1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, con người có xu hướng ưở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việc sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh. Lý do đơn giản là con người đã hiểu được mặt ưái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những chất này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng những chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá... Việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi. Để khắc phục được tĩnh trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi và thủy sản. 2 1.2. MỤC ĐÍCH Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtiỉis và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng thủy sản. 1.3. YÊU CẦU 1.3.1. Đối với Bacillus subtìlis s Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và amylase nhiều nhất. s Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis . v'' Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. 1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus s Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. s Tim môi trường nhân giống thích họp cho sinh khối và độ chua cao nhất. s Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, s Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.
1 Phần M Ở ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, người có xu hướng ưở dần với tính chất thiên nhiên thông qua việc sử dụng số chất có hoạt tính sinh học hay phương pháp sinh học để ứng dụng công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường để chữa bệnh Lý đơn giản người hiểu mặt ưái sử dụng chất hóa học, chất kháng sinh Những chất có hiệu nhanh chóng hậu mà mang lại lớn Trong chăn nuôi nuôi trồng thủy sản trước người ta thường dùng chất kháng sinh để phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm tôm, cá Việc sử dụng kháng sinh m ột thời gian dài để lại nhiều hậu không mong muốn kháng thuốc vi khuẩn rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng dẫn đến khó điều trị Nghiêm trọng tồn dư kháng sinh thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại lớn chăn nuôi Để khắc phục tĩnh trạng này, nhà khoa học nghiên cứu sử dụng trực tiếp vi sinh vật sống, có lợi thường gọi “probiotic” Kết chứng minh lợi ích vi khuẩn có lợi việc phòng điều trị số bệnh chăn nuôi, thủy sản cho người Điều quan trọng không để lại hậu hay di chứng sử dụng loại hóa chất thuốc kháng sinh Xuất phát từ vấn đề tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ chăn nuôi thủy sản 1.2 MỤC ĐÍCH Xác định môi trường tối ưu vi khuẩn Bacillus subtiỉis Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi thú y nuôi trồng thủy sản 1.3 YÊU CẦU 1.3.1 Đối với Bacillus subtìlis s Thực việc nuôi cấy Bacillus subtilis nhiều loại môi trường khác để xác định xem môi trường làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease amylase nhiều s Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis v' Kiểm tra chất lượng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản 1.3.2 Đối với Lactobacillus acidophilus s Phân lập từ chế phẩm Antibio Hàn Quốc sản xuất s Tim môi trường nhân giống thích họp cho sinh khối độ chua cao s Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, s Kiểm tra chất lượng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản Phần TỒNG QUAN 2.1« ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1 Lịch sử Baciĩĩus subtỉỉừ phát lần phân ngựa vào năm 1941 tổ chức ỵ học N arỉ Đức Lúc đầu chủ yếu sử dụng để phòng bệnh lị cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi N ăm 1949 - 1957 Henry cộng tách chủng khiết Bacỉĩỉus subtỉlis Từ “Subtilistherapie” có nghĩa thuốc subtilin đời trị chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy rối loạn tiêu hóa 2.1.2 Phân loại đặc điểm 2.1.2.1 Phân loại Theo khóa phân loại Bergey vi khuẩn BacỉUus subtilỉs thuộc: Bộ: Eubacteriaỉes Họ: Bacỉỉỉaceae Giống: Baciỉỉus Loài: Baciỉlus subtỉlis 2.1.2.2 Đặc điểm Vi khuẩn Baciĩỉus subtỉỉỉs trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương (G+), kích thước 0,5 - 0,8 pm X 1,8 - pm Đủng thành Hình 2.1 Vi khuẩn Bacỉỉĩus subtiĩis chuỗi ngắn đơn lẻ, dỉ động, sinh bào tử nhỏ tế bào vỉ khuẩn nằm tế bào, kích thước bào tử 0,8 -1 ,8 ịim Phảt triển cách nảy chồi nứt bào tử Chúng loại vỉ sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng 36 - 50°c, tối đa khoảng 60°c, bào tử chịu nhiệt cao Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển Baciỉỉuss subtiỉừ 10 - 15% (Lương Đức Phẩm, 2000) Chúng phân bố rộng rãi ngoại cảnh, bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây) M ột đặc điểm dùng để phân biệt với vỉ khuẩn khác làm tan chảy gelatỉne nhanh chóng Sữa cấy Baciỉỉus subtìỉừ trước tiên sau cấy m en lactỉc trở nên acỉd nhanh chóng sữa cấy m en lactic Vi khuẩn tác động protease làm hình thành paraproteỉn từ caseỉn, sữa cấy Bacỉỉỉus subtiỉis bị kết tủa khỉ cho vào clorua calcỉ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) Khi nuôi cấy môi trường thạch đĩa Bacillus subtiỉis có khuẩn lạc tròn, không hay phân tán Đường kính khuẩn lạc - mm, phát triển chậm, màu vàng xám sậm màu, rìa có cưa Sau - ngày bề m ặt nhãn nheo, màu nâu Trong m ôi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạo thành màng nhãn bề mặt, lắng cặn, không tạo nhớt Bacillus subtilis cho m ột số phản ứng sinh hóa: • Lên men không sinh loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose • Indol (-), VP (+), nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casern (+), citrat (+), có khả di động hiếu khí 2.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC Theo hệ thống phân loại Bergey năm 1979 thi vi khuẩn lactic phân loại sau: Họ: Lactobacteriaceae Họ phụ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Leuconostoc Họ phụ: Lactobacteriaceae Giống: Lactobacterỉum 2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 2.2.1.1 Lịch sử Lactobacillus acidophilus lần phân lập Moro (1900) từ phân trẻ sơ sinh qua phẫu thuật Ông mô tả đặc điểm trao đổi chất, phân loại chức vi khuẩn Năm 1906 Metchnikoff xuất “The prolongation o f life optinistic studies” Ông chứng minh ràng vi khuẩn lactic yoghurt bulgarian nhân tố chống lại thối rữa ruột lão hóa Tuy nhiên sau người ta khám phá chủng vi khuẩn sống sót qua dày ruột Do người ta nhanh chóng thay chủng vi khuẩn chủng L acidophilus probiotic ruột Họ thấy có nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình dị hình sống ruột, miệng âm đạo chiếm ưu số loài Lactobacillus lên men đồng hĩnh tạo thành nhóm gọi phức họp Lactobacillus acidophilus 2.2.1.2, Đặc điểm Lactobacillus acidophỉlus thuộc họ vi khuẩn lactic Chúng có dạng trực khuẩn dài chịu nhiệt Tế bào hình que, đầu tròn, kích thước 0,6 - 0,9 X , - pm đứng riềng rẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, tế bào non bắt m àu Gram dương Hình 2.2 Lactobacillus acidophilus nhuộm, tế bào già trở thành Gram âm V i hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 37°c, không phát triển 20 - 22°c 43 - 48°c Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm m en khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ dày đục mép Trong m ôi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ có hình dạng không ổn định Trên m ôi trường thạch nghiêng khuẩn lạc khô, phát triển giới hạn theo vết cấy Lên m en lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acỉd lactỉc m ôi trường, không phát triển m ôi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt m ôi trường dịch thề cao nấm men L acidophilus m ột dạng probỉotic sử dụng thường xuyên Là vỉ khuẩn có lợi cư trú một, âm đạo, phân người động vật Chúng có khả sinh Bacteriocin chất có hoạt tính ức chế vỉ khuẩn gây bệnh đường L acidophỉlus có khả lên m en loại đường: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose không lên m en xyỉose, arabinose, ramnose, glycerol, mannitol, sorbitol, ỉnositol Cho phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate (-), catalase (-), khả đông vón sữa (+) 2.2.1.3 Quá trình ừao đổi chất Hiện thành viên phức hợp Lactobacillus acidophiỉus phân vào nhóm lên m en đồng hình bắt buộc Hexose lên men để tạo thành acỉd lactic theo đường EMP Chúng có enzyme aldolase thiếu phosphoketolase, không lên men gluconat pentose Tất loài tạo đồng phân dạng D L acỉd lactic (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004) 2.2.1.4 Sự thay đổi thành phần sữa trình lên men Trong trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có thay đổi sâu sắc loại đường, casein thành phần khác • Sự thay đổi đường sữa Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa lactose thành glucose galactose Lactase m ột endoenzyme nên lactose muốn chuyển hóa thi phải qua màng vi khuẩn Lactose chuyển hóa theo hai đường: > Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H2 chuyển lactose thành glucose galactose > Lactose oxi hóa thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionat sau phân giải tiếp thành gluconat galactose qua giai đoạn diễn biến phức tạp, giai đoạn enzyme chuyên biệt phụ trách • Sự thay đổi protein sữa Trong trình lên men, lượng acid hữu loại tích lũy làm tăng trình tách calci khỏi casein tạo pH đẳng điện Do đó, casein bị vón lại làm tăng trình lên men tạo pepton sản phẩm khác Con đường chuyển hóa chủ yếu trình lên men sữa Lactose glucose galactose ATP ADP ATP ADP Glucose-6 phosphat Fructose-6 phosphat Fructose-1,6 phosphat Glyceraldehyd-3 phosphat NAD+ NADH Dihydroxyaceton phosphat 1(3 diphosphoglycerat ADP ATP +2H acid pyruvic +2H acid malic +C02 Aldehyd acetic citric acid lactic -C Acetyl- CoA Chu trình acid citric Rượu etylic acid propionic malic 2.2.2 ứng dụng vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược nhiều chế biến bảo quản thực phẩm 2.2.2.1 Trong công nghiệp Vi khuẩn lactic sử dụng để lên men thu acid lactic Có vị chua dễ chịu có đặc tính bảo quản nên làm gia vị loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng dùng để acid hóa rượu vang hoa nghèo acid, sử dụng công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn chất dẻo 2.2.2.2 Trong nông nghiệp môi trường Vi khuẩn lactic có khả hạn chế phát triển Fusarium loại nấm gây bệnh quan trọng nông nghiệp Nấm Fusarium phát triển làm yếu hội gây bệnh cho trồng Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh có góp phần vi khuẩn lactic Hiệu chế phẩm cải tạo đất, tăng suất trồng giải vấn đề ô nhiễm môi trường 2.2.2.3 Trong y dược Vi khuẩn lactic sử dụng y học để chữa bệnh đường ruột, dùng phẫu thuật chỉnh hĩnh, nha khoa, bệnh phụ khoa 2.2.2.4 Trong bảo quản chế biến thực phẩm Trong bảo quản chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic sử dụng để làm dưa chua, làm chua mà không làm m ất màu tự nhiên Dùng sản xuất tương, đậu phụ hay lên men sữa chua 2.3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI SINH VẬT Trong trình nuôi cấy vi sinh vật thi môi trường lên men phải có chứa đầy đủ thành phần sau (Lê Xuân Phương, 2001) Glucỉd: Là nguồn dinh dưỡng quan trọng để vi sinh vật thực trình trao đổi chất xây dựng đổi mới, glucid đóng vai trò chủ chốt việc tạo lượng cho tế bào Glucid thường sử dụng dạng dịch chiết có đường, mật rỉ, tinh bột (phải thủy phân thảnh đường trước lên men) Phosphat vô CO" Đóng vai ưò quan trọng trao đổi lượng tổng họp acid nucleic Trong lên men muối phosphat vô dùng phổ biến phosphat amon phosphat kali Niter Tham gia vào trình tạo protein, acid nucleic chất có đặc tính sinh học khác tế bào vi sinh vật Nitơ thường sử dụng lên men dạng muối nitrat, họp chất amon số chất có nguồn gốc vi sinh vật Các chất sinh trưởns nguyên tố vi ỉưong: Vitamin nguyên tố vi lượng chất cần thiết cho hoạt động sống vi sinh vật Chúng thường sử dụng với lượng nhỏ tác dụng lớn đa dạng thiếu hoạt động sống bình thường vi sinh vật 2.3.1 Đối với Bacillus subtìlis 2.3.1.1 Tuyển chọn vi sinh vật có khả sinh enzyme cao Không phải tất vi sinh vật có khả sinh enzyme chủng giống không hoạt tính sinh tổng họp enzyme Vĩ tuyển chọn vi sinh vật phải tiến hành tìm kiếm, phân lập lựa chọn hàng chục, hàng trăm giống vi sinh vật để có chủng có hoạt độ cao việc tạo thành enzyme cần thiết Người ta thấy ràng enzyme thu nhận từ vi khuẩn có nhiệt độ tối ưu khả chịu nhiệt cao enzyme thu nhận từ nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 1998) Trong đất có nhiều bào tử tế bào vi sinh vật số người ta nhận thấy vi khuẩn Bacillus subtilis có khả tổng họp enzyme a-amylase protease 2.3.1.2 Nguyên liệu để sản xuất enzyme a-amylase từ vi khuẩn Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm Vi sinh vật không đòi hỏi khắc khe yếu tố dinh dưỡng môi trường vi sinh vật tổng họp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận a-amylase dùng tinh bột, maltose, saccarose, glucose glycerin Ngoài người ta cho thêm acid amin dạng phức hợp riêng chất (pepton, protein thủy phân dịch chiết mầm mạch, acid amin ) Neu môi trường có C aC 03 làm tác nhân điều chỉnh pH pepton thi a-amylase tổng họp gấp hai lần Trong phân tử gam a-amylase Bacillus subtỉlỉs có 4g nguyên tử calci Trong thành phần dinh dưỡng ion Ca có tác dụng nâng cao khả tổng họp a-amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme protease (Lương Đức Phẩm, 1998) Trong môi trường dinh dưỡng vi sinh vật sinh enzyme nói chung cần phải có mặt nguyên tố khoáng dạng muối magie, phospho, kali, ion mangan, kẽm, nguyên tố vi lượng khác Nồng độ thích họp để tổng họp a-amylase MnSCL 0,05% Thiếu muối a-amylase không hĩnh thành Hoạt độ a-amylase nâng cao nồng độ KH2P 1% Ion Mg2+ có tác dụng ổn định amylase nhiệt độ cao Lưu huỳnh có tác dụng đến sinh tổng họp a-amylase Các nguồn lưu huỳnh acid amin (methionin, sistein, sistin) muối sunfat (trừ sunfat đồng), nguồn lưu huỳnh tốt methionin 10 2.3.1.3 Nguyên liệu để sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh protease thi cần phải có chất cảm ứng, nguồn nitơ hữu (bột ngô, bột đậu tương, bột mĩ, cám mĩ, mầm mạch, dịch chiết nấm men, pepton, protein ) Vi khuẩn Bacillus subtilis tổng họp protease có hoạt độ cao môi trường có tinh bột, giảm nồng độ tinh bột từ - 2% thi hoạt độ protease giảm vài lần Ngoài nguồn nitơ hữu thi nguồn nitơ vô ảnh hưởng đến khả tổng họp protease HNO3, HNO2 Trong số nguồn nitơ vô ta thấy có phosphat amon dibazic tốt Những muối khác NH4CI, (NH4)2S 4, NH4N 3, N aN 3, K N 03, C a(N 03)2 làm giảm hoạt độ protease tới 30 - 50% a-amylase giảm tới - lần Trong môi trường có nguồn nitơ hữu thi hoạt độ protease amylase thấp môi trường đối chứng có (NH4)2H P nước chiết đậu tương (Lương Đức Phẩm, 1998) Các acid amin ức chế đến tổng họp enzyme protease Bacillus subtỉlỉs methionin, acid glutamic, alanin, leucin 2.3.1.4 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có khả sinh enzyme Phưcms pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường Môi trường sử dụng môi trường lỏng sử dụng môi trường đặc (môi trường bán rắn) Môi trường lỏng vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng pha khí Vi sinh vật sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành trình tổng họp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Ở môi trường đặc để tăng khả xâm nhập không khí vào lòng môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Vi sinh vật phát triển trcn bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường sinh tổng họp enzyme nội bào ngoại bào Độ ẩm thích họp môi trường đặc 55 - 65% Ưu điểm phương pháp bề mặt dễ thực bị nhiễm vi sinh vật lạ thường xảy tượng nhiễm cục vĩ ta dễ dàng xử lý Nhưng nhược điểm tốn nhiều diện tích khó giới hóa, tự động hóa Phưonsphảp nuôi cấy chìm Phương pháp người ta sử dụng môi trường lỏng thực thùng lên men Trong thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống 36 Phần KỂT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐỐI VỚI BACILLUS SUBTILIS 4.1.1 Kết khả tăng sinh khối enzyme Bacillus subtilis môi trường nhân giống cấp Sau nuôi cấy loại môi trường Edward, Fragie, pepton-gelatin, Nomura rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột thời gian 48 nhiệt độ phòng, pH = tiến hành theo dõi tiêu số lượng, khả sinh enzyme amylase, protease với kết sau 4.1.1.1 Khả tăng sinh khối Bảng 4.1 Số lượng tế bào Bacillus subtiỉis loại môi trường nhân giống cấp M ôi Trường Lặp lại (n) X ( x i o 10cfu/g) SD Cv% Edward Fragie Nomura pepton- Rỉ đường + gelatin 2% tỉnh bột 3 3 l,5667a l,3600b l,4267b 0,4537c l,9200d 0,21455 0,391 0,411 0,0773 0,2455 13,69 28,78 28,83 17,05 12,78 G h i c h ủ : C h ữ a, b , c, d ch ỉ k h c b iệ t v ê m ặ t th ô n g k ê g iữ a tù n g lo i m ô i trư n g Qua bảng 4.1 nhận thấy số lượng tế bào trung bĩnh môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tỉnh bột cao mức 1,92 x io 10 cfu/ml Kết xử lý thống kê cho thấy có khác biệt loại môi trường có ý nghĩa (P < 0,01) 4.1.1.2 Khả sinh enzyme amylase protease Sau 48 nuôi nhiệt phòng tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bàng phương pháp Wolhgemuth enzyme protease bàng phương pháp Gross + Fuld Ket ghi nhận môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột có khả cho hoạt độ enzyme amylase cao 256 Wo/ml protease 128 Hđp/ml Qua xử lý thống kê nhận thấy có khác biệt môi trường có ý nghĩa (P < 0,001) Ket khảo sát trĩnh bày bảng 4.2 37 Bảng 4.2 Hoạt độ enzyme amylase protease loại môi trường nhân giống cấp Môi trường Edward Fragie Nomura Amylase Protease Rỉ đường + gelatin 2% tinh bột Lặp lại (n) 3 3 X (W0/ml) 8a 16b 26,67c 10,67a 256d SD 0 9,2376 4,6188 Cv% 0 34,63 43,28 Lặp lại (n) 3 3 X (Hđp/ml) 8a 13,33b 16b 32c Koỉ Ò Enzyme pepton- SD 4,6188 0 Cv% 34,64 0 Đối chứng (+) có enzyme: dung dịch màu xanh Đối chứng (-) enzyme: dung dịch có màu xanh 38 % I 16 1 32 64 128 1 256 512 1024 Hĩnh 4.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Gross + Fuld Đối chứng (+) có enzyme: dung dịch Đối chứng (-) enzyme: dung dịch đục có kết tủa ừắng Qua kết khảo sát số lượng tế bào/ml, hoạt độ enzyme amylase, protease môi trường nhân giống cấp Chúng nhận thấy môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột môi trường tối ưu loại môi trường khảo sát Từ định chọn môi trường môi trường nhân giống cấp thích họp để sử dụng cho môi trường nhân giống cấp 4.1.2 Kết khả tăng sinh khối enzyme Bacillus subtilis môi trường nhân giống cấp Sau chọn môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột môi trường nhân giống cấp tối ưu tiến hành tìm môi trường nhân giống cấp Thí nghiệm bố trí ưên loại môi trường m tự tổng họp ký hiệu A, B, c, D, E (thành phần môi trường xem chi tiết mục 1.11 phần phụ lục) Lượng giống bổ sung vào 10%, pH = Sau thời gian nuôi 72 nhiệt độ phòng bắt đầu thu hoạch kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase, protease loại môi trường Ket ghi nhận bảng 4.3 4.4 39 4.1.2.1 Khả tăng sinh khối Bảng 4.3 Số lượng tế bào B subtilis loại môi trường nhân giống cấp A B c D E 3 3 345,67a 155,33b l,368c 13,26c 12,74c 126,595 55,229 1,362 1,623 2,619 36,62 35,55 11,98 12,24 20,56 Môi Trường Lặp lại (n) X (xio10cfu/g) SD Cv% Qua bảng 4.3 nhận thấy m ôi trường A cho số lượng tế bào cao 345,67x1010 cfu/g Qua xử lý thống kê cho thấy có khác biệt môi trường có ý nghĩa (P < 0,001) Giữa môi trường c, D, E thi không thấy có khác biệt số lượng tế bào /gam Hình 4.3 Kiểm ừa số lượng vi khuẩn B subtiỉis ừên môi trường A 40 4.1.2.2 Khả sinh enzyme amylase protease Sau 72 nuôi nhiệt độ phòng kiểm tra hoạt độ enzyme amylase protease loại môi trường nhân giống cấp Ket ghi nhận bảng 4.4 Bảng 4.4 Hoạt độ enzyme amylase protease môi trường nhân giống cấp Qua bảng 4.4 nhận thấy hoạt độ enzyme amylase protease cao môi trường A B Qua kết xử lý thống kê cho thấy có khác biệt loại môi trường lên khả tạo enzyme Bacillus subtiỉis có ý nghĩa (P < 0,05) Sau khảo sát nhận thấy môi trường A B thi có tương đồng khả sinh enzyme amylase protease Tuy nhiên xét đến khả tạo sinh khối môi trường A môi trường tối ưu Từ kết khảo sát số lượng hoạt độ enzyme môi trường A, B, c , D E Chúng định chọn môi trường A làm môi trường sản xuất thích họp để sản xuất chế phẩm chứa B subtiỉis 41 A ' ' B Hình 4.4 Sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis{ màu trắng) môi truờng A B 4.1.3 Kết kiểm tra số lượng B subtilis hoạt độ enzyme sau sản xuất chế phẩm Sau chọn môi trường A môi trường nhân giống cấp tối ưu tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Bacillus subtiỉis Cách thực giống thí nghiệm 3.3.1.2 Lượng giống sử dụng 10% tiến hành nuôi nhiệt độ phòng, pH = Sau thu hoạch tiến hành sấy ngày nhiệt độ 40 - 45°c cho sản phẩm khô hoàn toàn Sau đem kiểm tra, đóng gói bảo quản Ket kiểm tra số lượng tế bào, hoạt độ enzyme chế phẩm trước thời gian bảo quản là: Số lượng tế bào vi khuẩn: 58,9 X 1010 cfu/g Hoạt độ enzyme amylase: 160 W 0/ml Hoạt độ enzyme protease: 80 Hđp/ml 42 Hình 4.6 Hoạt độ protease chế phẩm chứa Bacỉỉỉus subtỉỉỉs Hình 4.5 Hoạt độ amylase chế phẩm chứa Bacỉỉỉus subtỉỉỉs 4.1.4 Kết kiểm tra chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản Chế phẩm sau sản xuất tiến hành đóng gói đem bảo quản nhiệt độ phòng Sau kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase, protease thời gian bảo quản 10,20 30 ngày Ket ghi nhận bảng 4.5 Bảng 4.5 Ket kiểm tra chế phẩm Bacillus subtiỉis thời gian bảo quản Chế độ Thời điểm Số lượng tế bào Hoạt độ amylase Hoạt độ protease bảo quản kiểm tra (ngày) (xio9 cfu/g) (W0/ml) (Hđp/ml) 10 118 160 80 20 88.9 160 80 30 68.9 160 80 Nhiệt độ thường N hư sau kiểm tra chế phẩm 30 ngày ghi nhận sản phẩm chứa Baciỉỉus subtilis sản xuất có số lượng tế bào 68,9 X amylase 160Wo/ml hoạt độ protease 80 Hđp/ml Quy đổi hoạt độ enzyme amylase protease sang đơn vị quốc tế Hoạt độ amylase 160 W 0/g ~ 6576 Ul/ml Hoạt độ protease 80 Hđp/ml ~ 572,8 Ul/ml 109 cfu/g, hoạt độ 43 s ố lượng cfu/g 700 600 589 500 400 M Số lượng 300 200 TT8 ^ 100 0 orTo 8 -9 10 20 30 Thời gian (ngày) Biểu đồ 4.1 Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản 44 4.2 ĐỐI VỚI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 4.2.1 Đặc điểm Lactobacillus acidophilus 4.2.1.1 Quan sát đại thể Sau phân lập Lactobacillus acidophilus từ chế phẩm chọn khuẩn lạc đặc trưng môi trường thạch đĩa MRSA có dạng tròn, nhỏ, dày đục mép bên ngoài, xung quanh khuẩn lạc có vòng Sau thời gian 48 tâm khuẩn lạc có màu vàng, đường kính khuẩn lạc từ - mm Hình 4.7 Vi khuẩn L acidophilus môi trường MRSA 4.2.1.2 Quan sát vi thể Sau quan sát hĩnh dạng bên tiến hành nhuộm Gram khuẩn lạc nghi ngờ quan sát kính hiển vi với vật kính 100 (độ phóng đại 1000 lần) Qua quan sát kính hiển vi nhận thấy vi khuẩn có dạng hình que, hai đầu tròn, kích thước trung bĩnh từ 0,6 - 0,9 X , - pm Chúng tồn dạng đơn, cặp đôi hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu tím (Gram dương) bào tử 4.2.1.3 Đặc điểm sinh hóa Từ chủng Lactobacillus acidophilus nghi ngờ tiến hành tăng sinh chúng môi trường MRSB 24 /37°c Sau thử phản ứng sinh hóa để xác định vi khuẩn vừa phân lập Ket trình bày bảng 4.6 45 Bảng 4.6 Kết thử phản ứng sinh hóa Lactobacillus acidophilus Phản ứng Kết Lên men Kết đường Indol - Lactose + VP - Sucrose + + Glucose + Citrat - Maní toi - Nitrat - Rabinose - Di động - Catalase - MR Khả đông vón sữa + ỉ Hình 4.8 Khả lên men đường Lactobacillus acidophilus Từ kết 4.2.1.1, 4.2.1.2 4.2.1.3 kết luận chủng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Từ chủng vừa phân lập tiến hành khảo sát khả đông vón sữa kiểm tra số lượng tế bào chúng hai loại môi trường sữa đặc có đường sữa đậu nành 46 4.2.2 Kết kiểm tra số lượng L acidophilus độ chua Therne loại môi trường 4.2.2.1 Trên môi trường sữa đặc có đường Sau tăng sinh môi trường MRSB 37°c / 24 cho lượng giống 5% vào môi trường sữa đặc có đường với nồng độ 15%, 20% 25% Sau thời gian nuôi 24 nhiệt độ phòng tiến hành kiểm tra độ chua Theme số lượng tế bào vi khuẩn có ml dịch môi trường Ket trình bày bảng 4.7 4.8 Bảng 4.7 Khả tạo độ chua L acidophỉlus môi trường sữa đặc có đường Nồng độ sữa 15% 20% 25 % 3 0,8233a 0,9420b l,169c SD 0,045 0,059 0,046 Cv% 5,477 6,361 4,009 Lặp lại (n) X (g/100ml) Bảng 4.8 Số lượng của/,, acidophiỉus môi trường sữa đặc có đường Nồng độ sữa 15 % 20% 25 % 3 X ( Xl09cfu/ml) 8,83a 1l,017b 21,967c SD 0,317 1,086 3,350 Cv% 3,59 9,86 15,25 Lặp lại (n) Qua bảng 4.7 4.8 nhận thấy nồng độ sữa cao khả tạo độ chua sinh khối vi khuẩn L acidophilus nhiều Độ chua số lượng tế bào vi khuẩn cao môi trường có nồng độ 25% sữa Ket xử lý thống kê cho thấy có khác biệt nồng độ lên số lượng tế bào vi khuẩn độ chua có ý nghĩa (P < 0,001) 4.2.2.2 Trên môi trường sữa đậu nành Tương tự cách thực môi trường sữa đặc có đường bố trí thí nghiệm môi trường sữa đậu nành nồng độ đậu có bổ sung hàm lượng đường khác Ket thu trình bày 4.9 4.10 47 Bảng 4.9 Khả tạo độ chua củal, acidophilus môi trường sữa đậu nành N\ N ồng 10% độ NAo NA K ết \ L ặp lại (n) X (í^lOOm l) SD Cy % 10 15% n a 15 20 n a NBo NB 10 20% NB 15 n b 20 NCo NC 10 N C l5 n c 20 3 3 3 3 3 3 ,0 ,2 ,3 1,41 1,0 ,2 1,6 ,7 ,1 1,41 ,61 1,8 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 6 ,0 ,0 ,0 5 ,0 ,0 ,0 ,3 ,5 ,5 ,4 ,2 ,0 ,0 3 ,1 ,3 61 ,4 Bảng 4.10 Số lượng Lactobacillus acidophilus môi trường sữa đậu nành '''x N ồng 10% ¿ộ NAo K ết L ặp lại (n) X NA N (X 1010cfú/g) SD C y% 10 15% n a 15 n a 20 NBo NB 10 20% n b 15 n b 20 NCo 3 3 NC 10 N C l5 3 n c 20 ,0 ,1 I , 37 ,4 ,6 ,6 ,3 ,9 3 ,6 ,0 ,5 ,0 ,0 6 ,2 ,1 ,0 8 ,1 ,6 ,3 ,5 ,1 ,3 ,1 0,102 ,0 ,7 II, 6,12 47 ,3 12 ,1 ,3 5 ,2 ,9 ,3 1 ,2 Qua bảng 4.9 4.10 với kết xử lý thống kê nhận thấy nồng độ đậu hàm lượng đường có ảnh hưởng đến khả tạo độ chua số lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus (với p < 0,001) Độ chua số lượng đạt cao môi trường NC20 Tuy nhiên sau xử lý thống kê nhận thấy khác biệt môi trường N B15 NC20 (P = 0,1113) hay N B 15 NB20 (P = 0,1520) Như xét mặt kinh tế môi trường NB15 môi trường cho hiệu kinh tế cao Như qua kết ưên định chọn môi trường N B 15 làm môi trường sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus 4.2.3 Kết sản xuất thử kiểm tra chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Sau chọn môi trường N B 15 môi trường tối ưu nhất, tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa L acidophilus Sau nuôi môi trường N B 15 24 nhiệt độ phòng phối trộn với bột đậu nành sấy khử trùng với tỷ lệ 1:1 Hỗn họp sấy khô 40 - 45°c ưong ngày cho khô hoàn toàn sau đem kiểm số lượng tế bào Lactobacillus acidophilus có hong gam sản phẩm tiến hành đóng gói đem bảo quản nhiệt độ phòng Ket kiểm h a trình bày bảng 4.11 48 Bảng 4.11 Số lượng vi khuẩn L acidophilus sau thời gian bảo quản Thời gian ngày 10 ngày 20 ngày Số lượng (xi o6 cfu/g) 38 4,15 2,83 Qua bảng 4.11 nhận thấy số lượng tế bào vi khuẩn giảm nhiều vào 10 ngày đầu sau giảm dần sau thời gian bảo quản ® ^ ^ Thời gian (ngày) Biểu đồ 4.2 Sổ lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản Hình 4.9 Chế phẩm chứa B subtilis L acidophilus sau đóng gói 49 Phần KÉT LUÂN VÀ ĐÈ NGHI• • 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Đối với Bacillus subtìlis Trong số loại môi trường nhân giống cấp Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường có bổ sung % tinh bột pepton-gelatin, ghi nhận môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột môi trường có khả cho sinh khối hoạt độ enzyme amylase protease cao với số lượng tế bào 19,2 X 109 cfu/ml, hoạt độ amylase 256 (W0/ml) protease 128 (Hđp/ml) Môi trường A môi trường nhân giống cấp có khả cho sinh khối hoạt độ enzyme amylase, protease cao với số lượng tế bào ,6 x l0 10 cfu/g, hoạt độ amylase 160 (W0/ml) protease 80 (Hđp/ml) Sau sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis có số lượng tế bào 589 X 109 cfu/g, hoạt độ amylase 160 (W0/ml) protease 80 (Hđp/ml) Sau thời gian bảo quản 10, 20 30 ngày nhiệt độ phòng nhận thấy số lượng tế bào có giảm hoạt độ enzyme amylase protease không thay đổi 5.1.2 Đối với Lactobacillus acidophilus Trên môi trường sữa đặc có đường, độ chua số lượng tế bào tăng dần nồng độ sữa tăng dần số lượng vi khuẩn độ chua cao nồng độ 25% sữa cho số lượng tế bào 21,96 X 109 cfu/ml độ chua l,1093g/100 ml Đối với môi trường sữa đậu nành số lượng độ chua cao m ôi trường NBis Số lượng tế bào 73,1 X 109 cfu/ml độ chua l,6g/100 ml Chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus sau sản xuất có số lượng tế bào 38 X 106 cíu/g Sau thời gian bảo quản số lượng tế bào giảm nhanh vào 10 ngày đầu sau giảm dần sau thời gian bảo quản 5.2 ĐỀ NGHỊ s Cần khảo sát thêm nuôi cấy B subtilis nhiệt độ 37°c vào thời điểm khác 24 36 để xác định xác điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm v' Chiết xuất enzyme tinh khiết phục vụ ừong chăn nuôi ngành công nghiệp khác v' Khảo sát thêm khả sinh enzyme lipase vi khuẩn Bacillus subtilis 50 ■/ Cần phân lập thêm nhiều chủng Lactobacillus acidophilus từ nhiều nguồn khác sữa chua, n em để tim chủng tốt phục vụ cho sản xuất 'S Sản xuất dây chuyền khép kín với số lượng lớn để hạ giá thành sản xuất 5.3 TỒN TẠI s Chưa kiểm tra khả ức chế chế phẩm vi khuẩn gây bệnh E coli, Salmonella 'S Chưa kiểm tra độ an toàn tác dụng chế phẩm thú thủy sản [...]... trường D Chọn môi trường tối ưu nhất Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Bảo quản, kiểm tra Sơ đồ 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis Môi trường E 28 3.3.1.2 Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtiỉis trên môi trường nhân giống cấp 2 Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi tiến hành xác định môi trường nhẵn giống cấp 2 tối ưu nhất... cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản xuất Mỗi môi trường thí nghiệm được lập lại 3 lần Môi trường A B c D E Số lượng tế bào vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hoạt độ enzyme amylase Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hoạt độ enzyme pro1ease Lần 1 Lần 2 Lần3 29 3.3.1.3 Sản xuất chế phẩm chứa Bacỉllus subtilis Sau khi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm. .. thí nghiệm 3.3.1.1 31 3.3.2 Đối với Lactobacillus acidophilus Chế phẩm Antibio (chứa L acidophilus) Phân lập MRSA Chọn khuẩn lạc điển hình MRSB tăng sinh (24 giờ /37°C) Kiểm tra sinh hóa Xác định Lactobacillus acidophilus Môi trường sữa đậu nành Môi trường sữa đặc có đường J 24 giờ, nhiệt độ phòng Kiểm tra Số lượng vi khuẩn có trong lml Độ chua Theme 'V „ _ 1 7 Chọn ra môi trường tối ưu Sản xuất chế. .. cấpl : môi trường Frage, m ôi trường pepton - gelatin, môi trường chứa m ật rỉ đường + 2 % tinh bột, môi trường Edward và môi trường Nomura • Môi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột m ĩ Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục 25 3.2.4.2 Đối với Lactobacillus acidophihts • Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSB • Môi trường phân lập MRSA • Môi trường. .. nhất định và lượng enzyme đã xác định trước • Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định • Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm 2.5.3.2 Đơn vị hoạt độ Khả năng xúc tác của enzyme được xác định. .. nhuộm Gram và cấy giữ giống Những khuẩn lạc nghi ngờ này được tăng sinh trong môi trường MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°c để tiến hành thử các phản ứng sinh hóa Xác đinh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus xác định dựa trên các phương pháp truyền thống như: o Quan sát hĩnh dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi nhuộm Gram, o Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa Phản... release 13.20 để so sánh sự khác biệt giữa các môi trường Đối với thỉ nghiệm trên Bacillus subtilis Môi trường nhân giống cấp 1 và môi trường nhân giống cấp 2 chúng tôi dùng dùng trắc nghiệm 1 yếu tố để xem tác động của: ■ M ôi trường lên số lượng tế bào vi khuẩn ■ M ôi trường lên hoạt độ enzyme amylase ■ M ôi trường lên hoạt độ enzyme protease Đối với thỉ nghiệm trên Lactobacillus acidophilus Môi trường. .. 'V „ _ 1 7 Chọn ra môi trường tối ưu Sản xuất chế phẩm chứa L acidophilus trên môi trường tối ưu Kiểm tra, đóng gói và bảo quản Sơ đồ 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus 32 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 3.3.2.1 Mầu phân lâp : sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus do Hàn Quốc sản xuất Ouv trình phân lâp: lgammẫu + 9ml ddNaCl 9°/oo... phân lập MRSA • Môi trường nuôi cấy và thử các phản ứng sinh hóa • Môi trường sản xuất: môi trường sữa đặc có đường và môi trường sữa đậu nành Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục 3.3 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1 Đối với Bacillus subtilis 3.3.1.1 Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtiỉis trên môi trường nhân giống cấp 1 Cách tiến... 47% Lactobacillus của sản phẩm A và 70% của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6 serotype E coli Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L acidophilus, L caseỉ và L faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella Jin et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E co lỉ Cấc sản phẩm vi sinh