế bào tiết v.v ) Nó diễn hoạt động phản ứng hoá học, tổng hợp phân giải Các enzin xuất cho phát triển, phân hoá thành mô này, mô khác, quan này, quan khác, mang đặc điểm sau đây: Bản chất prôtein của xúc tác sinh học tập trung thành tạo đa dạng vật chất tế bào axit nuclêic Nhân trứng kho di truyền hoàn chỉnh quy định đường hoá học diễn suốt đời sống cây: ADN  ARN  protein  enzim  chuỗi trao đổi chất (chuỗi chuyển hoá vật chất)  sinh trưởng phát triển Tóm tắt lại tính toàn tế bào sinh vật bao gồm hệ thống trình dẫn đến hình thành rễ, thân, quan khác Các giai đoạn kiên trình sinh trưởng phát triển là: - Mỗi tế bào chứa đựng thông tin di truyền toàn vẹn, ADN hoàn chỉnh - Các gen không hoạt động tất giai đoạn sinh trưởng Cơ chế hoạt động gen thay đổi chu kì sống - Sự tổng hợp protêin, enzim trình chuyển hoá điều chỉnh tín hiệu môi trường - Các chất điều hoà sinh trưởng (hoocmôn) làm thay đổi chiều hướng sinh trưởng - Môi trường sống làm biến đổi đáng kể sinh trưởng phát triển - Sự phát sinh từ trứng, bào tử hay tế bào gồm dạng trạng thái tồn tổng thể khó phân tách riêng biệt - Sự phân hoá dạng tế bào (phân hoá tế bào): xuất mô khác số mô chuyên hoá (lông, lỗ khí tế bào biểu bì) - Xuất quan mới: rễ, thân, lá, hoa (sự hình thành quanvới đặc điểm giải phẫu hình thái riêng (tỷ lệ gỗ libe: nguồn gốc phân nhánh ) - Phát triển loại quan, loại mô (sự phát sinh hình thái) - Sự phát sinh hình thái quan niệm là: + Sự phân hoá mô quan + Sự hình thành dạng riêng biệt (nhóm mô, hình thái quan thuộc thể, họ, Tất đặc tính xác định đặc điểm di truyền, có thay đổi môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến đặc tính Vai trò yếu tố di truyền: Nó điều khiển tổng hợp enzim, protein Nó đại diện cho cường độ sinh trưởng tiến trình phân hoá Gen tạo nên hình mẫu theo không gian ba chiều, số lượng vật liệu tế bào giải phóng gen “kích thước” Vai trò nhân phát sinh hình thái chứng minh tảo lục đơn bào có kích thước lớn Acetabularia Tảo giống mũ nâng đỡ cán rễ giả phân nhánh Là tế bào có nhiều nhân có nhân lớn nằm rễ giả Các loại tảo khác hình dạng kích thước mũ (Acetabularia mediterranea A.Wettsteni) Khi cắt mũ ghép vào phần rễ giả có nhân mũ hình thành giống mũ cũ Nếu cắt mũ, cán rễ (có nhân) từ loài ghép vào tảo loại thứ hai mũ giống với mũ gốc ghép Như nhân điều khiển việc tạo thành mũ mới, tế bào chất cán Do ADN thông tin tồn tương đối ngắn nên tổng hợp protêin đòi hỏi ARN thông tin tổng hợp mà dùng ADN nhân làm khuôn mẫu để chép thông tin Như phân hoá phụ thuộc vào nhân 2.3 Nguyên tắc nuôi cấy mô - tế bào thực vật Nuôi cấy mô bao gồm việc nuôi cấy mô cách li, tế bào riêng biệt, lạp thể cách li, hạt phấn quan thực vật 2.3.1 Nuôi cấy mô thực vật Khả tế bào phân hoá phân hoá chuyển sang phân chia Quá trình phân hoá phân huỷ bào quan chuyển hoá (lục lạp, sắc lạp) Cấu trúc tế bào gia tăng biến đổi phát triển mạng lưới nội chất, tăng số lượng ribôsôm tăng trình tổng hợp ARN, protêin có nghĩa toàn cấu trúc tế bào trở nên gần giống với tế bào mô phân sinh Sự xuất hình thành protein chứng tỏ phân hoá hoạt tính gen có thay đổi Vai trò phytohoocmôn (auxin xitokinin), phân chia tế bào loại bỏ phân hoá dẫn đến hình thành mô sẹo (callus) Sau hình thành mô sẹo điều kiện thành phần dinh dưỡng xác định bắt đầu trình phân hoá thứ sinh (là phân hoá mô) tạo nên thể Trong trình phát triển tế bào không lượng thông tin di truyền mà khả biểu thông tin Như tế bào thực vật chứa lượng thông tin di truyền toàn vẹn Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thực rễ cách li (lúa mì, ngô, cà chua, đậu Hà Lan) tiến hành bình chứa dung dịch dinh dưỡng đến 1/3 bình Dung dịch dinh dưỡng gồm muối khoáng, xacarozơ hay glucôzơ, tiamin Các đỉnh rễ dài 1cm non nảy mầm đặt lên bề mặt củ dung dịch Sau 10 ngày có nhiều rễ tóc đủ để cấy tiếp (hình 5) Đối với đỉnh thân: Thực khó hơn, phải bổ sung xitokinin giberelin Điều lí thú tái sinh hoàn toàn nguyên vẹn từ đỉnh sinh trưởng rễ thân không bị nhiễm virut Ngay trường hợp bị nhiễm virut (thược dược, khoai tây, lan – thí nghiệm Morel Martin 1954, 1963) tái sinh dòng bệnh Hình Nuôi cấy rễ Nuôi cấy mô quan tách rời từ củ (cà rốt), thân hay cuống (nho), cành non vào thời điểm dâng nhựa (liễu): Dùng môi trường dinh dưỡng thạch trắng (thạch trắng 1%, glucôzơ 3%, muối khoáng, AIA 3.10-8 g/ml) Thường cấy chuyền hai tháng lần (hình 7, 8, 9) Từ bệnh đem nuôi mô môi trường thạch sau thời gian tạo thành Sau đem nhân đồng ruộng Nhận xét: Nuôi cấy mô nuôi cấy quan tạo nên hàng loạt cá thể giữ nguyên tính trạng mẹ Sự tái sinh nguyên vẹn từ nuôi cấy tế bào hay sử dụng mô callus để tạo cá thể thích hợp sử dụng để tạo dòng xoma Ngược lại, nuôi cấy mô phân sinh đỉnh đạt kết rõ từ đầu (VD phong lan, cẩm chướng, hoa hồng, phúc bồn tử, ) Ví dụ mô phân sinh đỉnh phong lan có đặc tính sản sinh cách tự nhiên phôi xôma Tiến hành tách cấy chuyển môi trường tạo gần triệu “cây ống nghiệm” 10 tháng Từ mô phân sinh tách từ đỉnh cẩm chướng với lóng cành giấm sản sinh 50.000 ống nghiệm so với phương pháp thông thường đạt 50 Trong nuôi cấy mô phân sinh việc xác định tỉ lệ xitokinin auxin cốt yếu, dẫn đến phân hoá rễ (vai trò auxin) chồi (vai trò xitôkinin) (hình 3) Những mảnh mô nuôi cấy tách rời từ quan khác cho phép tái sinh thành nguyên vẹn Ví dụ cụm hoa (tỏi tây, súp lơ), (thu hải đường, rau diếp xoăn ) Nuôi cấy mảnh từ hay từ phôi tiến hành để nhân giống cà phê, cọ dầu Nuôi cấy mô sẹo từ hạt phấn: Vào khoảng 1965, việc nuôi cấy bao phấn thành công, hạt phấn chín, tiếptheo phân hoá dẫn đến hình thành đơn bội gọi đơn bội lưỡng bội hoá tái sinh thể thực vật từ nuôi cấy hạt phấn đơn tính đực hay từ mảnh túi phôi Những tái sinh đơn bội bị loại bỏ trạng thái bất thụ Chỉ có nhiễm sắc thể đa bội thụ tinh (thường xử lí conxixin để có cá thể đa bội) Các cá thể thu “cá thể đơn bội kép” cá thể đơn bội kép tính trạng lặn không bị che lấp lưỡng bội nên có lợi cho phân tích di truyền 2.3.2 Nguyên tắc nuôi cấy mô - tế bào thực vật tế bào trần Dung hợp khả sử dụng protoplast (tế bào trần) làm nguyên liệu lí tưởng nghiên cứu vấn đề sinh học đại: tế bào thực vật đèu bao bọc xung quanh thành tế bào xenlulozơ nên tế bào có hình dạng định Ví dụ: tế bào thực vật mô thường có 14 mặt (8mặt hình cạnh mặt hình cạnh) Nếu phá vỡ thành tế bào enzim (xenlulaza + proteinaza) tác nhân gây co nguyên sinh (manitol) toàn chất bên thoát ra, tạo thành khối hình cầu, bên bao màng mỏng, đàn hồi gọi màng tế bào chất Khối hình cầu gọi tế bào trần Ngày người ta nuôi dễ dàng tế bào tràn môi trường nhân tạo (dịch thể) Chúng tăng kích thước đến mức độ phân chia thành tế bào trần Đáng ý đưa hai loại tế bào trần lại gần nhau, loại tế bào trần trộn lẫn với để tạo thành tế bào trần mới, có kích thước lớn mang đặc tính di truyền hai loại tế bào Đó trình dung hợp tế bào trần Tế bào lai nuôi cấy môi trường dinh dưỡng tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào con, cháu hệ sau Các tế bào nuôi cấy môi trường thạch, với điều kiện thích hợp tái tạo hoàn chỉnh Nếu lai tế bào trần có nhân bất hoạt (thể cho) với tế bào trần bình thường (thể nhận) tạo thành hệ tế bào lai không mang nhân tế bào cho, mang đặc tính lục lạp, ti thể tế bào cho (nhờ gen tế bào chất thể cho tồn tế bao dung hợp) Từ chuyển gen chống chịu với thuốc diệt cỏ với thuốc kháng sinh, gen kháng nấm bệnh, chống virut, gen bất thụ vào tế bào nhân Phương pháp lai tế bào trần gọi lai tế bào xôma dùng rộng rãi di truyền chọn giống trồng Các nhà khoa học thực việc chuyển 100 gen khác loài thực vật (kế loài có quan hệ xa nhau) chuyển gen vi khuẩn vào tế bào thực vật để tạo trồng có khả tự diệt sâu bọ phá hoại Hiện có phương pháp thường dùng: - Phương pháp Cocking dùng NaNO3 0,25M để kích thích dung hợp - Phương pháp Keller Melchers dùng pH cao nồng độ CaH cao (pH = 10,5) - Phương pháp Kao Gambẻg dùng polietilengicol (PEG) 2.4 Quy trình nuôi cấy mô từ protoplast 10 Có nhân tố liên quan tới ánh sáng dùng nuôi cấy mô cường độ, chất lượng quang chu kì ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng phát triển thông qua tác dụng ánh sáng tới trình quang hợp Thường dùng số photon lượng bước sáng 400 – 700nm mô thực vật tiếp nhận Đơn vị ánh sáng thường xác định micromol/ đơn vị diện tích/ đơn vị thời gian: (àmol.m-2s-1) thường gọi micro – Einstein (àE m-2s-1) Trong nuôi cấy mô sinh trưởng phòng thường dùng ánh sáng có cường độ thấp 10 – 50 àmol.m-2s-1 với thời gian chiếu sáng từ 16 – 24 Cường độ ánh sáng cao thích hợp cho xanh nhà kính Nếu lấy ánh sáng “điển hình” điểm bù quang hợp 20 àmol.m-2s-1 xanh tự dưỡng cần 65 – 250 àmol.m-2s-1 (bảng 1) Bảng Cường độ ánh sáng thường gặp mol.m-2s-1 Đèn huỳnh quang 10 – 50 (~ 40W) ánh sáng điểm bù 20 Trồng xanh tự dưỡng 65 – 250 Nhà kính 100 – 1500 ánh sáng mặt trời 2000 Một số nuôi cấy mô có yêu cầu chất lượng ánh sáng khác Nhân giống kéo dài chồi nho ánh sáng xanh lớn nhanh ánh sáng đỏ, ánh sáng đỏ lại thúc đẩy sinh trưởng chồi cúc kéo dài chồi thông Đối với sinh trưởng rễ giữ tối thấy rõ hiệu thực tế người ta thường giữ việc nhân giống rễ đêm tối tuần lễ 3.3 Nhiệt độ Nhiều thực ngiệm nuôi cấy mô cần nhiệt độ phòng Thích hợp nhiệt độ 20 – 28oC, tuỳ thuộc vào nguồn gốc loài cây, có nguồn gốc nhiệt đới 17 – 32 oC Ví dụ sinh trưởng chồi thu hải đường (Begonia) 15 Khi tạo cần 15 – 20 oC, thích hợp 24 oC Đối với họ mơ mận t o=24 – 28 o C, nho 35 oC Nhiệt độ thấp 20 oC lại thích hợp cho sinh trưởng họ bắp cải hoa hồng nhân chồi nhiệt độ 21 oC thích hợp tạo rễ to thích hợp: 15 – 18 oC Ở số nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng rễ lớn sinh trưởng chồi (bảng 2) Bảng Nhiệt độ sinh trưởng tối thích số cây: Nhiệt độ tối thích (oC) Sinh trưởng chồi Sinh trưởng rễ ặi 20 25 – 30 Đu đủ 25 29 Táo 25 30 – 35 Ngoại lệ: Hoa hồng 21 15 – 18 3.4 Ôxy Khí CO2 cần cho quang hợp khí O2 nồng độ bị hạ thấp ý nuôi cấy mô Sự hạ thấp nồng độ O2 thường xảy có nhiệt độ thấp, 25oC hay 12 oC hạ thấp hàm lượng oxy có ảnh hưởng đến tái tạo chồi Cả O2 CO2 có vai trò quan trọng vùng rễ CO2 có tác dụng đến hình thành rễ phụ Sự hấp thụ chất khoáng tăng 20 – 25% rễ làm tăng hàm lượng CO2 từ 0,5 – 1% Trong môi trường lỏng, hạ thấp phần áp suất O2 ảnh hưởng đến sinh trưởng in vitro (bảng 3) Bảng Sự sinh trưởng in vitro oxy có nồng độ thấp: Mức độ ôxy Nuôi cấy mô Phản ứng xảy – 10% O2 Nuôi cấy rễ C3 (cúc) Tăng quang hợp – 10% Nuôi cấy mô Tăng lạp thể 16 8% Nuôi cấy phôi xoma lúa mì Tăng trình tạo phôi 5% Bào tử nhỏ Tăng trình tạo phôi hình thành non 3.5 Chất điều hoà sinh trưởng (phytohoocmôn) Thông thường xitokinin hoà tan dung dịch axit (1 hay 0,5N HCl), auxin hoà tan dung dịch kiềm (1N NaOH) Thường hoà chất điều hoà sinh trưởng 2,5ml dung môi đun nhẹ thêm nước hay etamol trì dung dịch đậm đặc pH 5,0 để 4oC Các phytohoocmôn thuộc nhóm xitokinin auxin thường dùng nuôi cấy mô: Xitokinin Auxin Benzyladenin (BA) khối lượng phân tử 225,3 Izopentiladenin (2 – IP) khối lượng phân tử 203,2 Kinetin (KIN) khối lượng phân tử 215,2 Zeatin (ZEA) khối lượng phân tử 219,2 Axit inđôlaxetic (AIA) khối lượng phân tử 175,2 Axit inđôl – – butyric (AIB) khối lượng phân tử 203,2 Axit – naphtalenaxetic (ANA) khối lượng phân tử 186,2 Axit 2, - điclorophenoxyaxetic (2, D) Axit 2, 4, triclorophenoxyaxetic (2, khối lượng phân tử 255,5 4, T) khối lượng phân tử 241,5 Picloram (PIC) 3.6 Khử trùng 17 Nuôi cấy mô thực vật phải bảo đảm vô trùng cho môi trường nuôi cấy Nấm vi khuẩn thường xuất môi trường Một số loại nấm thường gặp Trichoderma, Epicoccum nigrum, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria, Fusarium, Botrytis, Mucor, Rhizopus Các loại vi khuẩn thường xuất nuôi cấy mô thực vật: Actinomyces, Bacillus, Lactobacillus, Micrococcus, Staphlococcus, Rhodococcus, Curtobacterium, Clavibacter, Arthrobacter, Dùng nồi hấp tiệt trùng với áp suất nhiệt độ định khử trùng có kết (bảng 4) Bảng Nhiệt độ (oC) dùng để tiệt trùng Vi khuẩn gây bệnh 50 Vi khuẩn hoại sinh 60 Các loại nấm sinh dưỡng 60 Bào tử nấm 80 Bào tử vi khuẩn 120 Người ta dùng số biện pháp khúc để tiệt trùng môi trường dụng cụ nuôi cấy: Nóng khô (120 – 150 oC), tia gamma, vi sóng, siêu lọc, hoá chất, Ứng dụng thực tiễn sinh sản công nghệ nuôi cấy mô thực vật Lịch sử công nghệ nuôi cấy mô thực vật dung hợp protoplast thời gian chưa phải dài thành tựu ứng dụng công nghệ thật to lớn; lẽ từ đầu nhà sinh học nắm nguyên tắc vấn đề cờ thể sinh vật gồm nhiều đơn vị tế bào tế bào phân hoá mang khối lượng thông tin di truyền đủ để mã hoá cho việc hình thành nên thể Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô thực tiễn đa dạng phong phú: nuôi cấy mô- tế bào thực vật in vitro, dung hợp tế bào trần, kĩ thuật chuyển ADN để tạo thành giống mới, giống bệnh, cải lương giống, nhân nhanh phục tráng giống, tạo dòng giống chịu với điều kiện môi trường nóng, lạnh, hạn, mặn Nuôi cấy mô tế bào thực vật thực nhân giống vô tính, từ phần quan sinh dưỡng (thân, lá, rễ, củ, ) tạo hàng loạt cá thể quần thể trồng đồng đều, giữ nguyên đặc tính mẹ, hệ số nhân giống cao, hiệu kinh tế cao, không tốn diện tích trồng Phương pháp tỏ 18 ưu việt khó nhân giống đường hữu tính, quý có lượng giống ban đầu hạn chế lại có nhu cầu nhân giống nhanh, nhiều Tóm lại công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mở hướng cho nhà di truyền học, sinh hoá học, sinh lý học vi sinh vật học: - Nuôi cấy mô tế bào tạo nhiều sinh sản vô tính - Đối với lương thực, thực phẩm (lúa, đậu, lupin, đậu tương, khoai tây, cà chua, cà rốt) - Cây ăn quả: chuối, dứa, cam, đu đủ, nho, ổi, táo - Cây thuốc: gừng, tam thất, sâm, dừa cạn, húng chanh, cà độc dược, thuốc phiện, ba gạc - Cây chè, cà phê - Cây cảnh: hoa hồng, thu hải đường, phong lan - Cây công nghiệp: Cây mía, cọ dầu - Cây gỗ: thông, bạch đàn - Cây ngập mặn: mắm - Nhân giống vô tính photoplast Để hạn chế chi phí nuôi cấy tế bào công đoạn phá vỡ thành tế bào nhà khao học sử dụng kĩ thuật bất động hoá tế bào thực vật Bằng cách cố định tế bào nuôi cấy hợp chất dinh dưỡng, nuôi chúng thời gian dài (có thể vài trăm ngày) Tế bào không sinh sôi nảy nở tổng hợp mạnh tạo chất có hoạt tính sinh học cao mà ta mong muốn Các hợp chất dễ thấm môi trường tích luỹ lại đạt số lượng để tách đem tinh chế Ví dụ sản phẩm thuốc thu nuôi cấy môi trường nhân tạo Lai lúa mì x lúa mạch đen: Lúa mì thuộc chi Triticum, lúa mạch đen thuộc chi Secale Qua lai tạo hàng loạt loài lúa mì - mạch (Triticale) với nhiễm sắc thể đa bội gồm ngũ bội thể: 35NST (5x7) bát bội thể: 56NST (8x7) Triticale xem “cây trồng nhân tạo” có giá trị cao protêin (20% có lizin aa không thay thế) dùng làm nguồn nguyên liệu quý để lai tạo với dòng lúa mì, chịu giá rét, suất cao 19 Lai khoai tây x cà chua: Lấy tế bào trần khoai tây cho dung hợp với tế bào trần cà chua, tạo tế bào trần lai khoai – cà Sau nuôi cấy qua nhiều hệ thu lai phía mặt đất củ khoai tây, phía mặt đất cà chua (Loại lai không tạo hạt giống) Ngoài tạo lai củ cải arabidopsis (loại cải khác chi); cà rốt rau mùi tây; cải đực cải dầu Các lai có suất phẩm chất cao Một số thành tựu chuyển gen: - Năm 1983 thành công chuyển gen vi khuẩn vào thực vật chuyển gen xenlulaza vào vi khuẩn - Năm 1984 chuyển plasmit Ti vào tế bào thực vật - Năm 1985 tạo giống nấm men có khả giết chết vi khuẩn xuất bia tạo giống ngô chứa nhiều tryptophan II TỔ CHỨC DẠY HỌC CHUYÊN ĐỀ: Mục tiêu 1.1 Kiến thức - Giải thích lí nuôi cấy tế bào mô thực vật tạo thành hoàn chỉnh - Phân biệt nhân giống vô tính từ phần thể lai vô tính từ tế bào trần (quatophlast) - Nêu ý nghĩa vai trò công nghệ sinh học công nghệ tế bào thực vật 1.2 Kĩ - Rèn luyện khả tư thực trình công nghệ mức độ tế bào, mô thực vật với thực tỉ mỉ cẩn thận để đạt kết tốt - Thực kĩ nhân giống sinh sản vô tính phổ biến nông nghiệp (giâm, chiết, ghép cành) 20 - Thiết kế qui trình nuôi cấy mô, điều kiện liên quan tới trình 1.3 Thái độ - Ham mê hứng thú vào lĩnh vực nhân giống đặc biệt quí triển vọng to lớn nuôi cấy mô thực vật - Có ý thức sáng tạo kĩ thuật nhân giống nuôi cấy mô tế bào ý nghĩa khoa học mà có giá trị thực tiễn, kinh tế cao Chuẩn bị GV HS 2.1 Chuẩn bị GV - Hình ảnh, Video, mẫu vật, tài liệu cập nhật thông tin sinh sản thực vật thông tin công nghệ nuôi cấy mô sinh sản thực vật 2.2 Chuẩn bị HS - Các nguồn thông tin từ kênh thông tin liên quan đến lĩnh vực sinh sản thực vật nhà trường ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN NĂNG LỰC TRONG CHUYÊN ĐỀ: Các kĩ thành phần STT Tên lực Năng lực phát Các kĩ sinh học bản: giải Năng lực vận dụng kiến thức nuôi cấy mô nhằm vấn đề thực việc sinh sản cho thực vật nhằm tạo giống trồng có suất cao Năng lực thu Các phương pháp thu nhận xử lí thông tin: nhận xử lý Các phương pháp sinh học: Phương pháp quan sát thông tin phát triển phôi tế bào thực vật qua mẫu vậttiêu hay hình ảnh Đọc hiểu sơ đồ qui trình thực công nghệ sinh sản nuôi cấy mô Các phương pháp khác: Vận dụng kiến thức liên môn đa môn phân tích chế tương 21 sinh trưởng phát triển thực vật Năng lực nghiên cứu khoa học Các kĩ khoa học: Quan sát đối tượng thực vật; Phân tích qui trình nuôi cấy mô nhằm mục đích sinh sản vận dụng thực tiễn nuôi cấy mô thực vật; Xử lí trình bày số liệu bao gồm vẽ đồ thị, lập bảng biểu, biểu đồ cột, sơ đồ, ảnh chụp; Xây dựng giả thuyết khoa học hình thành phương án, biện pháp chứng minh giả thuyết thực tiễn Năng lực tính Tính toán kích thước thể động vật qua giai toán đoạn qui trình nuôi cấy mô thực vật Năng lực tư Phát triển tư phân tích so sánh thông qua việc so sánh phát triển động vật khác qua công nghệ nuôi cấy mô thực vật Năng lực ngôn ngữ Phát triển ngôn ngữ nói ngôn ngữ viết thông qua trình bày, tranh luận, thảo luận công nghệ tế bào thực vật Tiến trình dạy học chuyên đề: Thời gian Hoạt động Tiết Hoạt động 1: Giới thiệu, phân công nhiệm - Học sinh biết vụ mục tiêu chuyên đề - Giáo viên chia lớp thành nhóm, hướng tới Mục tiêu nhóm 5-6hs - Các nhóm phân công - Giới thiệu mục tiêu, nội dung nhiệm vụ nhóm, nghiên cứu tài liệu chuyên đề cho lớp biết thống nội dung, hình thức trình bày - Phân công công việc cho nhóm: - Giao nhiệm vụ nhà + Nhóm 1: tìm hiểu khái niệm công nghệ sinh học, công nghệ tế bào liên quan 22 đến sinh sản thực vật + Nhóm 2: tìm hiểu trình phát triển phôi thực vật + Nhóm 3: tìm hiểu công nghệ tế bào thực vật + Nhóm 4: tìm hiểu vai trò công nghệ nuôi cấy mô sinh sản thực vật Tiết Hoạt động 2: Trình bày nội dung tìm hiểu - Các nhóm trình bày nội dung mà nhóm phụ trách, cho thành viên trình bày, thể công sức tất thành viên sản phẩm - Rèn luyện kỹ thuyết trình, sử dụng ngôn ngữ nói, kỹ đánh giá - Sau phần trình bày nhóm đặt câu hỏi, thảo luận - Các nhóm đánh giá trình bày Tiết Hoạt động 3: Thảo luận thực hành nội dung sau: - Rèn luyện kỹ Đặc điểm công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực hành, quan sát, thực vật gì? Trình bày sở khoa học biện luận, phân tích, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật khái quát hóa thong qua Ý nghĩa nuôi cấy mô thực vật nội dung sinh sản sản xuất đời sống Các thành tựu nhiều nuôi cấy mô thực mặt công nghệ nuôi cấy mô Triển vọng vật công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Thực hành: Nuôi cấy mô số thực vật có địa phương III KIỂM TRA ĐÁNH GIÁ 23 Bảng ma trận kiểm tra đánh giá theo định hướng phát triển lực: Nội dung Nhận biết Thông hiểu Khái niệm Công nghệ Sinh học sinh sản thực vật - Trình bày khái niệm sinh sản công nghệ sinh học sinh sản thực vật - Phân tích mối quan hệ công nghệ sinh học sinh sản cá thể thực vật - Tìm hiếu ứng dụng công nghệ sinh học thực vật sinh sản Sinh sản công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật - Mô tả giai đoạn công nghệ nuôi cấy mô thực vật - Giải thích giai đoạn qui trình nuôi cấy mô thực vật - Phân tích mối quan hệ giai đoạn nuôi cấy mô dùng cho sinh sản thực vật Điều kiện cần thiết để thực sinh sản nuôi cấy mô thực vật - Trình bày điều kiện cần thiết cho nuôi cấy mô thực vật - Giải sở nuôi nhằm thích tế bào cấy mô tạo thể Vận dụng thấp Vận dụng cao - Phân tích vai trò điều kiện nuôi cấy mô thực vật - Phân tích vai trò điều kiện không thuận lợi cho nuôi cấy mô thực vật Ứng - Mô tả - Giải thích - Ứng dụng - Phân tích dụng thực ứng dụng thực cần thiết công nghệ tiễn tiễn công vai trò công sinh học nuôi ưu nhược 24 sinh sản nghệ nuôi cấy công mô dung cho nghệ nuôi sinh sản thực vật cấy mô thực vật nghệ nuôi cấy mô cấy mô dung điểm nuôi thực vật cho sinh sản cấy mô dung cho sinh sản - Giải thích thực vật ưu nuôi cấy mô dung cho sinh sản Kiểm tra đánh giá Lá hình thành từ : A Mô phân sinh chóp thân C Chồi bên B Tầng sinh mạch D Vỏ trụ Cành bên hoa xuất phát từ : A Lớp sinh bần B Tầng sinh mạch C Chồi bên D Nội bì Mô phân sinh chóp cắt từ đem nuôi môi trường dinh dưỡng phát triển thành : A Thân B Tất mô C Chỉ thân D Mô phân sinh rễ Lá ban đầu dương xỉ bị cắt cho sinh trưởng tiếp môi trường nuôi cấy mô phát triển thành : A Lá dương xỉ bình thường B Lá có dạng khác dương xỉ C Thân cành phụ D Nụ hoa Trình bày phương pháp nhân giống sinh sản sinh dưỡng nhân tạo Hướng dẫn: 1.Giâm: Là hình thức ss từ đoạn thân , cành (mía, sắn,), đoạn rễ (rau, diếp); mảnh (thu hải đường) 2.Chiết: 25 -Cây ăn chiết cành rút ngắn thời gian sinh trưởng , sớm thu hoạch, biết trước đặc tính 3.Ghép: -Là phương pháp nhân giống lợi dụng t/c tốt đoạn thân , chồi, cành ghép lên thân ốc khác -Hai ghép loài, giống khác đặc tính mong muốn 4.Nuôi cấy mô: -Thực tạo hàng loạt phòng thí nghiệm , tạo hàng loạt bệnh sinh trưởng mạnh *Ý nghĩa pp nuôi cấy mô tế bào thực vật: -Đảm bảo tính trạng di truyền mong muốn -Giá trị kinh tế cao, sản xuất giống bệnh, phục chế giống qúi, hạ giá thành sản phẩm… Nêu lợi hạn chế sinh sản vô tính Hướng dẫn: Sinh sản vô tính hình thức sinh sản kết hợp giao tử đực giao tử Con sinh giống giống mẹ Lợi sinh sản vô tính: - Cá thể sống độc lập tạo cháu Có lợi trường hợp mật độ quần thể thấp - Tạo cá thể giống giống mẹ đặc điểm di truyền  sống điều kiện mẹ tồn sinh sản tốt - Tạo số lượng lớn cháu thời gian ngắn Hạn chế sinh sản vô tính: - Không có tính đa dạng di truyền  điều kiện sống thay đổi có nguy tuyệt chủng Hạt phấn thông di chuyển từ nón đực sang nón nhờ : 26 A Gió B Sâu bọ C Chim D Nước Noãn cầu tinh trùng thụ tinh : A Bao phấn.B Đầu nhụy C Ống phấn D Túi phôi Có cho nhiễm sắc thể nhân cực nội nhũ : A Một B Hai C Ba D Tám 10 Nêu đặc điểm thụ phấn thụ tinh thực vật có hoa Hướng dẫn: a.Thụ phấn: -KN: trình hạt phấn từ nhị đến núm nhụy hoa -Qúa trình thụ phấn: hạt phấn sau đưộc vận chuyển đến núm nhụy, hạt phấn nảy mầm -Các hình thức thụ phấn: +tự thụ phấn +Giao phấn -Nảy mầm hạt phấn: Hạt phấn roi vàođầu nhụy gặp thuận lợi nảy mầm mọc ống phấn ống phấn theo vòi nhụyđi vào bầu nhụy, giao tử đực nằm ống phấn , ống phấn mang tới noãn b.Thụ tinh: -KN: hợp nhân gtử đực nhân tế bào trứng túi phôi để ht hợp tử (2n) , khởi đầu cho phôi cá thể -Qúa trình thụ tinh: ống phấn sinh trưởng xuyên qua vòi nhụy , qua lỗ túi phôi vào túi phôi → giảm phân nhân (2giao tử), 1nhân hợp với TB trứng, nhân lại hợp với nhân lưỡng bội (2n) trung tâm túi phôi → nhân tam bội (3n), khởi đầu nội nhũ cung cấp dd cho phôi → thụ tinh kép 11 Trình bày hình thành tạo hạt Khi chín có thay đổi quan trọng xảy Hướng dẫn: 27 a Sư tạo kết hạt: -Noãn thụ tinh(chứa hợp tử TB tam bội) → hạt, hợp tử → phôi , TB tam bội (3n) → nội nhũ(phôi nhũ) -quả bầu nhụy phát triển thành , chức bảo vệ hạt b Sự chín quả, hạt: Sự biến đổi sinh lí: -Khi đạt kích thước cực đại, biến đổi sinh hóa diễn mạnh mẽ -Có biến đổi màu sắc -Mùi vị biến đổi tạo chất thơm có chất este, anđêhit, xêtôn -Khi chín, pectat canxi có tế bào xanh bị phân hủy, tế bào rời nhau, xenlulôzơ thành tế bào bị thủy phân làm tế bào vỏ ruột mềm 12 Sự nảy mầm hạt diễn : A Phôi chuyển từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động B Lá mầm thức tỉnh C Trụ mầm trụ mầm thức tỉnh D Tế bào mạch dẫn vận chuyển từ từ 13 Một hạt ngũ cốc nảy mầm : A Quá trình đường phân diễn mầm B Sự phân hóa phôi C Sự phân chia cách bất thường tế bào mô phân sinh D Nước thấm vào bên hạt 14 Đa số ăn trồng trọt mở rộng : A gieo từ hạt C giâm cành B ghép cành D trồng bầu 15 Con đẻ sản sinh sinh sản sinh dưỡng : A đơn bội B tứ bội 28 C tương tự tính di truyền D yếu sinh sinh sản hữu tính 16 Dạng sinh sản sinh dưỡng phổ biến : A tự nhiên B phân đoạn C tự thụ tinh D sinh sản vô giao 29