ứng dụng của enzyme trong y học

Enzym cũng như một số chất dùng trong chữa bệnh cho người và gia súc cónhững đặc tính không phù hợp chung như sau :o Khối lượng phân tử lớn , khó qua màng tế bào o Dễ dàng bị phân hủy tr

MỤC LỤC

  

Mục lục trang 1Chương I: Ứng dụng enzyme trong y học trang 2

I-Ứng dụng enzyme trong y học trang 2

1/Enzyme cố định trang 32/Enzyme từ nguồn thực vật trang 4

a/ Bromelin trang 4b/ Papain và Chymopapain trang 63/Enzyme từ nguồn động vật trang 7

a/ Pepsin trang 7b/ Trypsin và Chymotrypsin trang 7Bảng 1 : Một số enzyme sử dụng trong chữa bệnh trang 8

II-Ứng dụng enzyme trong chẩn đoán bệnh trang 9III-Một số chế phẩm enzyme trên thị trường hiện nay trang 12Chương II: Ứng dụng Protein trong trị liệu trang 13

I-Các Protein từ máu và sản phẩm trung gian trang 13II-Vaccin và kháng thể trang 14Chương III: Cytokin trang 27

I- Sự phát hiện Cytokin trang 27II-Đặc tính chung của cytokin trang 28III-Một số Cytokin tiêu biểu trang 29

1/Interleukin trang 302/Interferon trang 32IV-Các loại Peginterferon(chế phẩm của interferon) trang 33V-Dược động học của PEP interferon α -2A trang 35VI-Dược động học của PEP interferon β -2B trang 35VII-Dược động học của PEG interferon α -2A trang 36IX-Dược động học khi phối hợp với Ribavirin trang 37X-Dược lực học và động học virus trang 38Chương IV: Hormone trang 42

I- Cơ chế chi tiết của quá trình tác dụng của hormone trang 43II- Một số hormone tiêu biểu trang 46

1/ Glucagon trang 462/ Insulin trang 46Tài liệu tham khảo trang 48

  

CHƯƠNG I - ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC

I- ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG CHỮA BỆNH :

Enzym cũng như một số chất dùng trong chữa bệnh cho người và gia súc cónhững đặc tính không phù hợp chung như sau :

o Khối lượng phân tử lớn , khó qua màng tế bào

o Dễ dàng bị phân hủy trong môi trường tiêu hóa

o Dễ bị mất họat tính sinh học do họat động ức chế của các chất hiện diện trong hệ dịch và trong mô

o Có thể biểu hiện như một kháng nguyên Tuy nhiên , enzym có những đặc điểm riêng , được sử dụng như một lọai thuốc chữa bệnh có hiệu quả Hiện nay , enzym được sử dụng chủ yếu chữa các bệnh sau :

 Enzym như chất cho thêm vào cơ thể để chữa bệnh kém tiêu hóa đối với một số người

 Enzym được sử dụng như chất làm sạch vết thương và làm lành vết thương

 Enzym được sử dụng trong các phản ứng miễn dịch

1/ Enzyme cố định :

Ngày nay người ta đã tìm ra hơn 120 bệnh về rối loạn chuyển hóa ở người , đa số các bệnh này là do thiếu một loại enzyme đặc biệt nào đó

Ví dụ : bệnh phenylcetone niệu (phenylketonuria) do một khuyết tật bẩm

sinh về chuyển hóa protein , tạo ra quá mức amino acid phenylamine trong máu, làm tổn hại hệ thần kinh và đưa đến chậm phát triển trí tuệ nghiêm trọng

Những người bị Ví dụ : bệnh phenylcetone niệu (phenylketonuria) do một

khuyết tật bẩm sinh về chuyển hóa protein , tạo ra quá mức amino acid

phenylamine trong máu , làm tổn hại hệ thần kinh và đưa đến chậm phát triển trí tuệ nghiêm trọng Những người bị mắc bệnh này thường thiếu enzyme chuyển đổi phenylalanine mắc bệnh này thường thiếu enzyme chuyển đổi phenylalanine Ngoài ra có một cách có thể sử dụng để chữa trị đó là thay thế enzyme chuyển hóa đã mất đi Tuy nhiên một enzyme có chức năng tương tự không có nguồn gốc từ cơ thể người không thể đưa một cách trực tiếp vào cơ thể bởi vì nó sẽ gây ra một đáp ứng miễn nhiễm có hại cho cơ thể Để giải quyết vấn đề này người ta cô lập enzyme trong các vi hạt , sợi hay gel Khi đó ,enzyme có thể không gây ra đáp ứng miễn nhiễm có hại nào trong khi cơ chất của nó có kích thước nhỏ có thể đi xuyên qua gel , các lỗ trên sợi hay màng củacác vi hạt Những enzyme có lớp màng bao bọc này không bị các kháng thể tấn công do có lớp màng không nhạy cảm với kháng thể , khi đó protein được tạo thành in vivo trên bề mặt lớp màng có vai trò làm giảm ảnh hưởng của cơ chất là phenylalanine

 Cũng theo nguyên tắc này người ta có ý tưởng làm thận nhân tạo Trong thiết bị nhân tạo này , urease và hạt resin hấp thụ hay than chì được kết thành nang với nhau Khi đó urea sẽ bị urease phân hủy tạo thành

ammonia , ammonia sẽ được hấp thụ trong các vi nang :

khuếch tán urease hấp thụ lên serin

UREA UREA HCO

-3 + NH 4 Vào vi nang hay than chì

 Trong số các thử nghiệm lâm sàng quy mô nhỏ về enzyme cố định , người ta đã tiến hành thử nghiệm trên quá trình chuyển đổi steroid Cortisol là một loại thuốc hữu dụng dung trong điều trị bệnh viêm khớp ,

cortisol có thể được sản xuất từ một loại tiền chất rất rẻ tiền là 11-deoxycortisol nhờ cột enzyme cố định 11-β-hydroxylase Cũng theo cách này mà cortisol có

thể chuyển thành một loại thuốc chữa bệnh cao cấp hơn đó là prednisolone khi

sử dụng thiết bị phản ứng có chứa enzyme Δ1 dehydrogenase cố định Tuy nhiên hầu hết các quá trình biến đổi steroid thương mại hiện nay đều được thựchiện nhờ công nghệ vi sinh vật

 Trong một tương lai gần enzym sẽ được sử dụng rộng rãi trong nghành y tế để làm đầu dò cho các thiết bị phân tích y tế và để chữa bệnh.Hiện nay một số enzym như: glucooxydase, hexokinase, cholesteroloxydase, esterase, urease, alcoholdehydrogenase đã được sử dụng khá rộng rãi trong ngành y tế.Điển hình nhất là việc sử dụng glucooxydase cố định trền bề mặt điện cực platinum trang thiết bị phân tích hàm lượng glucose trong máu Bản chất hoạt động của điện cực như sau:

Enzym glucooxydase được gắn trên màng của điện cực, khi điện cực tiếp xúc với dịch mẫu chứa glucos, thì nó sẽ xúc tác phản ứng:

glucose + O2  gluconoic acid + H 2 O 2

Do đó nếu trong mẫu càng nhiều glucose, thì càng nhiều oxy tự do tham gia phản ứng với nó và ngược lại càng ít oxy tự do được ghi nhận trên điện cực platinum Qua đó người ta sẽ xác định được hàm lượng glucose của mẫu phân tích ( thí dụ như trong máu chẳng hạn)

 Trong y học ezyme cịn được sử dụng để chữa trị một số bệnh liên quan đến sự thiếu hụt của một số enzym trong cơ thể người, hoặc dùng enzyme để loại bỏ một số cục thịt , mỡ dư thừa gây nguy hiểm cho một số bộ phận cho cơ thể người Thí dụ người ta dùng enzyme streptokinase và

urokinase để làm tan máu đơng làm nghẽn mạch máu

 Ngịai ra cịn cĩ một số ứng dụng :

-Vi tiểu cầu chứa catalaza đã cĩ thể thay thế một cách hiệu quả các catalazacịn thiếu ở trong cơ

- Đưa vi tiểu cầu cĩ gắn enzyme L-asparaginaza vào cơ thể , cĩ khả năng

ức chế sự phát triển của một số u ác tính bởi sự phát triển của các u này phụthuộc vào sự cĩ mặt của L-asparagin

a/ Vai trò hổ trợ tiêu hóa

Một trong những lợi ích của nĩ được chú ý đến đĩ là một chất gíup chotiêu hĩa vì nĩ hoạt động ở acid trong dạ dày và cả trong mơi trường kiềm ởruột non Bromelin cĩ thể thay thế được cho cả những enzyme tiêu hĩa khácnhư pepsin và trypsin

Trái ngược với một số enzym khác, bromelin được hấp thu từng phầnvà đi vào máu, tạo nên tác động tiêu hóa protein Khi dùng thuốc viêmbromelin cải thiện việc tiêu hóa thì nên dùng giữa bữa ăn

b) Giảm đau và phù nề sau phẩu thuật hoặc sau chấn thương

Theo một nghiên cứu được công bố vào năm 1995 tại Đức trên 59người thử nghiệm bị đau do giập cơ, người ta thấy có giảm đáng kể hiệntượng sưng phòng và đau Dùng bromelin điều trị ở xoang mũi và quanh hốmũi Từ 1960, với thí nghiệm lâm sàng đối chiếu với giả dược trên 146 võ sĩquyền anh bị giập mũi và tụ máu đã đi đến kết luận rằng: 78% được được trịbằng bromelin qua đường tiêm tĩnh mạch hoàn toàn khỏi trong vòng bốnngày đối lại 14% được dùng giả dược

Nhiều nghiên cứu khác trên các sưng viêm sau phẫu thuật giảm nếubệnh nhân được cho sử dụng 40mg bromelin, 4 lần/ngày, dùng hai ngàytrước khi phẫu thuật và năm ngày sau đó Bromelin ngăn chặn việc phóngthích prostaglandin là nguyên nhân gây sưng viêm Vì vậy nên giải thíchđược cơ chế tác động chống viêm của thơm Vì thế bromelin còn được dùngđể chống bệnh vêm khớp

Tuy nhiên cũng có hai nghiên cứu trên 254 người không cho được kết quả mong đợi trên việc sưng phù sau phẫu thuật.

 Tĩm lại : Bromelin cĩ tác dụng kháng viêm, rất cĩ hiệu quả trong chữa trịbệnh viêm thấp khớp do đĩ các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelin nhưchất làm giảm đau , kháng viêm và kháng sưng Hiệu quả của bromelin là làmgiảm lượng prostaglandin trong cơ thể gây ra đau viêm và ngăn cản sự thấmcác chất dinh dưỡng qua mơ bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm Bromelin cĩ ảnh hưởng tích cực trên các prostaglandin hữu dụng

c) Làm mau lành vết thương

Việc đắp lại tại chỗ bromelin làm gia tăng tiêu hủy các mô hoại tử

d) Giảm đau nhức cơ

Một nghiên cứu công bố vào năn 2002, với 30 đối tượng thử nghiệm đãthực các động tác thể lực gây đau cơ tay, so sánh giữa việc dùng bromelin900mg/ngày với dùng 1600mg ibuprofen (thuốc trị đau nhức) cho kết quảtương đương

e) Chống rối loạn tim mạch

Các quan sát lâm sàng cho phép kết luận rằng việc dùng bromelin vớiliều 400mg-1000mg giúp làm giảm đau thắt ngực sau khi ngưng dùng cácthuốc trị đau thắt ngực Việc kết hợp promelin với potassium và magnesiumlàm giảm tai biến nhồi máu cơ tim Bromelin làm sạch máu giúp giải thíchtác động chống kết tập tiểu cầu.một nghiên cứu khác trên 73 người tìnhnguyện bị viêm tĩnh mạch cấp tính thì thấy việc sử dụng bromelin với thuốckháng viêm giảm đau giúp làm giảm các triệu chứng của bệnh này trên hệtĩnh mạch

f) Các nghiên cứu khác:

Ngoài ra bromelin còn được dùng để điều trịsung huyết đường hô hấp, cải thiện việc tiêu hóa vàhấp thu một số thuốc Bromelin dùng cho các bệnhnhân bị rối loạn tiêu hóa do cắt bỏ tụy tạng hoặcthiếu enzym tuyến tụy Từ đó người ta nghĩ đến việcdúng bromelin để gia tăng hấp thu hoạt chất thuốc

như glucosamin, kháng sinh, thuốc an thần làm tăng thời gian tác dụng củathuốc.

Ngoài ra bromelin còn tác động lên hệ miễn dịch, nên có thể giúp giatăng khả năng phòng chống một số bệnh do hệ tự miễn yếu kém của conngười vì lão hóa cũng như chống lại sự thành lập các khối u

Các chế phẩm có bromelin được dùng ngoài giúp mau lành vết thươngdưới dạng kem bôi da

Vì thế việc ăn tráng miệng bằng thơm sau các bữa ăn nặng sẽ giúp

mau “nhẹ bụng”.

+Phương pháp sản xuất :

Enzyme bromelin cĩ thể được thu nhận trong thân , trong phần thịt quả vàtrong chồi quả dứa (thơm) Việc thu nhận và tinh sạch bromelin cĩ thể thựchiện theo sơ đồ sau :

Bã quả/thân/chồi dứa xay nhuyễn dịch lọc ly tâm

lọc

dịch ly tâm

Có khả năng giảm độc đối với toxin và toxanpunin.

Nhựa papain thô dùng để điều trị rối loạn tiêu hóa do thiếu men, giúptiêu hóa tốt chất đạm trong thức ăn , làm thuốc tẩy nhiều loại giun

Có tác dụng ngừa thai và gây sẩy thai do hoạt tính của nó đối vớiprogesteron của thai phụ

Chiết xuất papain được dùng trong phẫu thuật cột sống như là một loại

“dao phẫu thuật tự nhiên” để mở đĩa đệm cột sống

Được dùng để điều trị lở loét , làm tiêu giải trong bệnh bạch hầu,chống kết dính sau phẫu thuật

Khi tinh chế dầu gan cá thường bổ sung papain để tăng hàm lượng vitamin

Aceton 2:1

Bột papin

+ Sản phẩm : chế phẩm enzyme tồn tại ở dạng bột vô định hình , trắng

hay vàng nhạt , hay mảnh nhỏ , trong hay hơi đặc , mùi đặc biệt giống mùi

nước thịt , vị hơi chua

b/ Trypsin va Chymotrypsin :

Trypsin và Chymotripsin là những protease kiềm tiết từ tuyến tụy của

đông vật máu nóng Các enzyme này khi mới được tiết ra đều ở dạng tiền

enzyme (proenzyme) bất hoạt ( trypsinogen và chymotrypsinogen ), sau đó

chúng được hoạt hóa và trở thành dạng hoạt động là trypsin và chymochypsin

ở trong tá tràng Các enzyme này thuộc nhóm enzyme phân cắt các liên kết

amide , liên kết peptide Ngoài ra chúng cũng có thể cắt cả liên kết carbon –

carbon Tuy nhiên vai trò chính của enzyme này trong cơ thể là thủy phân liên

kết peptide trong suốt quá trình tiêu hóa protein ở ruột non

Trypsin cũng được ứng dụng để chữa bệnh kém tiêu hóa

Một số loại enzyme sử dụng trong chữa bệnh

serine protease)

Cellulase 3.2.1.4 Trichodermaviride 57+52+76 Bệnh khó tiêu hóa

hóaCollagenase 3.4.24.3 Clostridium

FactorVII

Factor IX ( chris

mas factor)

Factor xa 3.4.21.6 Plasma người hay

bò 47,2(xa α )44,2(xa β ) Bệnh rối loạn đông tụFactor XIII (fibrin

Lyzozyme

(muramidase ) 3.2.1.17 Lòng trắng trứng 14,3 Bệnh nhiễm trùng

Plasmin

Plasminogen

activator

Superoxide

dismutase

1.15.1.1 Erythrocyt bò 32,5 Chống lão hoá tế bào

Thombin

(fibrinogenase ) 3.4.21.5 Plasma người 39 (α)28 (β) Bệnh chảy máu

II - ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHẨN ĐÓAN BỆNH :

1 Ứng dụng enzym trong xác định nồng độ cơ chất :

Nồng độ cơ chất được xác định theo 2 phương pháp :

- Phương pháp xác định điểm cuối ( end-poind methods )

- Phương pháp do tốc độ phản ứng ( measurement of reaction rate )

a Phương pháp xác định điểm cuối :

Nguyên tắc của phương pháp như sau : Khi cho enzym tác động vào cơ chất , cơ chất sẽ giảm và sản phẩm cuối sẽ tăng lên Ta có thể xác định được những chỉ số này

Đối với nồng độ cơ chất thấp hơn giá trị của hằng số ( Km ) Michaelis ,

tốc độ phản ứng tuân theo phương trình sau :

v = e s * v/K m

Ở đây, thời gian cần cho phản ứng phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và

hằng số (Km) của enzym sử dụng.

 Phương pháp xác định glucose với glucose-oxidase

Trong phản ứng đầu tiên, glucose bị oxy hóa bởi glucose oxidase

(EC.1.1.3.4), tạo thành peroxide hydro theo phương trình sau:

horse radish peroxidase

Trong phân tích này, 2,2’-azino-bis (3-ethyl 2,3 – dihydrobenzothiazol sulfanote (ABTS) đước sử dụng như chromogen

 Phương pháp xác định urea

Urea bị thủy phân bởi urease (EC.3.5.1.5) ở 0,7 UI/ml Và amoniac được tạo thành khi cho enzym glutamate dehydrogenase (EC.1.4.1.3) có hoạt tính 6,2 UI/ml tác động

Urea + H2 O 2NH 3 + CO 2

2-Cetoglutarate + 2NH 4 + + 2NADH 2L-glutamate + 2NAD + +2H 2 O

b Phuơng pháp động học : (kinetic methods)

Phương pháp này chỉ xác định nồng độ cơ chất dưới giá trị Km

 Phương pháp xác định glucose : phản ứng xảy ra trong phương pháp

này như sau:

Ở phản ứng đầu , glucpse được phosphoryl hóa bởi hexokinase (EC 2.7.1.1 ) Sau dó , glucose -6-phosphate bị hydrogen hóa bởi tác động của glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.49 ) Sự tạo thành NADPH sẽ được xác định bằng máy quang điện

 Xác định triglyceride :

Chất béo được thủy phân bằng lipase ( EC 3.1.1.3) và carbpxylesterase

(EC.3.1.1.1) Glycerol sau đó sẽ được phosphoryl hóa bởi glycerol kinase (EC 2.7.1.30) ADP được tạo thành sẽ tiếp tục được phosphoryl hóa đến ATP với phosphor enol pyruvate và pyruvate kinase 9EC.2.7.1.40) Cuối cùng pyruvate được hydrogen hóa bởi L-lactate dehydrogenase ( EC.1.1.1.27) và NADH sẽ giảm dần

Triglyceride + 3 H 2 O glycerol + 3 acide béo Glycerol + ATP glycerol 3 phosphate + ADP

ADP + phosphor enol pyruvate ATP + pyruvate

Pyruvate + NADH + H + L-lactate +NAD +

2 Xác định họat tính enzyme :

 Xác định họat tính của alkaline phosphatase (EC.3.1.3.1)

4-Nitro phenyl phosphate + H2O phosphate + 4-nitro phenolate

Ở pH tối ưu 9,8 sản phẩm sẽ phân tán và tốc độ phản ứng sẽ tăng theo độ hấp thụ ở bước sóng 405nm

 Xác định họat tính của creatine kinase (EC 2.7.3.2)

Creatine phosphate +ADP creatine +ATP

ATP được tạo thành trong phản ứng này nhờ xúc tác của enzyme creatine kinase

3 Thực hành miễn dịch :

Enzyme được sử dụng ở đây để xác định hỗn hợp kháng nguyên – kháng thể , tạo thành trong phản ứng miễn dịch Ta có thể sử dụng máy so màu quangđiện , hùynh quang để xác định phản ứng

a Enzyme alkaline phosphatase ( EC 3.1.1.3)

Enzyme này được ứng dụng trong phản ứng miễn dịch Người ta

thường sử dụng enzyme này với họat tính 2500UI /mg , ở nhiệt độ 37oC

Để xác định họat tính alkaline phophatase có thể sử dụng máy hùynh quang với 4-methylumbelliferyphosphatase làm cơ chất

b β – galactosidase ( EC 3.2.1.23)

Người ta thường sử dụng enzyme này có họat tính riêng lớn hơn 250UI/

mg với cơ chất là 4-nitrophenyl-β-D-galactosidase , ở 37o C

Họat tính của β-galactosidase được đo bằng máy quang điện với methylumbellifery- β-galactosidase

4-Ngòai ra ta có thể sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-

β-galactosidase

c Horseral peroxidase (EC 1.11.1.7)

Enzyme này chứa 2 đến 3 nhóm họat động aminE trong phân tử và chứa12-14,5% carbphydrate Xác định họat tính enzyme này bằng máy quang điện Cơ chất thường sử dụng là chromogen-2-2’azinobis [3-ethybenzothiazoline-sulfonate] (ABTS) và peroxidase có họat tính riêng

Hiệu quả kháng viêm mạnh.

Tác động kháng viêm qua cơ chế làm tiêu dịch rỉ viêm, ức chế sự tăng tính thấm thành mạch Làm loãng đàm, tiêu

mủ, máu tụ Tăng vận chuyển kháng sinhvào ổ nhiễm trùng

Hệ tuần hoàn của người trưởng thành chứa khoảng 5 – 6 lít máu, chiếm 8.5 –9,0% tổng khối lượng cơ thể Máu gồm các tế bào hồng cầu (99% tổng số

các tế bào máu), bạch cầu và tiểu cầu, lơ lửng trong dịch huyết tương Khi máu đóng cục , các tế bào bị nhốt trong mạng lưới các protein , sợi fibrinogen , chất lỏng còn lại là huyết thanh Huyết tương căn bản gồm huyết thanh và

fibrinogen Máu có vai trò quan trọng sống còn trong nhiều chức năng sinh lý

như vận chuyển oxigen , các chất dinh dưỡng các enzim , hormone , Nhiều chức năng đặc hiệu của máu do các protein quyết định và chúng được sử dụng chủ yếu ở dạng : Máu toàn phần , chất đông máu , chất chống đông máu và tác nhân làm tan máu

Máu toàn phần thu nhận vô trùng từ người hiến máu và xử lý ngay với

chất chống đông Ngoài việc dùng cho truyền máu trực tiếp , nó là nguồn cung cấp các thành phần khác nhau : các tế bào hồng cầu , tiểu cầu ; các nhân tố đông máu khác nhau ; immunoglobine và các thành phần bổ sung của huyết tương Trước khi sử dụng , máu phải được đảm bảo không có bất kỳ tác nhân gây bệnh nào

Albumin huyết thanh là loại protein chủ yếu , chiếm khoảng 60% tổng

số protein huyết tương, được tinh lọc từ huyết thanh, huyết tương hoặc từ nhau thai của người cho khỏe mạnh

1 – Antitrypsin là một glycoprotein huyết thanh, mà sự thiếu nó

thường gây bệnh khí thủng Liệu pháp bổ sung 1 – Antitrypsin qua tĩnh mạch

có thể ngăn chặn bệnh này 1 – Antitrypsin tái tổ hợp đã được sản xuất thành công trong sữa của cừu và chuột

Các chất đông máu làm hình thành cục máu tại vị trí tổn thương Sự đông máu

là một quá trình phức tạp gồm chuỗi phản ứng nối tiếp nhau của 13 nhân tố ( đánh số la mã từ I=>XIII ) Đáng lưu ý là nhân tố VIII và IX liên quan đến bệnh di truyền máu khó đông , có thể đựơc tinh chế từ huyết tương Ngày nay ,

cả hai r-protein VIII và IX đều đã được sản xuất

Các chất đông máu được sử dụng cho người bị bệnh đau tim , đột quỵ

hay mắc chứng nghẽn mạch liên quan đến sự đông kết cục máu Sự tắc nghẽn động mạch vành sẽ gây ra cơn đau tim , thường gây chết do nhồi máu cơ tim Các cục máu ngăn chặn sự di chuyển của dòng máu lên bộ não thường gây ra hậu quả là đột qụy

Các chất chống đông truyền thống gồm :

- Heparin có bản chất là glucosaminoglycan chế phẩm heparin thương

mại thương mại thường được chế xuất từ màng nhày ruột heo hoặc phổi bê

- Hirudin là peptit chống đông máu được tiết ra từ tuyến nước bọt của

con đĩa ( hirudo medicinalis ) Hirudin , được ứng dụng rộng rãi do

có nhiều ưu điểm trong điều trị : tác động trực tiếp lên thorombin , không đòi hỏi đồng yếu tố ( cofactor ) để có hiệu quả ức chế , ở nồng

độ cao vẫn ít gây chảy máu và ít gây đáp ứng miễn dịch

- Ancrod là một serine protease chống đơng , được tinh chế từ nọc độc

của một lồi rắn ở malaysia , xúc tác sự phân cắt phân tử fibrin

Các tác nhân làm tan máu gồm t-PA (tissue plasminogen activator – nhân tố hoạt hĩa plasminogen mơ ) , urokinase và streptokinase là các protein làm tan ( phân hủy ) các cục máu Chúng được chỉ định trong điều trị các chứng nhồi máu cơ tim , tắc mạch , đột quỵ

II- VACCINE VÀ KHÁNG THỂ :

II.1 Vaccine :

Vaccine là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệuchủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số tác nhân gâybệnh cụ thể Các nghiên cứu còn mở ra hướng dùng vaccine để điều trị mộtsố bệnh ( miễn dịch liệu pháp) Thuật ngữ vaccine xuất phát từ vaccinia,loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừa

được

II.1.1 Cơ chế tác dụng :

Hệ miễn dịch nhận diện vaccine là vật lạ nên huỷ diệt chúng và “ghi nhớ”chúng Về sau khi các tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể , hệmiễn dịch đã ở thế sẵn sàng để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chónghơn và hữu hiệu hơn ( bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễndịch , đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ) Đây chính là ưu điểm

của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

II.1.2 Phương pháp sản xuất :

II.1.2.1 Vaccine cổ điển :

+ Vaccine bất hoạt: là các vi sinh vật gây bệnh bị giết bằng hoá chất

hoặc bằng nhiệt Thí dụ: Các vaccine chống cúm , tả, dịch hạch, viêm gansiêu vi A Các vaccine nhóm này có độ an toàn cao,ổn định nhưng đáp ứngmiễn dịch không hoàn toàn và ngắn hạn , cần tiêm nhiều lần

+ Vaccine sống, giảm độc lực: là các vi sinh vật được nuôi cấy dưới

những điều kiện đặc biệt nhằm làm giảm đặc tính độc hại của chúng Vaccine loại này thường gây đáp ứng miễn dịch dài hạn và là loại được ưachuộng dành cho người lớn khoẻ mạnh Loại vaccine này có hiệu quả caokhi bảo quản lạnh , một số trường hợp virus hoặc vi khuẩn có thể phục hồihoặc biến đổi gen độc có thể dẫn đến hiệu ứng không mong muốn ở ngườiđược tiêm chủng Các vaccine phòng bệnh lao – BCG, sởi, bại liệt, quai bị…đều thuộc loại này

+ Vaccine tái tổ hợp: Với công nghệ gen hiện đại , người ta cắt đoạn

gen tổng hợp nên một prôtêin đặc trưng cho vi sinh vật gây bệnh, ghép các

gen này vào vi khuẩn hay tế bào nuôi cấy để tạo ra protêin đặc hiệu chomầm bệnh, dùng protêin để tiêm chủng tạo miễn dịch đặc hiệu Dạngvaccine này ít tác dụng phụ , khả năng miễn dịch cao.

Một điển hình của loại này là vaccine phòng viêm gan virus B thế hệ III :

Vaccine phòng viêm gan virus B thế hệ thứ III : là vaccine tạo bằng kỹthuật gen Virus có ba nhóm gen mã hoá protêin vỏ virus là protein S,protein pre – S1 và protein pre – S2.Trong đó protein pre – S2 có khả nănggây miễn dịch giúp bảo vệ tế bào nhanh và mạnh nhất Gen mã hoá choprotein pre - S2 được tách dòng name 1981 và tái tổ hợp ở tế bào nấm menSaccharomyces cerevisiae

Ngoài ra, hiện nay người ta tách dòng gen mã hoá protein bề mặt của virusHIV tạo vaccine miễn dịch chống lại virus HIV đang được nghiên cứu VirusHIV có nhiều chủng khác nhau (type), mỗi type virus HIV gây bệnh ở mứcđộ khác nhau cần loại vaccine khác nhau trong phòng thí nghiệm Mặt khác, virus HIV có khả năng thay đổi nhanh chóng kiểu gen , thay đổi cấu trúclớp vỏ ngoài chống lại các vaccine, gây khó khăn rất lớn khi sản xuấtvaccine đặc hiệu Sản xuất vaccine chống virus HIV đòi hỏi nhiều nghiêncứu phức tạp, thí nghiệm thận trọng Hiện nay , vaccine chóng virus đang ởgiai đoạn sản xuất thí nghiệm ở một số nước tiên tiến

+ Các “toxoid”: là các hợp chất độc bị bất hoạt trích từ các visinh vật

( trong trường hợp chính các độc chất này là phương tiện gây bệnh của visinh vật ) Chúng được tiêm cho vật chủ khác( như ngựa) để tạo kháng thể ,rồi chiết lấy kháng thể này để chữa bệnh Thí dụ: các huyết thanh ngừa uốnván …

II.1.2.2 Vaccine mới đang nghiên cứu:

Các vaccine này được xem là vaccine của tương lai , có 7 hướng phát triểnchính hiện nay :

+ Sử dụng các phụ gia mới , nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mong

muốn Thí dụ, chất nhôm phoshat và các oligonucleotide chứa BCG

demethyl hoá đưa vào vaccine khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theohướng dịch thể ( tạo kháng thể) thay vì tế bào

+ Anti – idiotype :

Idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể taị vị trí gắn khángnguyên đặc hiệu tương ứng Anti – idiotype là các kháng thể đặc hiệu đốivới idiotype, do đó anti – idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự vớikháng nguyên Vậy thay vì dùng kháng nguyên X làm vaccine , người tadung idiotype anti –anti –X

+ Vaccine DNA :

Người ta đã cài vào plasmid của vi khuẩn gen mã hoá nucleoprotein(NP) của virus cúm A và tiêm plasmid vào cơ bắp của chuột đã tạo đượcđáp ứng miễn dịch mạnh chống NP Chuột này được bảo vệ và không chếtkhi thử thách với virus cúm DNA plasmid đi qua màng của tế bào cơ và tếbào của hệ thống để tiếp cận với acid nucleic của nhân tế bào Tại đây ,plasmid có thể không nhân lên do thiếu tín hiệu của nhân eukaryote, vàcũng không sát nhập vào thể nhiễm sắc của cơ thể vật chủ do không đồngnhất giữa thể nhiễm sắc thể và DNA plasmid Tuy nhiên, gen mã hoákháng nguyên , nhờ sự có mặt của của một số tín hiệu điều hoà có thể saochép vào ARN thông tin (m ARN) và được giải mã thành protein với hiệulực cao, đủ kích thích hệ thống miễn dịch Khi tiêm vào người thì DNA củatác nhân gây bệnh sẽ được biểu hiện bởi tế bào người được chích ngừa Lợithế của DNA là rẻ, bền, dễ sản xuất ra số lượng lớn nên thích hợp chochương trình tiêm chủng rộng rãi Ngoài ra , vaccine DNA còn giúp địnhhướng đáp ứng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào được trình diện quaMHC loại II, dẫn đến đáp ứng CD4 (đáp ứng miễn dịch dịch thể) Khi kháng

nguyên của tác nhân đó được chính cơ thể người biểu hiện , nó sẽ được trìnhdiện qua MHC loại I, lúc này đáp ứng miễn dịch tế bào qua CD8 được kíchthích Tuy nhiên phương pháp này là con dao hai lưỡi bởi lẽ tế bào mangAND lạ có nguy cơ bị nhận diện là “ không ta” , sinh ra bệnh tự miễn.

+Vaccine lai ghép: Vaccine lai ghép (hybrid vaccine) là kết qua ûcủa sự kết

hợp kỹ thuật tái tổ hợp và kỹ thuật di truyền Chủng vi dinh vật vaccineđược cấy ghép gen mã hoá kháng nguyên lấy từ vi sinh vật gây bệnh Visinh vật được cấy ghép là vi sinh vật vector Vaccine lai ghép một lúc kíchthích cơ thể tạo ra hai đáp ứng miễn dịch: Đáp ứng bảo vệ đối với sinh vậtgây bệnh và đáp ứng đối với vi sinh vật vector Nếu vi sinh vât được chọn từdanh mục các vi sinh vật vaccine hiện có thì như vậy, người được dùngvaccine có khả năng chống hai bệnh

Hình : Vaccine lai ghép

+ Vaccine hoá tổng hợp : Vccine peptid là một thí dụ vaccine hoá tổng

hợp Bằng phương pháp hoá học, người ta có thể tạo ra một chuỗi peptid vớitrình tự sắp xếp các acid amin theo ý muốn, trên đó có epitop bảo vệ Phântử peptid này có thể liên kết với một prôtein tải để tăng phụ thuộc tế bào T

+ Sử dụng vec –tơ tái tổ hợp – dùng các vi khuẩn thuần tính hoặc các tế

bào trình diện kháng nguyên như tế bào tua được chuyển gen để biểu hiển

kháng nguyên mong muốn

II.1.2.3 Vaccine dùng để điều trị :

Một trong những hướng nghiên cứu mới là miễn dịch liệu pháp, bao gồmmiễn dịch liệu pháp thụ động và chủ động

II.2 Kháng thể

Kháng thể (tiếng Anh: antibody) là các phân tử immunoglobulin ( cóbản chất glycoprotein) , do các tế bào lympho B cũng như tương bào ( biệthoá tử lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tácnhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus Mỗi kháng thể chỉ có thể nhậndiện một epitope kháng nguyên duy nhất

II.2.1 Cấu trúc điển hình :

Hình 2: Cấu trúc của một phân tử kháng thể.

Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng

(H, heavy, tiếng Anh, màu tím trong hình 3) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light, tiếng Anh, màu xanh lá trong hình 3) cũng giống hệt nhau Có hai loại

chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda), do đó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tửimmunoglobulin chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ Các chuỗi củaimmunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có độ đàn hồinhất định (hình 2 và 3) Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố định nhưngphần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên giữa các kháng thể khácnhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng đặc hiệu với cáckháng nguyên tương ứng, điều này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơchất của nó Có thể tạm so sánh sự đặc hiệu của phản ứng kháng thể-khángnguyên với ổ khóa và chìa khóa

Các domain hằng định

Hình 3: Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể

Các domain hằng định (C, constant, tiếng Anh) đặc trưng bởi các chuỗi

amino acide khá giống nhau giữa các kháng thể Domain hằng định của chuỗinhẹ ký hiệu là CL Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 domain hằng định, tùy theolớp kháng thể CH1, CH2, CH3 và CH4

Các domain hằng định khơng cĩ vai trị nhận diện kháng nguyên, chúng làmnhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể Do đĩ, phần

"chân" của chữ Y cịn được gọi là Fc (tức là phần hoạt động sinh học của kháng

thể F: fragment, c: cristallisable)

Các domain biến thiên

Mỗi immunoglobulin cĩ 4 domain biến thiên (V, variable, tiếng Anh) ở

đầu tận hai "cánh tay" của chữ Y Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trênchuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhậndiện kháng nguyên (cịn gọi là paratope) Như vậy, mỗi immunoglobulin cĩ hai

vị trí gắn kháng nguyên Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đĩ một khángthể cĩ thể gắn được với 2 kháng nguyên giống nhau Hai "cánh tay" của chữ Y

cịn gọi là Fab (tức là phần nhận biết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding) Domain kháng nguyên nơi gắn vào kháng thể gọi là epitope

Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều giữa cáckháng thể Chính sự biến thiên đa dạng này giúp cho hệ thống các kháng thể

nhận biết được nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau

II.2.2 Cơ chế tác dụng :

II 2.2.1 Kháng thể đơn dòng:

Kháng thể đơn dòng là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó

được tạo ra từ một dòng tế bào lympho B trong điều kiện in -vitro Làkháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho vị trí epitope duy nhất của khángnguyên

Hình : Kháng thể đơn dòng, liên kết với một epitope đặc hiệu.

a Sử dụng kháng thể để phân tích miễn dịch:

Bản chất của phương pháp này là người ta dùng kháng thể đơn dòngphát hiện sự có mặt của phân tử kháng nguyên tương ứng của nó trong mẫuphân tích Phương pháp có độ nhạy rất cao nhờ phản ứng gắn rất đặc thùgiữa kháng nguyên với kháng thể Trong thực tế có một số phương phápphân tích miễn dịch Chúng giống nhau ở chỗ là đều dựa vào phản ứngkháng nguyên kháng thể và khác nhau ở hình thức biểu hiện Cụ thể làtrong các phương pháp phân tích miễn dịch phóng xạ RIA (Radio ImmunoAssay) , RAST (Radio Allegro Sorbent Test) vàa RIST (Radio ImmunoSorbent Test) , người ta xác định hàm lượng kháng nguyên bằng cách đo độphóng xạ của phức kháng nguyên kháng thể Còn trong phương pháp ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ) người ta xác định hàm lượngkháng nguyên bằng cách đo độ màu do phức kháng nguyên kháng thể tạo ranhờ enzyme đặc hiệu gắn trên nó Sau đây trình bày phương pháp RIA làmột trong những phương pháp có độ nhạy cao nhất Nội dung của nó nhưsau:

+ Gắn kháng nguyên lên bản thể nhạy cảm với nó Rửa loại bỏ những phântử kháng nguyên không gắn

+ Bổ sung kháng thể đơn dòng gắn đặc hiệu với kháng nguyên Rửa loại bỏnhững phân tử kháng nguyên không gắn

+ Gắn cầu nối được đánh dấu đồng vị phóng xạ lên kháng thể Rửa loại bỏnhững cầu nối không gắn

+ Đếm đồng vị phóng xạ để biết được số lượng kháng nguyên

Các phương pháp chỉ khác ở phần đuôi gắn với kháng thể Thí dụtrong phương pháp RIA , RAST, RIST – phần đuôi gắn có chứa đồng vịphóng xạ Có trong phương pháp ELISA – phần đuôi gắn có chứa enzymexúc tác phản ứng tạo màu để biết đựơc có hay không có kháng nguyên trongmẫu thư û

b Ức chế phản ứng thải loại khi ghép cơ quan:

Bản chất của phương pháp này là người ta sử dụng kháng thể đơn dòngchống kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T , nhằm loại bỏ phản ứngthải loại khi ghép các cơ quan của người với nhau

c Sử dụng kháng thể đơn dòng chẩn đoán sự hình thành khối u:

Bản chất của vấn đề là khi có sự hình thành khối u, trong máu sẽ xuất hiệnmột số tác nhân đánh dấu Do đó người ta có thể sử dụng phương phápphân tích miễn dịch để phát hiện các tác nhân đó trong máu hoặc trên khối

u Ví dụ: α –fetoprotein là một loại protein huyết thanh máu chủ yếu ở thainhi và hàm lượng của nó giảm nhanh trong năm đầu tiên Bằng phươngpháp RIA người ta phát hiện thấy hàm lượng protein này tăng ở bệnh nhânung thư gan và ung thư tuyến tiền liệt Tương tự , ở những người bệnh nhânung thư người ta thấy có sự có mặt của protein HCG ( Human ChorionicGonadotrophin )

d Định hướng thuốc chữa bệnh bằng kháng thể đơn dòng :

Bản chất của vấn đề là người ta lợi dụng khả năng các phân tử kháng thểgắn rất đặc hiệu với tế bào ở vị trí xác định nào đó của cơ thể ( trong đó cótế bào ung thư ) để định hướng thuốc chữa bệnh hoặc độc chất tới trực tiếpkhối u hoặc nơi cần chữa trị Như vậy sẽ làm tăng hiệu quả chữa trị lênnhiều lần

Trong thực tế người ta đã tạo được khá nhiều phức hợp kháng thể đơn dònggắn với thuốc , hoặc phức hợp kháng thể với thể liposome chứa chất ức chếđối với enzyme dihydropholate reduction ( là thuốc chữa ung thư ) Cho đếnnay một thành tựu ban đầu trong lĩnh vực này đã đạt được , tuy nhiên hãycòn rất nhiều vấn đề cần phải nghiên cứu giải quyết

e Sử dụng kháng thể đơn dòng để tinh sạch protein :

Có rất nhiều loại protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rất hiệu quả đểchữa trị nhiều bệnh hiểm nghèo ( kể cả bệnh ung thư ) Do vậy việc sảnxuất và sau đó là khâu tinh sạch các chế phẩm protein nói trên là rất quantrọng Lấy interferon làm thí dụ, về bản chất nó là một phân tử proteinchứa khoảng 146 -166 amino acid Iterferon giúp làm tăng khả năng miễndịch của cơ thể người , do vậy chúng đã được sử dụng để chữa trị một sốbệnh hiểm nghèo ( kể cả bệnh ung thư ) Trước đây interferon được sảnxuất từ máu người, sau này bằng quá trình nuôi cấy E.coli và nấm men chứagene mã hoá interferon người Trong cả hai quy trình công nghệ trên , làmsạch interferon là một khâu hết sức quan trọng Năm 1989, lần đầu tiênngười ta đã tạo chất hấp phụ đặc hiệu gắn kháng thể của interferon Nhờ đóchỉ trong chu trình tinh sạch , người ta có thể nâng độ sạch của interferonlên khoảng 5000 lần Điều này cho phép giảm khá nhiều giá thành củainterferon

II.2.2 2 Kháng thể đa dòng :

Kháng thể đa dòng là kháng thể được tạo ra từ

nhiều tế bào khác nhau trong điều kiện tự nhiên

Khi kháng thể được tiêm vào người,các kháng thể di

chuyển trong dịch thể và bắt cặp với những kháng

nguyên có epitope phù hợp Nhiều kháng thể có thể

tấn công kháng nguyên cùng một lúc (nhưng tỉ lệ rất

thấp ).Tuy nhiên, kháng thể này kém đặc hiệu vì có

thể nhận lầm nhiều cấu trúc không có tính kháng

nguyên hoặc nhân nhầm kháng nguyên vì nhiều

kháng nguyên có cùng epitope Kháng thể khi đã bắt

cặp được với kháng nguyên thì chúng thay đổi hình dạng để lộ ra những nơigắn bổ thể ở những vùng không đổi của chúng Điều này gây hiện tượng cốđịnh chất bổ trợ ở trên bề măt kháng nguyên và hiện tượng tiêu tế bào xảy

ra tiếp đó

II.2.3 Phương pháp sản xuất :

II 2.3.1 Kháng thể đơn dòng:

Về bản chất kháng thể đơn dòng là tập hợp của các phân tửđồng nhất về mặt cấu trúc và tính chất được tạo bởi dòng tế bào lai giữa tếbào ung thư myeloma với tế bào lympho của hệ miễn dịch của động vậthoặc của người Trước khi xuất hiện công nghệ sử dụng tế bào lai để sảnxuất kháng thể, thỉ việc tạo ra một số lượng lớn kháng thể có tính chất xácđịnh nào đó là một việc cực kì khó khăn Lí do chủ yếu là vì các phân tửkháng nguyên (antigen) kích thích tế bào động vật có xương sống tạo ra rấtnhiều phân tư’ kháng thể (antibody) khác nhau Mà việc tách riêng cácphân tử kháng thể này là một việc rất khó khăn và tốn kém

Do đó công trình nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tạo khángthể đơn dòng (monoclonal antibody) của Milstein và Kohler là một bướcngoặt trong lĩnh vực này Công nghệ này cho phép mở ra những ứng dụngrất quan trọng trong y tế , cũng như trong nghiên cứu và sản xuất Nội dungcông nghệ:

- Chọn động vật gây đáp ứng miễn dịch là chuột BALB/C và C57BI/6

Các loại kháng nguyên được chọn là :

Vi khuẩn gây bệnh

Virus gây bệnh (HBV, HCV, HIV)

Các hapten phối với proteinVaccine thương phẩm

Một phân tử protein

- Gây đáp ứng miễn dịch:

Tiêm một antigen (X) vào chuột

Đáp ứng miễn dịch

Hình thành các dòng tế bào lympho B

Tạo kháng thể antigen (X)

( Kháng thể đa dòng)

- Thu nhận tế bào lympho B:

Có nhiều cách thu nhận lympho B:

Phương pháp miễn dịchPhương pháp máyPhương pháp thủ côngCác dòng tế bào lympho B này được thu nhận từ lách củachuột đã đáp ứng miễn dịch Dùng kẹp lấy lách ra cho vào falcon chứa sẵnkhoảng 10ml môi trường DMEM không huyết thanh Có hai phương pháp

thu nhận tế bào theo phương pháp thủ công :

+ Dùng potter: Cho mô lách vào potter Thêm khoảng 5ml môi trường

DMEM không có huyết thanh Eùp nhiều lần để phá vỡ mô và đẩy tế bàolách ra Thu dịch nổi bên trên có tế bào lách vào falcon 50ml

+ Bằng đĩa petri: Không cắt vụn mô lách Chứa khoảng 5ml môi trường

DMEM không có huyết thanh trong đĩa petri Sử dụng 2 đũa thuỷ tinh đểgiữ, cắt một đầu lách , vuốt đẩy tế bào lách ra ngoài môi trường Thu dịchmôi trường có tế bào máu (các loại) vào falcon 50 ml

 Cả hai phương pháp trên đều thu hỗn hợp dịch môi trường + dịch mô + cáctế bào máu