Nghiên cứu sự tác động của capsaicin lên thụ thể neurokinin 1 trên tế bào lympho và tế bào mang vectơ tái tổ hợp NK 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ VĂN CAO NGHIÊN CỨU SỰ TÁC ĐỘNG CỦA CAPSAICIN LÊN THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRÊN TẾ BÀO LYMPHO VÀ TẾ BÀO MANG VECTƠ TÁI TỔ HỢP NK-1 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ VĂN CAO NGHIÊN CỨU SỰ TÁC ĐỘNG CỦA CAPSAICIN LÊN THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRÊN TẾ BÀO LYMPHO VÀ TẾ BÀO MANG VECTƠ TÁI TỔ HỢP NK-1 Chuyên ngành : DI TRUYỀN HỌC Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trịnh Tất Cƣờng PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS.Trịnh Tất Cƣờng, Phòng Sinh học thụ thể phát triển thuốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH QGHN PGS.TS.Đinh Đoàn Long, Khoa Y Dược, ĐH QGHN tận tình, hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện để hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein tạo điều kiện cho thực luận văn khuôn khổ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu tạo protein thụ thể tái tổ hợp để xây dựng mơ hình sàng lọc dược phẩm” (mã số ĐT-PTNTĐ.2011-G/4) Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn thầy giảng viên thuộc Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH QGHN giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cán nghiên cứu Phòng sinh học thụ thể phát triển thuốc ln nhiệt tình giúp đỡ cho tơi lời khun góp ý q báu q trình thực luận văn Cuối tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Lê Văn Cao MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Thụ thể kết cặp G-Protein (GPCR) 1.1.1 Thụ thể GPCR gì? 1.1.2 Chức GPCR biểu nào? 1.1.3 Thụ thể liên kết G-Protein 1.1.4 Phân loại GPCR 1.1.5 Vai trò Sinh lý, Sinh hóa 11 1.2 Thụ thể họ tachykinin thụ thể Neurokinin – 12 1.2.1 Giới thiệu chung Tachykinin 12 1.2.2 Thụ thể neurokinin-1 (NK1R) 13 1.3 Phối tử tác động đích NK1R 16 1.3.1 Chất P (Substance P) hoạt tính chủ vận (agonistic activity) 17 1.3.2 Phối tử đối kháng thụ thể NK1R ứng dụng 20 Aprepitant ứng dụng 22 1.4 Ứng dụng công nghệ GPCR tái tổ hợp nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên 22 1.5 Tế bào lympho 24 1.6 Hoạt chất Capsaicin 25 1.7 Thực vật đƣợc sử dụng nghiên cứu 26 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 29 2.1.1 Vật liệu: 29 2.1.2 Vật liệu thực vật: 29 2.1.3 Hóa Chất 29 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ: 30 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Chiết tách capsaicin từ Hồ tiêu 30 2.2.2 Tách tế bào lymphocyte từ chuột (theo kit Ficoll - Paque Plus) 31 2.2.3 Chuẩn bị đĩa 96 giếng có tế bào CHO biểu NK1 Error! Bookmark not defined 2.2.4 Đo biểu NK1R kit Fura 2AM .32 2.3 Xử lý số liệu 34 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Chiết tách capsaicin từ Hồ tiêu 35 3.1.1 Xây dựng đường chuẩn capsaicin 35 3.1.2 Chiết tách capsaicin .36 3.1.3 Tế bào lympho tách từ máu chuột 39 .39 3.2 Xác định thông số dược lực học chất chủ vận, chất đối vận đặc hiệu 39 3.2.1 Xác định thông số dược lực học tế bào NK1R-CHO .39 3.2.2 Xác định thông số dược lực học tế bào lympho .41 3.3 Đánh giá tương tác Capsaicin với thụ thể NK1 tế bào .43 3.3.1 Đánh giá tương tác Capsaicin với thụ thể NK1 tế bào NK1R tái tổ hợp 43 3.3.2 Đánh giá tương tác Capsaicin với thụ thể NK1 tế bào lympho 44 3.4 Đánh giá tương tác thụ thể NK1R tái tổ hợp với dịch chiết .44 3.5 So sánh kết đường cong kích thích tăng Ca2+ Capsaicin dòng tế bào lympho CHO mang vectơ tái tổ hợp NK1R 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Tài liệu tiếng Việt 51 Tài liệu tiếng Anh 51 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt GPCR G-Protein Coupled receptor Thụ thể kết cặp G-protein NK1R Neurokinin -1 Receptor Thụ thể neurokinin-1 SP Substance P Chất P AP Aprepitant Aprepitant cAMP Cyclic adenosine monophosphate AMP vòng GTP Guanosine-5'-triphosphate Guanosin triphosphat ADP Guanosine 5′-diphosphate Adenosin Diphosphat KDa Kilos Dalton Kilô Dalton AC Adenylate cyclase Enzyme màng Adenylate cyclase 7TM – transmembrane receptor Thụ thể miền xuyên màng CHO Chinese hamster ovary Tế bào buồng trứng chuột Hamster dòng chuột đồng Trung Quốc Dòng tế bào CHO biểu thụ thể CHO-NK1R NK1R EC50(ED50) Median effective concentration, 50% Nồng độ (Liều) hiệu lực 50% IC50 Inhibition concentration, 50% Nồng độ ức chế 50% High-Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Chromatography TACR Tachykinin receptor Thụ thể Tachykinin IFN – γ Interferon Gamma Interferon Gamma Kd Dissociation coefficient Hệ số phân ly Ki Inhibitory coefficient Hệ số ức chế DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc chung thụ thể liên kết vùng xuyên màng Hình 1.2 Sự hoạt hóa G-Protein GPCR Hình 1.3 Con đường truyền tin qua GPCR, cho phép đo biểu chức thụ thể qua chất truyền tin thứ hai (IP3, cAMP, Ca2+) Hình 1.4 Cấu trúc thụ thể bắt cặp với G-Protein Hình 1.5 Phân loại GPCRs 11 Hình 1.6 Cấu trúc thụ thể Neurokinin -1 14 Hình 1.7 Những chức quan trọng thụ thể Neurokinin-1 (NK1R) 15 Hình 1.8 Cấu trúc SP 18 Hình 1.9 Cấu trúc phân tử Aprepitant (AP) 21 Hình 1.10 Cấu trúc phân tử Capsaicin 24 Hình 1.11 Hồ tiêu (Piper nigrum L) 27 Hình 2.1 Cách bố trí phép thử chức thụ thể đĩa 96 giếng 34 Hình 2.2 Nồng độ Ca2+ nội bào tăng tế bào có thụ thể NK1R kích thích chất chủ vận (SP) bị ức chế chất đối kháng (hoặc thuốc thử có tinh đối kháng), đo qua phép thử Fura-2AM (vẽ lại theo Roth [35]).34 Hình 3.1 Sắc ký đồ capsaicin chuẩn 36 Hình 3.2 Đường chuẩn capsaicin 36 Hình 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết tổng số 37 Hình 3.4 Sắc kí đồ chạy phân đoạn HPLC 37 Hình 3.5 Quy trình tách capsaicin từ Hồ tiêu 39 Hình 3.6 Tế bào lympho tách từ máu chuột 39 Hình 3.7 Hoạt tính biểu chức thụ thể NK1R tái tổ hợp 40 Hình 3.8 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dược chất 41 Hình 3.9 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dược chất 41 Hình 3.10 Đường cong chuẩn thay đổi Ca2+ tế bào lympho bị kích thích nồng độ SP khác 42 Hình 3.11 Tín hiệu huỳnh quang tế bào lympho nồng độ AP 43 Hình 3.12 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dược chất 43 Hình 3.13 Đường cong tương tác Capsaicin với tế bào lympho 44 Hình 3.14 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dịch chiết tổng số 45 Hình 3.15 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dịch chiết tổng số 46 Hình 3.16 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dịch chiết tổng số 46 Hình 3.17 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dịch chiết tổng số 47 Hình 3.18 Đường cong đáp ứng theo nồng độ dịch chiết tổng số 47 Hình 3.19 Đường cong kích thích thay đổi Ca2+ dòng tế bào Capsaicin 48 Hình 3.20 Quy trình đánh giá tác động Capsaicin lên thụ thể Neurokinin-1 tái tổ hợp tế bào lympho 49 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ái lực liên kết phối tử thụ thể 12 Bảng 1.2 Ví dụ số hợp chất sản phẩm dược liệu xác định tác động qua thụ thể đích GPCR 22 Bảng 2.1 Các mẫu Hồ tiêu nghiên cứu 29 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch muối A 31 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch muối B 31 Bảng 3.1 Kết định lượng Capsaicin có Hồ tiêu .38 MỞ ĐẦU Việt Nam quốc gia có tính đa dạng sinh học cao giới xếp nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng Với xu ứng dụng công nghệ sinh học góp phần làm thay đổi diện mạo công nông nghiệp y dược học đại, năm gần lĩnh vực y dược phẩm quan tâm khai thác tài nguyên có nguồn gốc từ thiên nhiên Con người tập trung nghiên cứu, khai thác sâu rộng tài nguyên phong phú với nhiều kỹ thuật công nghệ đa dạng, đại [2] Đến nay, việc tiêu chuẩn hóa dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên đòi hỏi cấp bách Muốn vậy, nghiên cứu nhằm xác định chế tác dụng cấp phân tử, phát mục tiêu dược lý phân tử chức sinh học chúng, đồng thời dùng chúng để sàng lọc xác định thành phần có hoạt tính sinh học độc tính dược liệu cần triển khai toàn diện hệ thống [5] Với thụ thể đại phân tử protein, có vị trí phân bố phổ biến màng tế bào Chúng có khả nhận biết gắn đặc hiệu với số phân tử khác gọi chất gắn hay phối tử (ligand) Và phối tử thường nhỏ so với thụ thể, chúng hormone, chất dẫn truyền thần kinh, alcaloid morphin, chất hữu có phân tử nhỏ, thuốc hay số loại ion Mỗi loại thụ thể gắn kết với phối tử mang cấu trúc định có tính đặc hiệu cao [8] Hồ Tiêu (Piper nigrum L) có nhiều ứng dụng thực tế Nó khơng dùng lĩnh vực thực phẩm mà dùng làm thuốc y học cổ truyền Có thể nói, Hồ Tiêu nguyên liệu có chứa thành phần có hoạt tính sinh học có ý nghĩa đời sống [2, 5] Trong chất đó, Capsaicin xem chất có giá trị dược phẩm đáng quan tâm Capsaicin có tác dụng giảm đau, làm giảm chất P (Substance P) neuropeptid chủ yếu tham gia dẫn truyền xung động thần kinh từ ngoại vi tới hệ thống thần kinh trung ương Nếu chất P giải phóng vào tổ chức mơ khớp, hoạt hố chất trung gian phản ứng viêm liên quan đến chế hóa sinh bệnh viêm khớp dạng thấp capsaicin làm cho da khớp cảm giác đau cách làm giảm ngăn ngừa tái tích luỹ lượng chất P tế bào thần kinh cảm giác ngoại vi [4, 7] Vì luận điểm việc nghiên cứu Capsaicin từ Hồ tiêu có ý nghĩa quan trọng Y dược nhằm làm sáng tỏ liệu thụ thể Neurokinin-1 có phải mục tiêu dược lý phân tử Capsaicin chiết tách từ Hồ tiêu hay không, thực đề tài “ Nghiên cứu tác động Capsaicin lên thụ thể Neurokinin-1 tế bào Lympho tế bào mang vectơ tái tổ hợp NK-1” Để đánh giá hoạt tính dược học Capsaicin chất đối vận chủ vận thụ thể neurokinin-1 đánh giá thay đổi nồng độ Ca2+ tế bào, tiến hành nội dung nghiên cứu sau: - Thiết lập quy trình tách chiết Capsaicin từ Hồ tiêu - Thiết lập quy trình đánh giá hoạt tính Capsaicin đối vận hay chủ vận NK1R thay đổi Ca2+ dòng tế bào Lympho từ chuột dòng tế bào mang vectơ chứa NK1R tái tổ hợp - Xác định thông số động lực học phân tử (EC50, IC50, Ki) Capsaicin mơ hình NK1R tự nhiên (tế bào lympho chuột) tái tổ hợp (Tế bào CHO biểu NK1R người) Production Information of Molecular ProbesTM Fura and Indo ratiometric Calcium indicators Revised: 02-Feb-2011 59 Thông tin mẫu Mẫu thực vật: PN 9701.4 đen) Nơi thu mẫu: Hòa Bình Kon Tum 108°58'37"E Dịch chiết: ethanol Phương pháp đo Loài: Piper nigrum L (Hồ tiêu Tọa độ GPS: 14°15'08"N - - Áp dụng quy trình NIMH-PDSP [1] - Vật liệu: đĩa 96 giếng, tế bào CHO biểu NK1 tái tổ hợp (CHO-NK1R) với mật độ 0.5 – 0.6 x 105 tế bào/ giếng - Ký thuật đo: xác định nồng độ Ca2+ nội bào kit Fura-2AM (Molecular Probes (Life Technologies Inc., Singapore) [2] - Đo bước sóng 340 nm 390 nm máy Plate CHAMELEON Multilabel Microplate Reader sử dụng chế độ đo Kinetic phần mềm MicroWin (Hidex, Turku, Phần Lan) - Đường cong liều đáp ứng số IC50 xác định phần mềm GraphPad Prism 6.05 (GraphPad Software, Inc) Kết phân tích Bảng Số liệu tín hiệu huỳnh quang thu (tính Đường cong đáp ứng theo theo %) nồng độ dịch chiết thử khác nồng độ dịch chiết tổng số Nồng độ (µg/ml) 0.01 0.1 10 100 1000 Đo lần Đo lần Đo lần 104.35 86.79 108.87 - 91.78 91.65 72.45 88.95 99.85 58.29 - 79.03 62.89 69.20 80.96 37.58 35.60 49.28 -10.73 5.71 5.03 Thông số động học đo đƣợc: = 26.3 ± 1.26 (µg/ml) Tài liệu áp dụng IC quy50 trình: 60 Ki = 1.79 µg/ml Roth BL.Receptor assay protocols National Institute of Mental Health - Psychoactive Drug Screening Program (NIMH-PDSP) (2013) Production Information of Molecular ProbesTM Fura and Indo ratiometric Calcium indicators Revised: 02-Feb-2011 61 Thông tin mẫu Mẫu thực vật: PN 9701.5 đen) Nơi thu mẫu: Chư Xê Gia Lai Dịch chiết: ethanol Phương pháp đo Loài: Piper nigrum L (Hồ tiêu Tọa độ: 13°29'36"N - 108°10'56"E - Áp dụng quy trình NIMH-PDSP [1] - Vật liệu: đĩa 96 giếng, tế bào CHO biểu NK1 tái tổ hợp (CHO-NK1R) với mật độ 0.5 – 0.6 x 105 tế bào/ giếng - Ký thuật đo: xác định nồng độ Ca2+ nội bào kit Fura-2AM (Molecular Probes (Life Technologies Inc., Singapore) [2] - Đo bước sóng 340 nm 390 nm máy Plate CHAMELEON Multilabel Microplate Reader sử dụng chế độ đo Kinetic phần mềm MicroWin (Hidex, Turku, Phần Lan) - Đường cong liều đáp ứng số IC50 xác định phần mềm GraphPad Prism 6.05 (GraphPad Software, Inc) Kết phân tích Bảng Số liệu tín hiệu huỳnh quang thu Đường cong đáp ứng theo (tính theo %) nồng độ dịch chiết thử khác nồng độ dịch chiết tổng số Nồng độ (µg/ml) 0.01 0.1 10 100 1000 Đo lần Đo lần Đo lần 104.35 97.69 72.52 69.60 5.46 86.79 84.81 90.64 71.49 58.64 -4.39 108.87 86.79 83.23 61.94 63.92 -1.07 Thông số động học đo đƣợc: = 35.5 ± 2.10 (µg/ml) Tài liệu áp dụng IC quy50 trình: Ki = 2.41 µg/ml Roth BL.Receptor assay protocols National Institute of Mental Health - Psychoactive Drug Screening Program (NIMH-PDSP) (2013) Production Information of Molecular ProbesTM Fura and Indo ratiometric Calcium indicators Revised: 02-Feb-2011 62 Thông tin mẫu Mẫu dược chất: Aprepitant Nguồn gốc: mua từ Sigma Aldrich (I0320301) Phương pháp đo - Áp dụng quy trình NIMH-PDSP [1] - Vật liệu: đĩa 96 giếng, tế bào CHO biểu NK1 tái tổ hợp (CHO-NK1R) với mật độ 0.5 – 0.6 x 105 tế bào/ giếng - Ký thuật đo: xác định nồng độ Ca2+ nội bào kit Fura-2AM (Molecular Probes (Life Technologies Inc., Singapore) [2] - Đo bước sóng 340 nm 390 nm máy Plate CHAMELEON Multilabel Microplate Reader sử dụng chế độ đo Kinetic phần mềm MicroWin (Hidex, Turku, Phần Lan) - Đường cong liều đáp ứng số IC50 xác định phần mềm GraphPad Prism 6.05 (GraphPad Software, Inc) Kết phân tích Bảng Số liệu tín hiệu huỳnh quang thu Đường cong đáp ứng theo nồng (tính theo %) nồng độ dược chất khác độ dược chất Đo lần 2.25 2.24 2.15 1.76 1.44 1.91 1.29 1.48 Đo lần 2.48 2.17 1.68 1.61 1.44 1.62 1.55 1.13 Đo lần 2.16 2.54 2.14 2.07 1.68 1.43 1.02 1.47 R e la tiv e F lu o r e s c e n c e U n it s (F o ld ) Nồng độ (µg/ml) 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 -1 -1 1 -1 -9 -8 -7 [ A p r e p it a n t ] , M Thông số động học đo đƣợc: Tài liệu áp dụng IC quy50 trình: = 41.1  0.99 (µM) Ki = 41.1 µM Roth BL.Receptor assay protocols National Institute of Mental Health - Psychoactive Drug Screening Program (NIMH-PDSP) (2013) Production Information of Molecular ProbesTM Fura and Indo ratiometric Calcium indicators Revised: 02-Feb-2011 Thông tin mẫu Mẫu dược chất: Substance P 63 -6 -5 Nguồn gốc: Sigma Aldrich (S6883) Phương pháp đo - Áp dụng quy trình NIMH-PDSP [1] - Vật liệu: đĩa 96 giếng, tế bào CHO biểu NK1 tái tổ hợp (CHO-NK1R) với mật độ 0.5 – 0.6 x 105 tế bào/ giếng - Ký thuật đo: xác định nồng độ Ca2+ nội bào kit Fura-2AM (Molecular Probes (Life Technologies Inc., Singapore) [2] - Đo bước sóng 340 nm 390 nm máy Plate CHAMELEON Nồng độ (µg/ml) 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Đo lần Đo lần Đo lần 1.73 1.60 1.83 2.40 2.59 2.95 3.42 - 1.38 1.59 2.19 1.81 2.20 2.83 3.28 2.97 1.86 1.97 2.10 2.27 2.530 3.11 3.13 3.25 R e la tiv e F lu o r e s c e n c e U n it s (F o ld ) Multilabel Microplate Reader sử dụng chế độ đo Kinetic phần mềm MicroWin (Hidex, Turku, Phần Lan) - Đường cong liều đáp ứng số IC50 xác định phần mềm GraphPad Prism 6.05 (GraphPad Software, Inc) Kết phân tích Bảng Số liệu tín hiệu huỳnh quang thu Đường cong đáp ứng theo nồng (tính theo %) nồng độ dược chất khác độ dược chất 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 -1 -1 1 -1 -9 -8 -7 [S u b ta n ce P ], M Thông số động học đo đƣợc: Tài liệu áp dụng IC quy50 trình: = 7.3  1.24 (µM) Ki = 7.3 µM Roth BL.Receptor assay protocols National Institute of Mental Health - Psychoactive Drug Screening Program (NIMH-PDSP) (2013) Production Information of Molecular ProbesTM Fura and Indo ratiometric Calcium indicators Revised: 02-Feb-2011 Thông tin mẫu Mẫu dược chất: Capsaicin 64 -6 -5 Nguồn gốc: tách từ Piper nigrum L (Tên tiếng Việt: Hồ tiêu đen) Phương pháp đo - Áp dụng quy trình NIMH-PDSP [1] - Vật liệu: đĩa 96 giếng, tế bào CHO biểu NK1 tái tổ hợp (CHO-NK1R) với mật độ 0.5 – 0.6 x 105 tế bào/ giếng - Ký thuật đo: xác định nồng độ Ca2+ nội bào kit Fura-2AM (Molecular Probes (Life Technologies Inc., Singapore) [2] - Đo bước sóng 340 nm 390 nm máy Plate CHAMELEON Multilabel Microplate Reader sử dụng chế độ đo Kinetic phần mềm MicroWin (Hidex, Turku, Phần Lan) - Đường cong liều đáp ứng số IC50 xác định phần mềm GraphPad Prism 6.05 (GraphPad Software, Inc) Kết phân tích Bảng Số liệu tín hiệu huỳnh quang thu Đường cong đáp ứng theo nồng (tính theo %) nồng độ dược chất khác độ dược chất Nồng độ (µg/ml) -9 10 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 Đo lần 91.95 106.32 105.17 85.06 22.41 3.45 8.05 Đo lần Đo lần 112.64 102.87 125.29 132.76 68.97 22.41 10.34 13.79 101.15 97.13 106.32 117.24 71.84 24.14 2.30 -21.84 Thơng số động học đo đƣợc: Ki = 0.16 µM = 2.32 ± 0.15 (µM) Tài liệu áp dụng IC quy50 trình: Roth BL.Receptor assay protocols National Institute of Mental Health - Psychoactive Drug Screening Program (NIMH-PDSP) (2013) Production Information of Molecular ProbesTM Fura and Indo ratiometric Calcium indicators Revised: 02-Feb-2011 65 Mẫu tiêu PN 9701.1 (Piper nigrum L – Hồ tiêu đen) 66 Mẫu tiêu PN 9701.2 (Piper nigrum L – Hồ tiêu đen) Mẫu tiêu PN 9701.3 (Piper nigrum L – Hồ tiêu đen) 67 68 Thông tin mẫu Capsaicin thu từ dịch chiết tổng cộng mẫu PN 9701.1 thuộc loài Piper nigrum L (Hồ tiêu đen) Phương pháp đo - Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với máy HPLC Ultimate 3000 - Chất chuẩn: Capsaicin Sigma-Mỹ cung cấp Cột C18 đảo pha Pha động: Ethanol: acid phosphoric = 70:30, nhiệt độ cột 25ºC Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút Đầu dò UV: UV=280 nm Lượng bơm mẫu: µl Kết phân tích sắc kí đồ mAU 280nm,4nm (1.00) 1000 750 500 250 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 Hàm lượng mẫu (%) 0.139 0.171 0.117 0.14 ± 0.013 Đo lần Đo lần Đo lần Giá trị trung bình ± sai số chuẩn 69 25.0 Thông tin mẫu Capsaicin thu từ dịch chiết tổng cộng mẫu PN 9701.2 thuộc loài Piper nigrum L (Hồ tiêu đen) Phương pháp đo - Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với máy HPLC Ultimate 3000 - Chất chuẩn: Capsaicin Sigma-Mỹ cung cấp Cột C18 đảo pha Pha động: Ethanol: acid phosphoric = 70:30, nhiệt độ cột 25ºC Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút Đầu dò UV: UV=280 nm Lượng bơm mẫu: µl Kết phân tích sắc kí đồ mAU 280nm,4nm (1.00) 1250 1000 750 500 250 0.0 5.0 10.0 15.0 Đo lần Đo lần Đo lần Giá trị trung bình ± sai số chuẩn 70 20.0 25.0 Hàm lượng mẫu (%) 0.189 0.177 0.197 0.19 ± 0.005 Thông tin mẫu Capsaicin thu từ dịch chiết tổng cộng mẫu PN 9701.3 thuộc loài Piper nigrum L (Hồ tiêu đen) Phương pháp đo - Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với máy HPLC Ultimate 3000 - Chất chuẩn: Capsaicin Sigma-Mỹ cung cấp Cột C18 đảo pha Pha động: Ethanol: acid phosphoric = 70:30, nhiệt độ cột 25ºC Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút Đầu dò UV: UV=280 nm Lượng bơm mẫu: µl Kết phân tích sắc kí đồ mAU 280nm,4nm (1.00) 750 500 250 0.0 5.0 10.0 15.0 Đo lần Đo lần Đo lần Giá trị trung bình ± sai số chuẩn 71 20.0 25.0 Hàm lượng mẫu (%) 0.235 0.230 0.260 0.24 ± 0.008 Thông tin mẫu Capsaicin thu từ dịch chiết tổng cộng mẫu PN 9701.4 thuộc loài Piper nigrum L (Hồ tiêu đen) Phương pháp đo - Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với máy HPLC Ultimate 3000 - Chất chuẩn: Capsaicin Sigma-Mỹ cung cấp Cột C18 đảo pha Pha động: Ethanol: acid phosphoric = 70:30, nhiệt độ cột 25ºC Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút Đầu dò UV: UV=280 nm Lượng bơm mẫu: µl Kết phân tích sắc kí đồ mAU 700 280nm,4nm (1.00) 600 500 400 300 200 100 -100 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 Đo lần Đo lần Đo lần Giá trị trung bình ± sai số chuẩn 25.0 30.0 35.0 Hàm lượng mẫu (%) 0.220 0.267 0.183 0.22 ± 0.020 Thông tin mẫu Capsaicin thu từ dịch chiết tổng cộng mẫu PN 9701.5 thuộc loài Piper nigrum L (Hồ tiêu đen) Phương pháp đo - Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với máy HPLC Ultimate 3000 - Chất chuẩn: Capsaicin Sigma-Mỹ cung cấp 72 Cột C18 đảo pha Pha động: Ethanol: acid phosphoric = 70:30, nhiệt độ cột 25ºC Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút Đầu dò UV: UV=280 nm Lượng bơm mẫu: µl Kết phân tích sắc kí đồ 700 mAU 280nm,4nm (1.00) 600 500 400 300 200 100 -100 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Hàm lượng mẫu (%) Đo lần Đo lần Đo lần Giá trị trung bình ± sai số chuẩn 73 0.218 0.245 0.197 0.22 ± 0.011 ... NHIÊN LÊ VĂN CAO NGHIÊN CỨU SỰ TÁC ĐỘNG CỦA CAPSAICIN LÊN THỤ THỂ NEUROKININ- 1 TRÊN TẾ BÀO LYMPHO VÀ TẾ BÀO MANG VECTƠ TÁI TỔ HỢP NK -1 Chuyên ngành : DI TRUYỀN HỌC Mã số : 6042 012 1 LUẬN VĂN THẠC... tương tác Capsaicin với thụ thể NK1 tế bào NK1 R tái tổ hợp 43 3.3.2 Đánh giá tương tác Capsaicin với thụ thể NK1 tế bào lympho 44 3.4 Đánh giá tương tác thụ thể NK1 R tái. .. dược lý phân tử Capsaicin chiết tách từ Hồ tiêu hay không, thực đề tài “ Nghiên cứu tác động Capsaicin lên thụ thể Neurokinin- 1 tế bào Lympho tế bào mang vectơ tái tổ hợp NK -1 Để đánh giá hoạt