Đánh giá tác động của capsaicin từ ớt đối với thụ thể neurokinin – 1 ở tế bào lympho của chuột

PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI MỤC LỤC PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc chung thụ thể liên kết vùng xuyên màng (7 – transmembrane receptor, 7TM) Hình 2: Cấu trúc SP Hình 3: Cấu trúc AP Hình 4: Cấu trúc thụ thể neurokinin – Hình 5: Cây ớt Hình 6: Quả ớt Hình 7: Cấu trúc capsaicin Hình 8: Peak thời gian xuất capsaicin Hình 9: Peak bước sóng xuất capsaicin Hình 10: Đường chuẩn capsaicin Hình 11: Sơ đồ xuất diện tích peak capsaicin đường chuẩn Hình 12: Tế bào lympho tách từ máu chuột Hình 13: Mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác thời gian 60 giây Hình 14: Mật độ Ca2+của tế bào lympho bị kích thích SP 10 -7 khoảng thời gian khác Hình 15: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với SP 10 -7 dải nồng độ AP khác Hình 16: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác Hình 17: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác SP 10-7 khoảng thời gian khác DANH MỤC BẢNG PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Bảng 2.1: Ái lực liên kết phối tử thụ thể Bảng 3.1: Dung dịch A Bảng 3.2: Dung dịch B Bảng 4.1: Diện tích peak capsaicin đường chuẩn Bảng 4.2: Kết đo mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác Bảng 4.3: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca 2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác thời gian 60 giây Bảng 4.4: Bảng giá trị mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích SP nồng độ 10-7 khoảng thời gian khác Bảng 4.5: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca 2+ tế bào lympho kích thích SP nồng độ 10-7 khoảng thời gian khác Bảng 4.6: Kết đo mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với SP 10-7 dải nồng độ AP khác Bảng 4.7: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca 2+ tế bào lympho ủ với SP 10-7 dải nồng độ AP khác Bảng 4.8: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác Bảng 4.9: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca 2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác Bảng 4.10: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác SP 10-7 khoảng thời gian khác Bảng 4.11: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca 2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác SP 10-7 khoảng thời gian khác PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI I MỞ ĐẦU Thụ thể neurokinin – (NK – 1) thuộc nhóm thụ thể xuyên màng liên kết với G – Protein, biểu mạnh khu vực não có mặt tế bào hệ thống miễn dịch Chất Substance P (SP) phối tử có lực cao với thụ thể này, tương tác với dẫn truyền cảm giác đau từ vùng thần kinh ngoại vi hệ thần kinh trung ương, gây trạng thái lo âu triệu chứng chống trầm cảm, gây tác dụng kích thích co trơn ảnh hưởng đến điều hòa phản ứng miễn dịch thể Ngày nay, sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật quan tâm chúng có tính an toàn cao, hiệu lâu dài giá thành thấp Do đó, việc tìm kiếm chất có hoạt tính dược học từ tự nhiên hướng nghiên cứu quan tâm phát triển Capsaicin hoạt chất gây cay nóng tìm thấy thực vật thuộc nhóm Ớt, công bố có vai trò quan trọng làm giảm bớt trình sinh SP thể Do vậy, capsaicin có khả giúp điều trị số triệu chứng bệnh đau thần kinh ngoại biên Tuy nhiên, chưa có công bố liên quan đến hoạt tính capsaicin ớt thụ thể NK – Chính vậy, em chọn đề tài: “Đánh giá tác động capsaicin từ ớt thụ thể neurokinin – tế bào lympho chuột Swiss” để đánh giá vai trò capsaicin góp phần tìm chất có tiềm ứng dụng lĩnh vực dược học tương lai PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Thụ thể liên kết G – protein (GPCR) Quá trình tiếp nhận xử lý thông tin phận tế bào tế bào với đặc điểm quan trọng tế bào thể sống, giúp tế bào thể trả lời phản ứng từ môi trường điều hòa hoạt động sống, thụ thể đóng vai trò quan trọng [11] Thụ thể đại phân tử protein, có vị trí phân bố đặc biệt màng tế bào, tế bào chất Chúng có khả nhận biết gắn đặc hiệu với số phân tử khác (ligand – phối tử) tế bào đích, nội hay ngoại sinh Các phối tử thường nhỏ so với thụ thể, chúng hormone, chất dẫn truyền thần kinh, alcaloid morphin, chất hữu có phân tử nhỏ, thuốc hay vài loại ion Mỗi loại thụ thể gắn kết với phối tử mang cấu trúc định nhờ có cấu trúc bậc ba protein mà thụ thể tạo nên có hoạt tính sinh học đặc hiệu Phối tử tạo phức với thụ thể thường chia làm hai loại: chất chủ vận (agonist) chất đối vận (antagonist) Chất chủ vận (agonist) tạo phức với thụ thể, khâu chuỗi phản ứng tạo nên tác dụng phối tử, tiếp phối tử gây luồng kích thích qua phát huy hoạt tính gọi hiệu lực Chất đối vận (antagonist) tác dụng lên nơi thụ thể với chất chủ vận đối kháng cạnh tranh Chất đối vận tác dụng lên vị trí khác với nơi chất chủ vận tương tác làm biến đổi dạng phân tử thụ thể thành “dị dạng”, hậu làm cho chất chủ vận không gắn chặt với thụ thể dị dạng thông thường Sự đối kháng thuộc loại đối kháng không cạnh tranh Chất đối vận có lực với thụ thể phức hợp không tạo nên hiệu lực tác dụng Có hai loại thụ thể: thụ thể màng thụ thể nội bào Thụ thể màng thụ thể nằm màng tế bào Dựa vào cấu trúc, chức chế hoạt động thụ thể màng chia thành nhóm: thụ thể liên kết với G – protein, thụ thể enzyme, thụ thể kênh vận chuyển Thụ thể nội bào thụ thể nằm tế bào chất, PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI nhân tế bào bào quan tế bào, chúng tiếp nhận loại thông tin như: Steroid, cortinoit… II.1.1 G – protein G – protein phát mô tả lần Alfred Martin, công trình giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [6] G – protein nhóm protein lớn có chất enzyme GTPase Dựa vào kích thước người ta chia chúng thành hai họ: GTPase dạng monomer kích thước nhỏ G – protein dạng trimer kích thước lớn G – protein định vị mặt màng tế bào hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết G – protein (G – protein – coupledreceptor, GPCR) phân bố màng tế bào II.1.2 Thụ thể liên kết G – protein Họ thụ thể liên kết G – protein (G protein – coupled receptor – GPCR) protein nằm màng tế bào, phân tử protein có kích thước nhỏ (350 – 500 acid amine), chúng phân thành phân họ khác dựa theo độ tương đồng trình tự acid amine, chức khả liên kết với phối tử [7] Chúng có tên gọi nhằm nói đến chế truyền tín hiệu phổ biến thông qua thụ thể protein liên kết với GTP bên tế bào chuỗi peptide GPCR thường gấp khúc lần qua màng tế bào nên nhiều trường hợp GPCR gọi thụ thể vùng xuyên màng (7 – transmembrane receptor, 7TM) PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Hình 1: Cấu trúc chung thụ thể liên kết vùng xuyên màng (7 – transmembrane receptor, 7TM) (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/G_protein-coupled_receptor) Họ GPCR chia thành ba lớp chính: lớp A, B, C Lớp A gọi rhodopsin lớp chiếm số lượng lớn thụ thể trọng họ GPCR Lớp A cho phép nhận tín hiệu từ chemokine, hormone có chất peptide đặc biệt dẫn truyền tín hiệu liên quan đến mùi hương Lớp B – lớp secretin dẫn truyền tín hiệu liên quan đến hormone có chất calcitonin Lớp C – lớp thụ thể glutamate có vai trò thu nhận tín hiệu trình trao đổi chất dinh dưỡng tế bào [7] Hầu hết thụ thể gắn them carbonhydrate vào đầu amino palmityl hóa vị trí Cystein đầu carboxyl [19] Các protein tiếp nhận nhiều loại tín hiệu sinh lý bên tế bào, tín hiệu thay đổi nồng độ peptide, hormone, lipid, chất dẫn truyền thần kinh, ion, chất có mùi, chất có vị chùm photons đến mắt Nhiệm vụ GPCR chuyển hóa tín hiệu vào bên tế bào kích hoạt chuỗi phản ứng tương ứng có tham gia nhiều protein, nucleotide hay ion kim loại cuối dẫn đến phản ứng sinh lý tế bào thích ứng Theo nghiên cứu, GPCR đóng vai trò PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI nhiều trình sinh lý: từ hệ thần kinh đến khứu giác, vị giác đặc biệt chúng có vai trò quan trọng ngành công nghiệp dược, khoảng 50% loại thuốc tác động đến thể thông qua GPCR loại thuốc nhắm vào GPCR có khả chữa bệnh nan y liên quan đến hệ thần kinh trung ương, tim mạch, bệnh viêm nhiễm, rối loạn trao đổi chất G –protein có nhiều vai trò quan trọng phức hợp thụ thể tạo nên tác dụng sinh học làm nhiệm vụ truyền tải thông tin phối tử Khi phối tử mang tín hiệu (hormone, photon…) chúng liên kết đặc hiệu với thụ thể bề mặt tế bào làm thay đổi cấu hình GPCR Sự thay đổi khiến G – protein chuyển từ trạng thái liên kết với GDP sang trạng thái liên kết với GTP tiểu đơn vị α Sau phức GαGTP tách khỏi phức dimer Gβγ, lúc chúng kích hoạt enzyme hình thành chất truyền tin thứ hai cAMP sinh inositol triphosphate/diacetyl glycerol (IP3/DAG) Quá trình phụ thuộc vào tiểu đơn vị α G – Protein, từ dẫn đến tín hiệu truyền dẫn làm thay đổi hoạt động sinh lí, sinh hóa tế bào [9] Trong hệ gen người, có khoảng 1000 gen mã hóa loại thụ thể 7TM khác chúng liên quan đến trình cảm ứng với hàng loạt kích thích đến từ môi trường ngoại bào thụ thể adrenaline, thụ thể dopamine, thụ thể histamine, thụ thể ánh sáng rhodopsin nhiều thụ thể liên quan đến khứu giác vị giác II.2 Thụ thể họ tachykinin thụ thể neurokinin – II.2.1 Thụ thể họ tachykinin Thụ thể họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A họ thụ thể liên kết G – protein Ở động vật có vú, có ba dạng TACR phát neurokinin (NK1), neurokinin (NK2) neurokinin (NK3) tương ứng với tachykinin subtance P (SP), neurokinin A (NKA) neurokinin B (NKB) Thực tế thụ thể tachykinin liên kết chéo lực liên kết thay đổi thụ thể phối tử PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Bảng 2.1: Ái lực liên kết phối tử thụ thể Phối tử Ái lực liên kết SP NK1>NK2>NK3 NKA NK2>NK3>NK1 NKB NK3>NK2>NK1 Cả ba thụ thể có cấu trúc khác có chung chế hoạt động: sau phối tử liên kết với thụ thể, phức hợp thụ thể - phối tử hình thành kích thích phân tử G – protein, làm tăng lượng Ca 2+ nội bào hoạt hóa phospholipase C làm phân hủy phosphoinositol thành IP3/DAG Chất đối vận thụ thể NK1 có chế hoạt động tương tự SP chứng minh có khả chống suy nhược chất đối vận với thụ thể NK2 chứng minh có tác dụng chống lo âu, chất đối vận với thụ thể NK3 có chức chống lại rối loạn thần kinh II.2.2 Thụ thể neurokinin – (Thụ thể NK1) Tachykinin tham gia vào nhiều tiến trình sinh lý chúng phân bố rộng rãi thể: ngoại b5iên chúng có vai trò tiết nước bọt điều hòa lượng máu, tính thấm thành mạch, tiết ruột non,… Ngoài chúng hoạt động tác nhân dẫn truyền cảm giác đau từ ngoại biên Đặc biệt hệ thần kinh trung ương tachykinin có vai trò dẫn truyền điều hòa thần kinh SP chất đóng vai trò quan trọng họ tachykinin, chất có khả liên kết với ba loại thụ thể NK1, NK2 NK3 phối tử có lực cao với thụ thể NK1, nói cách khác thụ thể NK1 đóng vai trò trung gian biểu chức SP SP tinh giải trình từ năm 1971 Chang cộng sự, SP cấu tạo 11 acid amine: Arg – Pro – Lys – Pro – Gln – Gln – Phe – Phe – Gly – Leu – Met Có nhiều tế bào biết SP bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, lympho, tiểu thần kinh đệm tế bào đuôi gai SP chứng minh có liên quan đến số lượng lớn rối loạn liên quan đến viêm mãn tính như: hen suyễn, viêm phế quản mãn tính, rối loạn viêm nhiễm đường tiêu hóa, viêm bàng quang, chúng liên quan PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI đến chứng đau nửa đầu, trầm cảm, nôn mửa, rối loạn thần kinh, SP đóng vai trò quan trọng hệ thống tim mạch SP gây loạt phản ứng đại thực bào làm tăng khả đại thực bào, khuếch đại phản ứng viêm Các tác dụng sinh học SP thể thông qua thụ thể NK1 Hình 2: Cấu trúc SP (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Substance_P.svg) Aprepitant (AP) hợp chất hóa học thuộc chất đối vận thụ thể NK – 1, chất ngăn chặn SP, không cho SP liên kết với thụ thể NK – Aprepitant chất rắn kết tinh, dễ hòa tan dung môi không phân cực Hình 3: Cấu trúc AP (Nguồn: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Aprepitant.svg) Thụ thể Neurokinin thành viên họ thụ thể liên kết G – protein với cấu trúc điển hình lần xuyên màng, đầu N màng, đầu C màng Gen 10 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI • Mẫu có khả làm thay đổi Ca2+ phân tích tiếp khả thay đổi Ca2+ AP: - Tế bào lympho tách từ chuột ủ với Aprepitant (AP) nồng độ 10 -6 M trước 20 phút, sau đưa thêm dịch pha loãng capsaicin nồng độ: µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml ủ 30, 60, 90, 120 giây - Bổ sung thêm 100 µl dung dịch Kit Fura -2 vào giếng - Ủ đĩa tế bào vào tủ nuôi cấy tế bào 37 ° C để - Để đĩa tế bào ủ nhiệt độ phòng 20 phút - Đưa đĩa vào thiết bị phân tích phát huỳnh quang (hidex) đo hai bước sóng là: Ex/Em= 340/510 nm Ex/Em= 380/510 nm - Hiệu kết thay đổi hai bước sóng khả thay đổi nồng độ Ca2+ • Mẫu có khả làm giảm nồng độ Ca2+ bước đầu kết luận chất chủ vận b) Đánh giá hoạt tính đối vận capsaicin • Tế bào lympho tách từ chuột ủ với dịch pha loãng capsaicin nồng độ: µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml ủ 20 phút • Sau đưa thêm SP với nồng độ 10-7 M ủ 60 giây • Bổ sung thêm 100 µl dung dịch Kit Fura -2 vào giếng • Ủ đĩa tế bào vào tủ nuôi cấy tế bào 37 ° C để • Để đĩa tế bào ủ nhiệt độ phòng 20 phút • Đưa đĩa vào thiết bị phân tích phát huỳnh quang (hidex) đo hai bước sóng là: Ex/Em= 340/510 nm Ex/Em= 380/510 nm • Hiệu kết thay đổi hai bước sóng khả thay đổi nồng độ Ca2+ 21 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI • Mẫu có thay đổi Ca2+ phân tích tiếp - Tế bào lympho tách từ chuột ủ với dịch pha loãng capsaicin nồng độ: µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml ủ 30, 60, 90, 120 giây - Bổ sung thêm 100 µl dung dịch Kit Fura -2 vào giếng - Ủ đĩa tế bào vào tủ nuôi cấy tế bào 37°C để - Để đĩa tế bào ủ nhiệt độ phòng 20 phút - Đưa đĩa vào thiết bị phân tích phát huỳnh quang (hidex) đo hai bước sóng là: Ex/Em= 340/510 nm Ex/Em= 380/510 nm - Hiệu kết thay đổi hai bước sóng khả thay đổi nồng độ Ca2+ • Mẫu có khả làm tăng Ca2+ bước đầu kết luận chất đối vận 22 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN IV.1 Kết thí nghiệm IV.1.1 Xây dựng đường chuẩn capsaicin Tách capsaicin từ ớt • 100g ớt tươi nghiền nhỏ máy xay, ngâm ethanol 96% 80 oC 4h, sau li tâm thu dịch đưa vào phân tách máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC) Sau chạy phân tích hàm lượng mẫu capsaicin, ta thấy capsaicin xuất bước sóng 250 – 280nm Trong thời gian 25 – 35 phút Phù hợp với công bố đưa mAU 280nm,4nm (1.00) 3000 2500 2000 1500 1000 500 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 Hình 8: Peak thời gian xuất capsaicin 23 35.0 PHÙNG MINH TUẤN 201 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI mAU 35.76/ 1.00 150 125 100 75 280 50 200 300 400 500 643 646 671 500 385 251 25 600 700 nm Hình 9: Peak bước sóng xuất capsaicin Căn khoảng thời gian ta tiến hành thu capsaicin chạy phân tách HPLC khoảng thời gian bước sóng Capsaicin phân đoạn sau tách HPLC phân tích lại HPLC với cột Shim-pack VP-ODS (250mm x 4,6mm) bước sóng 254nm, nhiệt độ cột 25oC Pha động, dung dịch methanol acid phosphoric (70 :30), rửa giải với tốc độ dòng 0,8 ml/phút Kết ghi lại dectector quang kế Xây dựng đường chuẩn capsaicin • Conc.(x10) 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 Area Hình 10: Đường chuẩn capsaicin Dựa đường chuẩn capsaicin, em tính hàm lượng capsaicin thu từ dịch chiết ớt 24 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Conc.(x10) 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 Area Hình 11: Sơ đồ xuất diện tích peak capsaicin đường chuẩn Bảng 4.1: Diện tích peak capsaicin đường chuẩn - Level Conc 10.00000 20.00000 30.00000 40.00000 50.00000 Mean Area 1245459 2545494 3439722 3901940 4784092 SD %RSD 89318.95 3.508904 Area1 Area 11245459 12482336 13439722 13901940 14787092 12608652 0 Ta có capsaicin chuẩn nồng độ 0.05g/ml => 20µl chứa 0.001g capsaicin Dịch chiết tổng số 50µl có diện tích peak capsaicin 12608652 Dịch chuẩn Capsaicin 20µl có diện tích peak 12482336 => Ta có công thức tính số gram capsaicin 50µl dịch tổng số là: - Số lượng ớt tách chiết 100g ớt/100ml ethanol Trong 50µl dịch tổng số chứa 0.00101g => 1ml chứa 0.02g Từ suy nồng độ capsaicin ớt 0.02g capsaicin/1g ớt => Capsaicin chiếm 2% thành phần ớt IV.1.2 Tế bào lympho tách từ máu chuột Sau tế bào lympho tách từ máu chuột, nuôi môi trường RPMI có bổ sung thêm 10% FBS Sau đó, nuôi đĩa tủ nuôi tế bào (37 oC, 5% CO2) 25 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Hình 12: Tế bào lympho tách từ máu chuột IV.1.3 SP kích thích thụ thể NK – biểu tế bào lympho Trên tế bào lympho có thụ thể NK – Do vậy, để đánh giá trình biểu protein NK – tế bào lympho kích thích SP, tế bào lympho tách từ chuột ủ với SP nồng độ khác thời gian 60 giây Sau đo khả thay đổi Ca2+ tế bào máy phân tích huỳnh quang, ta thu bảng kết sau: Bảng 4.2: Kết đo mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác L1 L2 L3 T B L1 L2 L3 T Đối chứng (ĐC) 340 380 380 – 340 347 14177 10703 359 14112 10519 325 13024 9779 10331.33 340 653 742 781 10-8 380 380 – 340 31314 24780 34507 27087 35947 28136 26667.67 340 646 732 745 340 633 749 760 10-6 380 380-340 3013 23670 3432 27003 3468 27230 25967.67 10-9 380 380 – 340 2975 23421 3445 26957 3589 28292 26223.33 26 10-7 340 662 732 760 380 3283 3438 3673 380 - 340 26216 27056 29130 27467.33 10-10 340 649 561 772 380 3034 2615 3518 380 – 340 23846 20540 27461 23949 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI B Bảng 4.3 : Bảng giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác thời gian 60 giây Bảng giá trị trung bình Bước sóng Nồng độ SP Sai số chuẩn (380 – 340) ĐC 10331 493 -6 10 25968 1993 10-7 27467 1500 -8 10 26668 1717 -9 10 26223 2517 -10 10 23949 3462 Hình 13: Mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác thời gian 60 giây Từ bảng kết thu được, cho thấy tế bào lympho ủ với SP nồng độ từ 10-6 đến 10-8 khoảng thời gian có khả làm tăng Ca 2+ so với giếng đối chứng Nồng độ SP thấp có khả làm tăng Ca 2+ 10-8 Trong đó, SP có nồng độ 10-7 có khả làm tăng Ca 2+ mạnh Qua đó, ta tiếp tục sử dụng SP nồng độ 10 -7 để tiến hành đánh giá khả tăng Ca 2+ khoảng thời gian khác : 30, 60, 90, 120 giây Ta thu bảng kết sau: Bảng 4.4: Bảng giá trị mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích SP nồng độ 10-7 khoảng thời gian khác 340 380 380 – 340 L1 3578 13705 10127 Đối chứng L2 L3 3700 3428 14809 15094 11109 11666 TB 10967 27 L1 6555 30842 24287 30 giây L2 L3 6233 4450 28934 17771 22701 13321 TB 20103 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI 340 380 380 - 340 L1 6354 28397 22043 60 giây L2 L3 7094 7631 32284 35464 25190 27833 340 380 380 - 340 L1 5692 26999 21307 L2 6353 29536 23183 TB 25022 L1 6321 29071 22750 90 giây L2 L3 6884 7022 32798 32716 25914 25694 TB 24786 120 giây L3 6865 31743 24878 TB 23122 Bảng 4.5: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích SP nồng độ 10-7 khoảng thời gian khác SP 10-7 Đối chứng 30 giây 60 giây 90 giây 120 giây Bước sóng 380 – 340 (nm) 10967 20103 25022 24786 23122 Hình 14: Mật độ Ca2+của tế bào lympho bị kích thích SP 10-7 khoảng thời gian khác 28 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Với SP nồng độ 10-7 có khả kích thích sinh Ca 2+ tăng rõ rệt so với mẫu đối chứng khoảng thời gian 30, 60, 90, 120 giây Thời gian kích thích mạnh 60 giây Từ thí nghiệm ta kết luận nồng độ SP kích thích thụ thể NK – biểu tế bào lympho mạnh 10-7 thời gian 60 giây đưa vào tế bào IV.1.4 Đánh giá khả ức chế sinh Ca2+ thông qua SP tế bào lympho AP AP chất ngăn chặn SP, không cho SP liên kết với thụ thể NK – Tế bào lympho chuột sau tách ủ với dải nồng độ AP từ 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 thời gian 20 phút, sau thêm SP nồng độ 10 -7 60 giây Ta thu bảng kết sau : Bảng 4.6: Kết đo mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với SP 10-7 dải nồng độ AP khác SP 10-7 Đối chứng AP 10-4 + SP 10-7 340 380 380 – 340 340 380 380-340 340 380 380 - 340 L1 3096 6447 3351 3239 6491 3252 4222 8371 4149 L2 3072 6395 3323 3546 7092 3546 4258 8429 4171 L3 3127 6358 3231 3542 9201 5659 4165 8216 4051 TB 3301 4152 AP 10-5 + SP 10-7 4124 AP 10-6+ SP 10-7 AP 10-7 + SP 10-7 340 380 380 – 340 340 380 380 – 340 340 380 380 – 340 L1 4013 7850 3837 4341 8434 4093 3594 6926 3332 L2 4214 8171 3957 4037 7856 3819 3888 7522 3634 L3 4102 7996 3894 3919 7432 3513 3877 7406 3529 TB 3896 AP 10-8 + SP 10-7 3808 AP 10-9+ SP 10-7 29 3498 AP 10-10+ SP 10-7 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI 340 380 380 – 340 340 380 380 – 340 340 380 380 – 340 L1 3967 7553 3586 3866 7348 3482 3910 7370 3460 L2 3964 7527 3563 3935 7400 3465 3751 7175 3424 L3 3945 7505 3560 3902 7362 3460 3595 6859 3264 TB 3570 3469 3383 Bảng 4.7 : Bảng giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với SP 10-7 dải nồng độ AP khác Bảng giá trị trung bình Bước sóng (380 – 340) Nồng độ SP ĐC SP 10-7 AP 10-4 + SP 10-7 AP 10-5 + SP 10-7 AP 10-6 + SP 10-7 AP 10-7 + SP 10-7 AP 10-8 + SP 10-7 AP 10-9 + SP 10-7 AP 10-10 + SP 10-7 3301 4152 4124 3896 3808 3498 3570 3469 3383 Sai số chuẩn 63 1313 64 60 290 153 14 12 104 Hình 15: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với SP 10-7 dải nồng độ AP khác Từ bảng kết thu được, với nồng độ AP khác có khả ức chế hoạt động SP với mức độ khác Khả ức chế SP AP mạnh với AP 10-6 Ta tiếp tục sử dụng AP nồng độ 10-6 để phục vụ cho nghiên cứu 30 ĐC SP 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10- PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI IV.1.5 Đánh giá hoạt tính chủ vận capsaicin Tế bào lympho tách từ chuột ủ với capsaicin nồng độ µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml thời gian phút, phút, phút, phút, phút Đo khả thay đổi Ca2+ máy phân tích huỳnh quang Ta thu kết sau: Bảng 4.8: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác Đối chứng 380 14688 340 3673 380 - 340 11015 phút phút phút phút phút Capsaicin µg/ml 340 380 3360 16414 3326 15487 3237 14650 3117 14581 3390 15156 380 - 340 13054 12161 11413 11464 14471 phút phút phút phút phút Capsaicin 10 µg/ml 340 380 3616 16331 3731 16774 4151 19530 3929 18289 4130 18601 380 - 340 12715 13043 15379 14360 14471 phút phút phút phút phút Capsaicin 100 µg/ml 340 380 3543 15958 4041 20417 3692 17205 3470 15325 3824 16969 380 - 340 12413 16376 13513 11855 13145 31 PHÙNG MINH TUẤN phút phút phút phút phút TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Capsaicin 1000 µg/ml 340 380 3423 16145 4075 21060 3686 18352 3374 15202 3907 18627 380 - 340 12722 16985 14666 11828 14720 Bảng 4.9: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác phút phút phút phút phút Đối chứng µg/ml 13054 12161 11413 11464 14471 10 µg/ml 12715 13043 15379 14360 14471 380 14688 100 µg/ml 12413 16376 13513 11855 13145 340 3673 1000 µg/ml 12722 16985 14666 11828 14720 380 - 340 11015 Hình 16: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác Dựa vào số liệu thu được, ta thấy, ủ tế bào với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác nhau, capsaicin khả kích thích tăng Ca2+ Từ ta kết luận capsaicin chất chủ vận Với kết này, ta tiếp tục đánh giá hoạt tính đối vận capsaicin IV.1.6 Đánh giá hoạt tính đối vận capsaicin Tế bào lympho tách từ chuột ủ với capsaicin nồng độ µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml thời gian 20 phút sau thêm SP 10 -7 khoảng thời gian phút, phút, phút, phút, phút Đo khả thay đổi Ca 2+ máy phân tích huỳnh quang Ta thu kết sau: 32 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Bảng 4.10: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác SP 10-7 khoảng thời gian khác phút phút phút phút phút Capsaicin µg/ml + SP 10-7 340 380 3159 14473 3728 15554 3995 17619 4905 19280 4033 16356 380 - 340 11314 11826 13624 14375 12332 phút phút phút phút phút Capsaicin 10 µg/ml + SP 10-7 340 380 3520 12212 3826 12358 4938 16758 4364 15057 4277 17001 380 - 340 8692 8532 11640 10693 12724 phút phút phút phút phút Capsaicin 100 µg/ml + SP 10-7 340 380 2938 13648 3688 13105 3143 10657 4776 15905 5597 17679 380 - 340 10710 9417 7514 11129 12082 phút phút phút phút phút Capsaicin 1000 µg/ml + SP 10-7 340 380 3482 13857 4383 15891 3356 14227 4343 17532 4084 16338 380 - 340 10375 11508 10871 13189 12254 33 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Bảng 4.11: Bảng giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác SP 10-7 khoảng thời gian khác phút phút phút phút phút Đối chứng SP 10-7 µg/ml 11314 11826 13624 14375 12332 10 µg/ml 8692 8532 11640 10693 12724 380 14688 26749 100 µg/ml 10710 9417 7514 11129 12082 340 3673 5050 1000 µg/ml 10375 11508 10871 13189 12254 380 - 340 11015 21699 Hình 17: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác SP 10-7 khoảng thời gian khác Dựa vào bảng số liệu thu được, đưa SP vào giếng tế bào ủ capsaicin nồng độ khác nhau, capsaicin ức chế SP, không cho SP kích thích thụ thể sản sinh Ca2+ Với capsacin nồng độ µg/ml có khả ức chế SP ổn định Sử dụng phần mềm phân tích Graphpad prism ta tính IC 50 capsacin nồng độ 1µg/ml 0.002072 to 9.376e+006 IC50 capsacin nồng độ 1µg/ml nhỏ IC 50 AP nồng độ 10-6 Với kết ta kết luận, capsacin nồng độ 1µg/ml có khả ức chế SP hiệu so với sử dụng AP Capsaicin chất đối vận thụ thể NK – IV.2 Thảo luận Với kết thu ta kết luận chất capsaicin tách chiết từ ớt chất đối vận, có khả ức chế SP kích thích thụ thể NK – hoạt động hiệu Việc tìm vai trò capsaicin thụ thể NK – giúp phục vụ hoạt động nghiên cứu, điều chế thuốc giảm đau Với thành phần hợp chất tách từ tự nhiên, đảm bảo an toàn y học 34 PHÙNG MINH TUẤN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận a Capsaicin phân tách máy sắc ký lỏng cao áp HPLC có độ tinh khiết 95% b SP nồng độ khác có khả biểu hoạt động thụ thể NK – dòng tế bào lympho c SP nồng độ 10-7 có khả biểu hoạt động thụ thể NK – dòng tế bào lympho mạnh d Capsaicin có hoạt tính sinh học, có khả ức chế SP biểu hoạt động thụ thể NK – dòng tế bào lympho Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu phương pháp sử dụng máy sắc ký lỏng cao áp HPLC để phân tách chất khác thực vật Tiếp tục đánh giá số dịch chiết thực vật thông qua hoạt động thụ thể NK – tế bào lympho Đánh giá trình thay đổi nồng độ Ca 2+ tế bào lympho ủ với dịch chiết hạt tiêu 35