Trình bày quy trình và phương pháp thu nhận tế bào, phân lập và nhân nuôi trong môi trường in vitro phục vụ công nghệ tế bào gốc trong việc chưa bệnh hiểm nghèo, kéo dài sự sống và phục vụ cho mục đích con người.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NHÂN NUÔI IN VITRO TẾ BÀO THU TỪ MẪU CUỐNG RỐN PHỤC VỤ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC” Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Nga Ngành Giảng viên hướng dẫn Công nghệ sinh học TS NGUYỄN VĂN HẠNH Viện Công nghệ sinh học TS NGUYỄN HỮU ĐỨC Học viện Nông nghiệp Việt Nam HÀ NỘI, 6/ 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết công bố khóa luận hoàn toàn trung thực, xác chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hạnh, phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học TS Nguyễn Hữu Đức, Trưởng môn Công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Các thầy người hướng dẫn bên cạnh em, quan tâm, giúp đỡ, đưa góp ý, nhận xét truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Với tình cảm chân thành nhất, em xin cảm ơn hướng dẫn giúp đỡ nhiệt tình toàn thể cán phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt ThS Đỗ Trung Kiên, TS Nguyễn Việt Linh, ThS Nguyễn Thị Hiệp ThS Nguyễn Thị Nhung, người hướng dẫn, bảo nhiệt tình chuyên môn kỹ thí nghiệm suốt trình em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam truyền cho em kiến thức quý báu suốt bốn năm em theo học trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, tất người thân gia đình, bạn bè dành tình cảm, ủng hộ, động viên, tạo điều kiện tốt để em học tập hoàn thành tốt công việc thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT cDNA CN-TBG DMSO DMEM DMEM/F12 EGF ESC HSC iPS cell ICM MSC NST P RT-PCR TBG UC-MSC WJ WJ-MSC Complementary DNA Công Nghệ Tế Bào Gốc Dimethyl Sulfoxide Dulbecco's Modified Eagle Medium Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Ham’s F12 Epidermal Growth Factor Embryo Stem Cell Hemapoietic Stem Cell Induced pluripotent stem cell Inner Cell Mass Mesenchymal Stem Cell Nhiễm Sắc Thể Passage Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction Tế Bào Gốc Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cell Wharton’s jelly Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cell Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hình 1.1: Bản đồ tỷ lệ tử vong ung thư giới Hiện nay, ung thư bệnh hiểm nghèo đáng lo ngại Việt Nam giới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố tháng 5/2014, Việt Nam đứng thứ 78 172 quốc gia vùng lãnh thổ tỷ lệ chết bệnh ung thư Theo số liệu mà WHO đưa ra, tỷ lệ chết ung thư Việt Nam 110 ca/100.000 người Theo đó, nhà nghiên cứu y bác sĩ nghiên cứu phương thức chữa trị hiệu Các phương pháp truyền thống hóa trị, xạ trị sử dụng phổ biến hầu hết cho bệnh nhân Song, phương pháp thường gây đau đớn cho người bệnh; gây thiếu máu cho người bệnh tiêu diệt không trúng đích Điều ảnh hưởng nhiều tới sức khỏe người bệnh Vì vậy, tìm phương pháp chữa trị hiệu thách thức lớn cho y học Sử dụng công nghệ tế bào gốc điều trị bệnh hiểm nghèo hướng nghiên cứu đẩy mạnh giới nói chung Việt Nam nói riêng Có thể nói, công nghệ tế bào gốc mở cho y học hướng đầy triển vọng Cấy ghép tế bào gốc bước tiến điều trị ung thư Tuy chưa sử dụng nhiều, giai đoạn nghiên cứu, phương pháp đem lại kết đáng ý Cấy ghép tế bào gốc chia làm hai loại: cấy ghép đồng loại cấy ghép tự thân Cấy ghép đồng loại phương pháp dùng tế bào gốc người khác cấy vào thể người bệnh Điều dẫn tới số hạn chế thải loại ghép, thời gian chờ đợi nguồn tế bào gốc, nguy cao cho người cho người nhận dẫn đến tử vong cho Khác với cấy ghép đồng loại, cấy ghép tự thân phương pháp lấy trực tiếp người bệnh cấy ghép cho người bệnh Phương pháp cho an toàn nay, khắc phục hạn chế cấy ghép đồng loại: tránh thải loại ghép, không cần chờ đợi nguồn cho… Do đó, nhân nuôi nuôi trì tế bào gốc cần tìm hiểu đẩy mạnh nghiên cứu Nguồn tu nhận MSC (Mesenchymal Stem Cell) ban đầu tủy xương, gần tách chúng từ nguồn khác máu ngoại vi, mỡ, da, hệ cơ, hệ mạch… (Phan Kim Ngọc, 2008) Tuy nhiên,hạn chế tiềm tăng sinh, khó khăn mở rộng ex vivo nguồn thu nhận mẫu để tìm kiếm nguồn thay đủ MSC (Taghizadeh et al., 2011; Fan et al., 2011) Trong năm gần đầy, mô phôi cuống rốn thu hút nhiều nhà nghiên cứu tế bào gốc, xem nguồn thay tế bào gốc tiềm (Can and Karahuseyinoglu, 2007; Romanov et al., 2003; Miki, 2011) Cuống rốn trẻ sơ sinh nguồn cung cấp tế bào gốc (TBG) có nhiều ưu điểm phương diện kỹ thuật đạo đức Cuống rốn thu nhận sinh bảo quản đông lạnh hay lưu giữ ngân hàng nguồn TBG dự trữ để sử dụng cho chủ nhân sinh học Từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu phân lập, nhân nuôi invitro tế bào thu từ mẫu cuống rốn phục vụ công nghệ tế bào gốc.” 1.2 Mục tiêu, yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu Phân lập, nhân nuôi nuôi trì in vitro thành công tế bào thu từ mẫu cuống rốn 1.2.2 Yêu cầu - Phân lập thành công tế bào thu từ mẫu cuống rốn Nhân nuôi, nuôi trì tế bào thu Đông lạnh tế bào thu được, tạo nguồn mẫu tế bào sẵn có phục vụ công nghệ tế bào gốc 10 Kết với kết luận Yoon, 2010 Theo ông, tế bào không thay đổi hình thái sau lần cấy chuyển thứ 10, ngừng tăng sinh từ lần cấy chuyển thứ 13 (Yoon et al., 2010) Độ bám dính mảnh mô quan trọng với tốc độ mọc tế bào tế bào Nếu mảnh mô không bám dính, chúng lơ lửng môi trường nhanh chết (Phan Kim Ngọc, 2006) Do tế bào cuống rốn nói chung, tế bào gốc cuống rốn nói riêng tế bào bám dính Các tế bào cần có giá thể để phát triển Trong trình nuôi cấy, nên cẩn thận bước đặt mảnh mô vào đĩa nuôi Mảnh mô cần phải khô môi trường rửa bên ngoài, đặt vào đĩa không bị ướt tăng độ bám dính mảnh mô Đặc biệt, thao tác thực thay môi trường cho mẫu cần thật nhẹ nhàng, tránh mạnh tay làm bong mảnh mô khỏi đáy đĩa nuôi Ngoài ra, có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng tới khả mọc tế bào: thao tác cắt mẫu, môi trường tủ nuôi… Trước cắt mẫu, dụng cụ sử dụng panh kẹp, kéo, dao… cần hơ qua lửa đèn cồn Do đó, cần có thời gian làm nguội dụng cụ Khi sử dụng dụng cụ nhiệt độ cao làm tổn thương tới mảnh mô, chí làm chết tế bào Trong cắt mảnh mô, thao tác dứt khoát, dụng cụ đảm bảo để không làm nát mảnh mô, tổn thương tế bào Đặc biệt, môi trường nuôi quan trọng, cần kiểm tra hệ thống tủ nuôi thường xuyên Trong trường hợp tủ nuôi hỏng, hết khí,… cần có biện pháp khắc phục 4.1.2 Phân lập tế bào enzyme collagenase Type I Hình 4.3: Mảnh mô xử lý collagenase sau 15 phút 43 Nhìn vào hình ta thấy, sau 15 phút xử lý collagenase phần lớn tế bào rìa mảnh mô bị tách riêng rẽ, phía tế bào tách rời nhiều hơn, liên kết tế bào lỏng lẻo Sau 2-3 ngày xử lý, tế bào bắt đầu mọc tăng sinh Tuy nhiên, tốc độ tăng sinh chậm Sau 27 ngày nuôi cấy, thu hoạch tế bào sơ cấp (P0) Điều tương đương với thí nghiệm Yoon, 2013 Sau tuần nuôi cấy, ông bắt đầu thu tế bào P0 (Yoon et al., 2013) Hình 4.4: Tế bào mọc từ mảnh mô xử lý collagenase Tuy nhiên, xử dụng enzyme có hạn chế cần khắc phục thời gian tiếp xúc tế bào với enzyme trình bất hoạt enzyme Collagenase thủy phân liên kết peptide protein, phá hủy protein mức độ thấp Tuy nhiên thời gian tiếp xúc lâu, không xử lý bất hoạt kịp thời, enzyme thủy phân hết màng tế bào, gây tổn hại làm chết tế bào Hình 4.5: Mảnh tế bào sau xử lý collagenase 30 phút 4.1.3 So sánh hai phương pháp phân lập 44 Nuôi cấy mô sơ cấp xử lý enzyme hau kỹ thuật cho phân lập MSC từ cuống rốn người (Seshareddy et al., 2008) Mỗi phương pháp lại có ưu, nhược điểm khác Với mẫu nuôi cấy sơ cấp, thời gian mọc tế bào dài so với mẫu xử lý collagenase, tế bào phát triển ổn định, tăng sinh nhanh Khi xử lý collagenase thu tế bào riêng rẽ tách từ mảnh mô Do đó, tiếp xúc với môi trường nuôi giàu dinh dưỡng, tế bào bám xuống bề mặt đáy đĩa nuôi Thực trình sinh trưởng, phân chia Trong trình nuôi tế bào, nhận thấy rằng, phân lập tế bào nuôi cấy mô sơ cấp thu nhiều tế bào hơn, khả sống tế bào cao Các tế bào phân lập phương pháp xử lý collagenase thu tế bào, tế bào phát triển Theo Yoon et al., 2013; ông thực so sánh hai phương pháp phân lập tế bào Kết theo dõi tế bào P0 ông thể bảng sau: Bảng 4.1: Số lượng tế bào Po thu khả tồn chúng hai phương pháp phân lập (Yoon et al., 2013) Nhìn vào bảng trên, ta thấy rằng, tế bào MSC thu từ nuôi cấy mô sơ cấp gấp khoảng lần so với phương pháp phân lập collagenase Và khả tồn chúng lên tới 96% Quá trình nuôi cấy mô sơ cấp ngăn chặn nguy phá hủy tế bào cách xử lý enzyme Điều dẫn tới tăng khả tồn MSC hiệu suất cao (Yoon et al., 2013) Điều phù hợp với báo cáo Ishige, 2009 4.2 Nhân nuôi, nuôi trì tế bào cuống rốn MSC có đặc tính tăng sinh nhanh, chúng phát triển tạo thành mảng song song với lớp cuộn xoắn gối lên 45 Hình 4.6: Tế bào P4 (Mũi tên vùng tế bào cuộn xoắn, xếp gối lên nhau) MSC tế bào gốc có hình thái giống với tế bào nguyên bào sợi Ở lần cấy chuyền P3, tế bào có dạng hình thoi Chúng bắt đầu có hình dạng giống tế bào nguyên bào sợi từ lần cấy chuyền P4, nhiên chưa có đồng cao quần thể tế bào Hình 4.7: Tế bào P3 có dạng hình thoi Từ lần cấy chuyền thứ 4, tế bào dần trở thành hình sợi, kiểu hình không thay đổi lần cấy chuyền thứ 10 (Yoon et al., 2010) 4.3 Đông lạnh tế bào Đông lạnh tế bào phương pháp để bảo quản lạnh, trì nguồn tế bào cho nghiên cứu Tôi thực đông lạnh lô tế bào: lô tế bào P3 lô tế bào P4 46 Hình 4.8: Lô tế bào đông lạnh P3 (ngày 30/5/2016) Sau cho đông lạnh, có đem giải đông ngẫu nhiên ống để kiểm tra sống tế bào Hình 4.9: Lấy mẫu khỏi bình Nitơ Chúng có thực kiểm tra tế bào trước sau đông lạnh Tế bào nhuộm với Trypan Blue 0,4% Mẫu sau nhuộm nạp vào buồng đếm hồng cầu Thoma, sau quan sát kính hiển vi 47 Hình 4.10 Quan sát tế bào kính hiển vi Những tế bào chết bị nhuộm màu xanh, tế bào sống không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào trong, vậy, tế bào không bắt màu thuốc nhuộm Hình 4.11: Tế bào sau nhuộm với Trupan Blue soi kính hiển vi (Mũi tên đỏ tế bào chết bị nhuộm màu xanh) Trước cho đông lạnh, tỷ lệ tế bào sống 100% Sau đông lạnh giải đông, tế bào chết khoảng 30% Số tế bào chết tăng lên đến 50% sau nuôi ngày Điều giải thích rằng, trình đông lạnh, giải đông, tế bào chịu tác động DMSO làm tổn thương tế bào dẫn đến chết tế bào Do đó, 48 trình giải đông, cần thao tác dứt khoát, nhanh nhẹn, rút ngắn thời gian tế bào tiếp xúc với DMSO nhiệt độ thường, hạn chế khả chết tế bào Khác với phương pháp đông lạnh Glyn N., thực đông lạnh phương pháp cực nhanh Sercin K Sau tế bào bổ sung môi trường đông lạnh, chuyển tế bào vào -70oC để qua đêm, sau cho tế bào vào bình Nitơ lỏng (-196oC) (Sercin K et al., 2007) Trong thí nghiệm này, muốn thử nghiệm DMSO với hồi phục tế bào sau đông lạnh Gần đây, có nghiên cứu rằng, DMSO có phạm vi gây độc rộng tế bào Nó ảnh hưởng trực tiếp tới khả hồi phục tế bào sau đông lạnh (Glyn N and John G ) Ở nồng độ cao, DMSO gây độc, phá hủy tế bào; nhiệt độ thường không nên để DMSO tiếp xúc lâu với tế bào Ở nồng độ 10% DMSO có tác dụng làm mỏng màng tế bào, chí gây tan rã màng nồng độ cao (Gurtovenko et al., 2007) Hoạt động DMSO màng phospholipid tế bào phụ thuộc vào nồng độ thể bảng đây: Bảng 4.2: Hoạt động DMSO lên màng phospholipid phụ thuộc vào nồng độ Nhìn vào bảng trên, ta thấy DMSO tác động trực tiếp tới màng tế bào Ở nồng độ thấp, DMSO làm mỏng màng tế bào Lên tới 10% gây hại tế bào cách làm hỏng màng tế bào Đây lý chọn phương pháp đông lạnh nhanh để đảm bảo an toàn cho tế bào Đông lạnh cực nhanh làm giảm khử nước tế bào, tránh tạo 49 tinh thể đá tế bào Các tinh thể gây tổn thương tế bào trình bảo quản đông lạnh 4.4 Sự biểu marker phân tử 4.4.1 Kết tách RNA Mẫu RNA sau tách chiết đo OD để xác định độ tinh định lượng, phục vụ cho việc sử dụng thí nghiệm Kết đo OD mẫu RNA tách chiết trình bày Bảng : Bảng 4.3 Kết tách RNA Từ kết ta thấy, giá trị OD260 RNA cao, nói hàm lượng RNA thu tốt Tỷ số OD260/280 số để đánh giá độ tinh RNA Tỷ số lớn 1,8 chứng tỏ RNA có độ cần thiết cho nghiên cứu phân tích Như vậy, đánh giá quy trình tách chiết ARN sử dụng kít RNeasy ® Mini Kit cho kết tốt 4.4.2 Biểu marker MSC tế bào nuôi cấy Mẫu RNA sau xác định nồng độ độ tinh cần thiết sử dụng để chạy RT – PCR với mồi đặc hiệu Phản ứng phiên mã ngược khuếch đại thực phản ứng với hỗn hợp enzyme chuẩn bị theo kít QIAGEN® OneStep RT – PCR Kit Sản phẩm RT – PCR kiểm tra, đánh giá điện di gel agarose 1.5% • Kết chạy điện di: 50 Hình 4.12: Kết điện di với marker thị Kết chạy điện di với marker thị trình bày qua bảng sau: Bảng 4.4: Kết biểu marker thị Từ hình bảng cho thấy, marker đặc trưng cho MSC là: CD90, CD73, CD105 (Cerlin K et al., 2007) biểu Ngoài marker bổ sung khác biểu hiện, marker TBG phôi (Embryonic stem cells) như: Oct – 1, Eras Các yếu tố phiên mã tham gia vào trình phát triển quan có nguồn gốc từ nội bì hay trung bì như: GATA4, HNF3β biểu Hơn nữa, có diện phân tử CD86 - protein thể tế bào trình diện kháng 51 nguyên, cung cấp tín hiệu costimulatory (đồng kích thích) cần thiết cho việc tế bào kích hoạt T hệ thống miễn dịch thể (Chang et al., 2010) Trong nghiên cứu này, thử nghiệm marker tế bào gan đối chứng âm cho phản ứng RT - PCR, marker AFP HNF4α Do chưa biệt hóa thành tế bào gan nên kết mong đợi, AFP HNF4α không biểu 52 Phần V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu được, đưa số kết luận sau: - Đã phân lập, nuôi cấy tế bào từ cuống rốn phương pháp nuôi cấy mô sơ cấp - phương pháp xử lý enzyme Các tế bào nhân nuôi ổn định điều kiện in vitro Quần thể tế bào có biểu thị phân tử đặc trưng tế bào gốc cuống rốn Các tế bào sau đông lạnh có tỷ lệ sống thấp, Trước cho đông lạnh, tỷ lệ tế bào sống 100% Sau đông lạnh giải đông, tế bào chết khoảng 30% Số tế bào chết tăng lên đến 50% sau nuôi ngày, 70-80% sau ngày nuôi 5.2 Kiến nghị - Thực tách dòng loại tế bào gốc, phục vụ thí nghiệm - Tiếp tục theo dõi trì dòng tế bào gốc trung mô phân lập qua lần cấy - chuyển Thử nghiệm biệt hóa MSC thành tế bào chuyên hóa để chứng minh tính đa tiềm - chúng Nghiên cứu cải thiện trình đông lạnh, lưu trữ tế bào tốt hơn, phục vụ cho thí nghiệm - 53 Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006) "Công nghệ sinh học người động vật." Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2008) "Công nghệ tế bào gốc." Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Tài liệu Tiếng Anh: Yoon HH., Jung BY., Seo YK., Song KY and Park JK (2010) In vitro hepatic differentiation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell Process Biochemistry 45(1857-1864) Elsevier Sercin K., Ozgur C., Emine K., Fadil K and Guvem GA (2007) Biology of Stem Cells in Human Umbilical Cord Stroma: In Situ and In Vitro Surveys Stem cells 25 (319-331) Kerlin Q., Lisiane B., Daniela S., Cristiane S., Thayane C., Raquel F and Patricia P (2010) Compare two human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation protocol Jong HY., Eun YR., Sue S., Nam HJ., Eun YS., Ju YC., Byoung JK and Hye WJ (2013) Comparison of Explant-Derived and Enzymatic Digestion-Derived MSCs and the Growth Factors from Wharton’s Jelly BioMed Research International Lu LL., Liu YJ., Yang SG et al (2006) Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials Haematologica 91 (1017–1028) Sotiropoulou PA.,Perez SA., Salagianni M., Baxevanis CN., and Papamichail M (2006) Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells Stem Cells 24 (462–471) Fatemeh H., Hojjat SA and Shaghayegh HJ (2014) Comparison of human mesenchymal stem cells isolated by explant culture method from entire umbilical cord and Wharton’s jelly matrix Cell Tissue Bank Seshareddy K., Troyer D and Weiss ML (2008) Method to isolate mesenchymal like cells from Wharton’s jelly of umbilical cord Methods Cell Biol 86 (101–119) Taghizadeh RR., Cetrulo KJ and Cetrulo CL (2011) Wharton’s jelly stem cells: future clinical applications Placenta 32 (311–315) 54 10 Fan CG, Zhang QJ and Zhou JR (2011) Therapeutic potentials of mesenchymal 11 stem cells derived from human umbilical cord Stem Cell Rev (195–207) Petsa A, Gargani S, Felesakis A, Grigoriadis N and Grigoriadis I (2009) Effectiveness of protocol for the isolation of Wharton’s jelly stem cells in large- 12 scale applications Vitro Cell Dev Biol Anim 45 (573–576) Can A and Karahuseyinoglu S (2007) Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetusderived stem cells Stem Cells 25 (2886– 13 2895) Karahuseyinoglu S., Cinar O., Kilic E., Kara F., Akay GG., Demiralp DO., Tukun A., Uckan D and Can A (2007) Biology of stem cells in human umbilical cord 14 stroma: in situ and in vitro surveys Stem Cells 25 (319–331) Romanov YA., Svintsitskaya VA., Smirnov VN (2003) Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from 15 umbilical cord Stem Cells 21 (105–110) Miki T (2011) Amnion-derived stem cells: in quest of clinical applications Stem 16 Cell Res Ther (25) Bordet S., Nguyen TM., Knoppers BM and Isasi R (2010) Use of umbilical cord blood for stem cell research Journal of Obstetrics and Gynaecology Canada 32 17 (58–61) O’Brien TA., Tiedemann K., Vowels MR (2006) No longer a biological waste 18 product: umbilical cord blood Med J Aust 184 (407–410) Carlin R., Davis D., Weiss M., Schultz B., Troyer D (2006) Expression of early transcription factors Oct-4, Sox-2 and Nanog by porcine umbilical cord (PUC) 19 matrix cells Reprod Biol Endocrinol (8) La Rocca G., Anzalone R., Corrao S., Magno F., Loria T., Lo Iacono M., Di Stefano A., Giannuzzi P., Marasa L., Cappello F., Zummo G and Farina F (2009) Isolation and characterization of Oct-4?/HLA-G?mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new 20 markers Histochem Cell Biol 131(267–282) Kim MJ., Shin KS., Jeon JH., Lee DR., Shim SH., Kim JK., Cha DH., Yoon TK and Kim GJ (2011) Human chorionic-plate-derived mesenchymal stem cells and Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells: a comparative analysis of their potential as placenta-derived stem cells Cell Tissue Res 346 (53–64) 55 21 Fong CY., Subramanian A., Biswas A., Gauthaman K., Srikanth P., Hande MP and Bongso A (2010) Derivation efficiency, cell proliferation, freeze-thaw survival, stem-cell properties and differentiation of human Wharton’s jelly stem cells Reprod 22 Biomed Online 21 (391–401) Hass R., Kasper C., Bohm S., Jacobs R (2011) Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal 23 tissue-derived MSC Cell Commun Signal (12) John GD and Glyn NS Cryopreservation and Freeza- Drying protocols Humnana 24 Press (second edition) 365 papers Mandana HS., Annette E and Jens K (2016) Cryopreservation and Revival of Human Mesenchymal Stromal Cells Methods in Molecular Biology 1416 (4939- 25 3584) Shen CJ., Chan TF., Chen CC., Hsu YC., Long CY., Lai CS (2016) Human umbilical cord matrix–derived stem cells expressing interferon-β gene inhibit breast 26 cancer cells via apoptosis Oncotarget Kalamegam G., Fong CY., Suganya C., Arijit B., Mahesh C and Ariff B (2012) Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Stem Cell (hWJSC) Extracts Inhibit Cancer 27 Cell Growth In Vitro Cellular Biochemistry Alp C and Deniz B (2011) Isolation, Culture, and Characterization of Human Umbilical Cord Stroma-derived Mesenchymal Stem Cells Methods in Molecular 28 Biology 698 (51-62) Yan HF., Tao R., Sun TJ., Chai JK., Xu G and Liu J (2013) Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods 29 Cytotechnology 65 (819–827) Ma Y., Hao X., Zhang S Zhang J (2012) The in vitro and in vivo effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the growth of breast cancer cells Breast 30 Cancer Res Treat 133 (473–485) Kim DW., Staples M., Shinozuka K., Pantcheva P., Kang SD and Cesar VB (2013) Wharton’s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: Phenotypic Characterization and Optimizing Their Therapeutic Potential for Clinical Applications Molecular Sciences 14 (11692-11712) 56 31 Tang W., Zeve D., Suh JM., Bosnakovski D., Kyba M.; Hammer RE., Tallquist MD., Graff JM (2008) White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature 32 Science 322 (583–586) Ayuzawa R., Doi C., Rachakatla RS., Pyle MM., Maurya DK., Troyer D., Tamura M (2009) Naive human umbilical cord matrix derived stem cells significantly attenuate growth of human breast cancer cells in vitro and in vivo Cancer Lett 280 33 (31–37) Ganta C., Chiyo D., Ayuzawa R., Rachakatla R., Pyle M., Andrews G., Weiss M., Tamura M and Troyer D (2009) Rat umbilical cord stem cells completely abolish rat mammary carcinomas with no evidence of metastasis or recurrence 100 days 34 post-tumor cell inoculation Cancer Res 69 (1815–1820) Scheers I., Lombard C., Najimi M and Sokal E (2011) Cell therapy for the treatment of metabolic liver disease: An update on the umbilical cord derived stem 35 cells candidates Open Tissue Eng Regen Med J 4( 48–53) Campard D., Lysy PA., Najimi M., Sokal EM (2008) Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells Gastroenterology 134 (833–848) 57