ứng dụng của enzyme trong y học

Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CNSH - KTMT NHÓM: ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC BÀI BÁO: Anti-inflammatory activity of a sulfated polysaccharide isolated from an enzymatic digest of brown seaweed Sargassum horneri in RAW 264.7 cells BÀI TIỂU LUẬN MÔN: CÔNG NGHỆ ENZYME GVHD: ĐỖ THỊ HIỀN TPHCM, ngày tháng năm 2017 Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền GIỚI THIỆU Các macrophages(Đại thực bào (tiếng Anh: "macrophage") tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng hệ miễn dịch không đặc hiệu hệ miễn dịch đặc hiệu động vật có xương sống Vai trò chúng thực bào thành phần cặn bã tế bào tác nhân gây bệnh) đóng vai trò quan trọng phản ứng viêm thông qua việc giải phóng yếu tố viêm khác nitric oxide (NO), Prostaglandins( (PG) acid béo không bão hòa mô, có vai trò chất trung gian hóa học trình viêm cảm nhận đau, có tác dụng sinh lý mô riêng biệt), enzym tổng hợp oxi nitric (iNOS), cyclooxygenase (COX) -2 cytokine yếu tố hoại tử khối u (TNF - tumor necrosis factor) Α interleukin (IL) -6 [1,2] Đặc biệt, đại thực bào kích thích cytokine pro-inflammatory endotoxin lipopolysaccharide (LPS) gây phản ứng viêm [1] Ngoài ra, chứng minh trình viêm, phát triển bất thường NO prostaglandin E2 (PGE2)(PGE loại tan môi trường Ether đặc biệt PGE2 giải phóng kích thích học, hóa học, nhiệt, vi khuẩn có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch gây viêm đau.) kích hoạt iNOS COX-2 biết đến hai chất trung gian gây viêm pleiotropic điều hòa tập trung tiểu cầu, thấm qua mạch Sự hình thành thrombus(một cục máu đông gậy để tường mạch máu quan Đôi thrombus cản trở tàu Điều có hại ngăn chặn dòng chảy máu.) [2] Ngoài ra, kích thích LPS điều chỉnh biểu COX-2 iNOS chất tiết TNF-α, IL-1β, IL-6 biết đến cytokine Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền pro-inflammatory kích hoạt yếu tố hạt nhân-kB (NF-κB) (MAPK) gọi phân tử thượng lưu [2,3] Do đó, việc ức chế chất trung gian gây viêm cytokine cách tiếp cận hữu ích để điều trị bệnh viêm Môi trường biển xem kho tàng vô giá hợp chất hoạt tính sinh học chúng có biến thể hóa học sinh học lớn [4] Trong số sinh vật biển nghiên cứu, rong biển nâu có nhiều hợp chất với nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm phản ứng chống viêm, chống oxy hóa, chống vi khuẩn bảo vệ thần kinh [5] Các nghiên cứu in vitro in vivo gần cho thấy polysaccharides phân lập từ tảo biển có khả điều trị tuyệt vời chống lại phản ứng viêm [6] Việc cô lập hợp chất hoạt tính sinh học từ rong biển phụ thuộc nhiều vào điều kiện chiết xuất Tuy nhiên, lượng lớn polysaccharides rong biển hoạt động rào cản vật lý hạn chế việc sử dụng phương pháp chiết xuất hóa học khí truyền thống Do đó, phương pháp chiết xuất có hỗ trợ enzyme (EEMs) tiêu hóa thành tế bào thường sử dụng để cô lập hợp chất có hoạt tính sinh học từ rong biển [7] Các chiết xuất enzyme cho thấy tính an toàn thực phẩm tăng lên tính hòa tan nước so với chất chiết xuất dung môi hữu cơ, lợi sử dụng EEMs bổ sung vào dung môi chiết [8] Sargassum horneri (S horneri) loài tảo nâu ăn được, phát triển khu vực bãi triều loài hàng năm dọc theo bờ biển Trung Quốc, Nhật Bản Hàn Quốc Thân hình S horneri đạt chiều dài m trọng lượng tươi kg [9] Các báo cáo trước S horneri bao gồm vitamin, axit amin polysaccharides sử dụng nguồn thực phẩm thành phần y học cổ truyền Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền hàng ngàn năm nước châu Á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản Trung Quốc [10,11 ] Theo báo cáo trước đây, polysaccharide sulfate số chất chiết xuất từ S horneri gây đặc tính sinh học mạnh mẽ điều kiện in vitro tính chất chống oxy hoá chống ung thư [12] Tuy nhiên, có thông tin khả chống viêm polysaccharides phân lập từ chủng S horneri Trung Quốc chế sinh học Hơn nữa, vài năm gần đây, số lượng lớn S horneri di chuyển vào bờ biển đảo Jeju từ bờ biển phía đông Trung Quốc gây thiệt hại đáng kể ngành đánh bắt cá vẻ đẹp bờ biển xung quanh đảo Jeju Tại thời điểm này, việc sử dụng S horneri quan trọng để giải vấn đề Hàn Quốc gây từ rong biển Vì vậy, nghiên cứu này, chuẩn bị loại polysaccharides thô từ chủng S horneri China cách sử dụng bốn loại enzyme thực phẩm bao gồm amyloglucosidase (AMG), Celluclast, Viscozyme Alcalase đánh giá hoạt động chống viêm chế sinh học chúng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU S horneri Trung Quốc thu thập từ tháng đến tháng năm 2015, dọc theo bờ biển đảo Jeju Hàn Quốc S horneri Trung Quốc Viện nghiên cứu đa dạng sinh học Jeju (Jeju, Hàn Quốc) xác định 2.2 HÓA CHẤT Dòng tế bào macrophage RAW 264.7 mua từ Ngân hàng Dòng Tế Bào (KCLB, Seoul, Hàn Quốc) Chất trung gian Eagle cải tiến Dulbecco (DMEM), penicillin-streptomycin huyết bào thai bò (FBS) mua từ Gibco BRL (Burlington, ON, Canada) Các sản phẩm Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền mua lại dạng bột KBr FT-IR, 3- (4, 5-dimetylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), fucoidan (sản phẩm F5631-1G) Từ Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Hoa Kỳ) Ba enzyme phân hủy carbohydrate (AMG, Celluclast, Viscozyme) protease (Alcalase) mua Novo Nordisk (Bagsvaerd, Đan Mạch) Các dụng cụ ELISA cho TNF-α, IL-1β PGE2 mua từ R & D Systems Inc (Minneapolis, MN, USA) Tất hóa chất thuốc thử khác sử dụng thí nghiệm thuộc nhóm phân tích 2.3 PHƯƠNG PHÁP 2.3.1 CHUẨN BỊ CÁC ENZYME TIÊU HÓA S HORNERI Các mẫu S horneri đông khô đồng với máy xay để thu bột mịn Các phản ứng thủy phân enzyme thực cách sử dụng phương pháp Heo et al [số 8] Tóm lại, g bột S horneri ủ 100 mL nước cất (DW) với 20 μl 20 mg AMG, Celluclast, Viscozyme, Alcalase nhiệt độ độ pH tối ưu Heo cộng mô tả [số 8] Sau 24 giờ, mẫu ly tâm 2.774 × g 10 phút dịch bề mặt lọc với Watman No.4 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Anh) Sau đó, dịch bề mặt làm khô đông lạnh sử dụng làm enzym tiêu hóa 2.3.2 TÁCH CÁC POLYSACCHARID THÔ TỪ ENZYME TIÊU HÓA Các polysaccharides thô điều chế từ bốn chất chiết xuất từ enzyme theo phương pháp Shao et al [13] với số thay đổi nhỏ Tóm lại, enzyme tiêu hóa trộn với 95% ethanol đến nồng độ cuối 66% Hỗn hợp bảo quản ℃ 24 giờ, sau chất kết tủa Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền thu nhận cách ly tâm 10.000 xg 20 phút ℃ Các kết tủa làm khô đông lạnh sử dụng làm polysaccharides thô (CPs) Các CPs đông khô giải thể PBS để sử dụng thí nghiệm Các CP tách từ bốn loại enzym tiêu hóa với AMG, Celluclast, Viscozyme, Alcalase định sau AMGCP, polysaccharides thô từ trình tiêu hoá enzym AMG; CCP, polysaccharides thô từ trình tiêu hoá enzyme Celluclast; VCP, polysaccharides thô từ trình tiêu hóa enzyme Viscozyme; AlCP, polysaccharides thô từ trình tiêu hóa enzyme Alcalase 2.3.3 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC Tổng hàm lượng polysaccharide đo phương pháp axit phenol sulfuric mô tả phương pháp mô tả DuBois et al [14] sử dụng glucose làm chuẩn Tổng hàm lượng phenol định lượng cách sử dụng hệ thức mô tả Chandler Dodds [15] Bằng cách sử dụng axit gallic làm chuẩn Hàm lượng protein tất mẫu định lượng cách sử dụng xét nghiệm Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) sử dụng albumin huyết bò theo tiêu chuẩn Cuối cùng, hàm lượng sulfat CP kiểm tra phương pháp BaCl2 gelatin Na2SO4 theo tiêu chuẩn mô tả Saito cộng [16] với thay đổi nhỏ Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Các phổ hồng ngoại CP ghi lại quang phổ FT-IR (quang phổ Nicolet ™ 6700 FT-IR, Madison, WI, USA) Các CPs đồng với bột KBr sau ép thành viên để đo FT-IR dải tần số 500-4000 cm-1 2.3.4 NUÔI CẤY TẾ BÀO Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy DMEM bổ sung 10% FBS không hoạt hóa, 1% streptomycin (100 μg / mL) penicillin (100 đơn vị / mL) Các tế bào RAW 264.7 ấp 5% CO2 37 ℃ (Vườn ươm Sanyo MCO-18AIC CO2, Moriguchi, Nhật Bản) Các tế bào nuôi cấy từ đoạn 4-6 sử dụng cho thí nghiệm 2.3.5 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CỦA TẾ BÀO Các cytotoxicity CPs để RAW 264,7 tế bào đánh giá thông qua thử nghiệm MTT colorimetric mô tả Mosmann [17], với sửa đổi nhỏ Tóm lại, tế bào (1 x 105 tế bào / mL) gieo 24 giếng ủ 24 Sau đó, tế bào điều trị CP (50 μg / mL 100 μg / mL) 24 Thuốc thử MTT (200 μg / mL) thêm vào giếng Sau ủ, tinh thể formasan hòa tan DMSO, lượng formazan xanh-đen xác định cách đo độ hấp thụ 540 nm Mật độ quang phổ formazan tạo tế bào kiểm soát không điều trị coi đại diện cho khả sống sót 100% Dữ liệu biểu diễn dạng phần trăm trung bình tế bào khả thi so với kiểm soát tương ứng Xác định sản xuất NO Để xác định hiệu CP việc sản xuất NO tế bào RAW 264.7 kích thích LPS, thực khảo nghiệm griess Leiro et al [18] với thay đổi nhỏ Tóm lại, tế bào (1 x 10^5 tế bào / ml) gieo hạt 24 giếng ủ 24 Sau đó, tế bào điều trị với CPs (50 μg / mL 100 μg / mL) kích thích với LPS (1 μg / mL) 24 Cuối cùng, dung dịch nuôi cấy chất thử Griess phản ứng 96 giếng 10 phút, độ hấp thụ đo 540 nm sử dụng máy đọc ELISA (BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA) Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền Mật độ quang học NO sản xuất tế bào điều trị LPS coi đại diện cho 100% Dữ liệu biểu diễn dạng tỷ lệ phần trăm trung bình sản xuất NO so với sản xuất NO tế bào điều trị LPS Xác định sản xuất PGE2 Prostaglandins( (PGE2) acid béo không bão hòa mô, có vai trò làm giảm thành mạch, tăng tính thấm thành mạch, gây viêm đau có tác dụng sinh lý mô riêng biệt) đóng vai trò quan trọng việc điều chỉnh phản ứng viêm [19] Các tế bào RAW-264.7 nuôi cấy điều chỉnh với nồng độ (1 x 105 tế bào / ml) polysaccharide đo được, sau ủ, tế bào kích thích với LPS (1 μg / mL) Sau 24 ủ, nồng độ PGE2 chất lên định lượng cách sử dụng thử miễn dịch enzyme cạnh tranh, theo hướng dẫn nhà sản xuất Đo lường sản xuất TNF-α IL-1β Tế bào RAW 264.7 (1 x 105 tế bào / giếng) xử lý trước CCP (25 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL) ủ với LPS (1 μg / mL) 24 Các mức sản xuất TNF-α IL-1β tế bào chất macrophage định lượng dụng cụ ELISA, theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3.6 PHÂN TÍCH WESTERN BLOT Để xác định hiệu CCP mức biểu protein iNOS, COX-2, NF-κB, MAPK tế bào RAW 264.7 kích thích LPS, việc phân tích Western blot thực Tóm lại, tế bào RAW 264.7 (1 x 105cells / mL) gieo 6-giếng ủ 24 Các tế bào điều trị CCP (25 μg / mL, 50 μg / mL 100 μg / mL) Và sau đó, tế bào kích thích với LPS (1 μg / mL) 10 phút 20 phút 24 Các protein nucleic cytosolic chiết xuất từ tế bào Ứng dụng enzyme y học Công nghệ Enzyme GVHD: Đỗ Thị Hiền chiết xuất hạt nhân tế bào chất NE-PER® (Thermo scientific, Rockford, USA) Sau tách gel SDS-polyacrylamide 10% điều kiện biến tính, protein tế bào chất (40 μg) truyền điện màng nitrocellulose Sau chặn sữa non 5% giờ, blot ủ riêng với kháng thể sau đây: kháng thể polyclonal thỏ (iNOS, p44 / 42 (ERK, kinase điều hoà tín hiệu ngoại bào), phosphoryl hóa p44 / 42 (ERK), P38, phosphoryl hóa p38, NF-κB p65, NF-κB p50, nucleolin), kháng thể đơn dòng chuột (COX-2, β-actin) (Công nghệ báo hiệu tế bào, Beverly, MA, USA) Các blot rửa hai lần với Tween 20 / dung dịch đệm Tris (TTBS) sau ủ với IgG liên hợp HRP IgG chống lại thỏ 45 phút Sự liên kết kháng thể hình dung cách sử dụng thuốc thử hóa học tăng hóa học (ECL) (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) Nồng độ bazơ protein bình thường hoá cách phân tích mức độ protein β-actin nucleolin cách sử dụng chương trình ImageJ 2.3.7 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Tất liệu thể giá trị trung bình ba thí nghiệm Các liệu thu thập được, phân tích cách sử dụng phần mềm phân tích thống kê SPSS v20 Các giá trị trung bình thí nghiệm so sánh cách sử dụng phương pháp phân tích chiều Phép kiểm định Duncan (DMRT) sử dụng để so sánh cặp nghiệm thức tìm khác biệt trung bình Một giá trị P