KHẢO SÁT CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP TỪ MÁU BỆNH NHÂN SỬ DỤNG THUỐC ỨC CHẾ MIỄN DỊCH

HỒ CHÍ MINH Võ Thị Ngọc Tâm KHẢO SÁT CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP TỪ MÁU BỆNH NHÂN SỬ DỤNG THUỐC ỨC CHẾ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2012... HỒ CHÍ MINH Võ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Võ Thị Ngọc Tâm

KHẢO SÁT CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP TỪ MÁU BỆNH NHÂN SỬ DỤNG THUỐC ỨC CHẾ MIỄN DỊCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Võ Thị Ngọc Tâm

KHẢO SÁT CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP TỪ MÁU BỆNH NHÂN SỬ DỤNG THUỐC ỨC CHẾ MIỄN DỊCH

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS TRẦN PHỦ MẠNH SIÊU

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu trên là do tôi thu thập và

xử lý trong thời gian làm luận văn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ - Bác sĩ Trần Phủ Mạnh Siêu, người đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn.Thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy cô trong khoa Sinh Trường Đại Học

Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, Cử nhân sinh học Nguyễn Thị Quỳnh Nga cùng toàn thể các anh chị kỹ thuật viên khoa xét nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Phòng Khoa học Công nghệ -Sau đại học Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn hoàn thành đúng tiến độ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ VI NẤM 3

1.1 Giới thiệu về hình dạng và đặc điểm sinh học 3

1.1.1 Hình dạng 3

1.1.2 Đặc tính nuôi cấy của vi nấm 3

1.1.2.1 Dinh dưỡng 3

1.1.2.2 Nhiệt độ ủ 3

1.1.2.3 Tốc độ mọc 3

1.1.2.4 Hi ện tượng biến hình (pleomorphism) 3

1.1.2.5 Hi ện tượng nhị độ ( hiện tượng lưỡng hình) 4

1.1.3 Sinh sản 4

1.2 Vi nấm gây bệnh 4

1.2.1 Vi nấm ngoài da 4

1.2.2 Vi nấm ngoại biên 4

1.2.3 Vi nấm nội tạng 4

1.3 Giới thiệu vi nấm cơ hội 5

1.3.1 Vi nấm cơ hội 5

1.3.2 Các chủng vi nấm cơ hội thường gặp 5

1.3.2.1 Candida spp 5

1.3.2.2.Cryptococcus neoformans 7

1.3.2.3 Trichosporon asahii 8

1.3.2.3.Penicillium marneffei 9

1.3.2.4.Histoplasma capsulatum 10

1.3.2.5 Aspergergillus spp 11

1.4 Đặc điểm các loại thuốc điều trị bệnh nấm hiện nay [67] 12

1.4.1 Amphotericin B (Fungizone) 12

1.4.2 Ketoconazole (Nizoral) 12

1.4.3 Nystatin 12

1.4.4 Fluconazole 13

1.4.5 5- Fluorocytosine 13

1.4.6 Clotrimazole 13

1.5 Các bệnh lý cần điều trị với thuốc ức chế miễn dịch [68], [69] 13

1.5.1 Các bệnh lý cần điều trị với thuốc ức chế miễn dịch 13

1.5.2 Thuốc ức chế miễn dịch 14

1.5.3 Các loại thuốc ức chế miễn dịch 14

1.5.3.1 Corticosteroids 14

1.5.3.2 Azathioprine 14

1.5.3.3 Mycophenolate mofetil 14

1.5.3.4 Cyclosporine 15

1.5.3.5 Methotrexate 15

1.3.5.6 Hydroxyurea 15

1.6 Tình hình nghiên cứu các bệnh nhân sử dụng thuốc ức chế miễn dịch 15

1.6.1.Trên thế giới 15

1.6.1.1.Về tỷ lệ nhiễm vi nấm 15

1.6.1.2 Về tỷ lệ phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 15

1.6.1.3 Về tỷ lệ vi nấm phân lập được trên những mẫu cấy nấm dương tính 16

1.6.1.4 Về tỷ lệ chẩn đoán theo từng loại bệnh lý 17

1.6.1.5 Về tỷ lệ chẩn đoán theo tác nhân gây bệnh 17

1.6.1.6 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm (MIC) 18

1.6.2 Tại Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2 1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Dụng cụ 20

2.1.4 Thiết bị 21

2.1.5 Các môi trường sử dụng 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3 Các kĩ thuật dùng trong nghiên cứu 22

2.3.1 Cấy máu 22

2.3.2 Kỹ thuật nhuộm Gram 23

2.3.3 Kỹ thuật cấy phân lập các vi nấm trên môi trường Sabouraud (MT1) 24

2.3.4 Kỹ thuật soi khúm nấm sau khi cấy bằng lactophenol cotton blue (LPCB) 24

2.3.5 Kỹ thuật định danh các vi nấm 25

2.3.5.1 Kỹ thuật định danh các chủng Candida trên môi trường Chrom agar (MT2) 25

2.3.5.2 Kỹ thuật định danh bằng các phản ứng đồng hóa đường trên bộ kit API 20C AUX( MT3) 25

2.3.5.3 Tóm tắt quá trình phân lập và định danh các chủng nấm men như sau: 27

2.3.6 Kỹ thuật khảo sát độ nhạy cảm của các loại thuốc kháng nấm 28

2.3.7 Kỹ thuật bảo quản các chủng vi nấm 29

2.3.7.1 Bảo quản các chủng vi nấm bằng nước cất (ở nhiệt độ thường) 29

2.3 7.2 Bảo quản bằng dung dịch BHI-glyxerol (ở nhiệt độ -20 0 C) 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Tỷ lệ cấy dương tính 33

3.2 Đặc điểm cỡ mẫu 34

3.3 Tỷ lệ phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 35

3.4 Tỷ lệ chẩn đoán theo từng loại bệnh lý 36

3.5 Tỷ lệ vi nấm phân lập được 38

3.6 Tỷ lệ chẩn đoán theo tác nhân gây bệnh 43

3.7 Độ nhạy cảm của thuốc với các chủng vi nấm 44

3.7.1 Độ nhạy cảm với thuốc của Candida tropicalis 45

3.7.2 Độ nhạy cảm với thuốc của Candida albicans 47

3.7.3 Độ nhạy cảm với thuốc của Candida utilis 48

3.7.4 Độ nhạy cảm với thuốc của Trichosporon asahii 48

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Tỷ lệ cấy dương tính 33

Bảng 3.2 Đặc điểm cỡ mẫu 34

Bảng 3.3 Tỷ lệ phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 35

Bảng 3.4 Tỷ lệ chẩn đoán theo từng loại bệnh lý 36

Bảng 3.5 Tỷ lệ vi nấm phân lập được 38

Bảng 3.6 Tỷ lệ chẩn đoán theo tác nhân gây bệnh 43

Bảng 3.7.1 Độ nhạy cảm với thuốc của Candida tropicalis 45

Bảng 3.7.2 Độ nhạy cảm với thuốc của Candida albicans 47

Bảng 3.7.3 Độ nhạy cảm với thuốc của Candida utilis 48

Bảng 3.7.4 Độ nhạy cảm với thuốc của Trichosporon asahii 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Candida spp với dạng ovan và sợi tơ nấm giả (x100) 6

Hình 1.2 Khuẩn lạc Penicillium marneffei trên MT Sabouraud 9

Hình 1.3 Hình thể của nấm Aspergillus fumigatus (x40) nuôi cấy trong MT Sabouraud ở nhiệt độ phòng 11

Hình 2.1 Chai cấy máu 21

Hình 2.2 Bộ kit API 20C AUX 22

Hình 3.1: Cấu tạo vi thể và đại thể của một số chủng nấm men Candida spp 30

Hình 3.2: Khuẩn lạc Candida tropicalis trong MT Sabouraud 31

Hình 3.3: Khuẩn lạc Candida tropicalis trong MT Chrom agar 31

Hình 3.4: Khuẩn lạc Candida utilis trong MT Sabouraud 31

Hình 3.5: Khuẩn lạc Candida utilis trong MT Chrom agar 31

Hình 3.6: Khuẩn lạc Trichosporon asahii trong MT Sabouraud 32

Hình 3.7: Khuẩn lạc Trichosporon asahii trong MT Chrom agar 32

Hình 3.8: Hình dạng vi thể của Trichosporon asahii khi nhuộm LPCB dưới kính hiển vi (x100 32

Hình 3.9: Hình dạng vi thể của Candida spp khi nhuộm LPCB dưới kính hiển vi (x40) 32

Hình 3.10: Độ nhạy với thuốc của Candida albicans 44

Hình 3.11: Độ nhạy với thuốc của Candida tropicalis 44

Hình 3.12: Độ nhạy với thuốc của Candida tropicalis 45

MỞ ĐẦU

Nhiễm trùng máu do vi nấm gây ra ngày càng trở nên quan trọng kèm theo thời gian nằm viện kéo dài và tỷ lệ tử vong cao.Trong 20 năm qua có sự gia tăng mức độ nặng của bệnh ở những bệnh nhân nhập viện, do sử dụng rộng rãi các xét nghiệm và thiết bị y tế xâm lấn, do các tác nhân kháng khuẩn phổ rộng Hơn nữa, sự tiến bộ trong kỹ thuật y tế hiện nay, bệnh nhân ung thư được điều trị tích cực hơn với tác nhân hóa trị liệu mạnh và cấy ghép, dẫn đến giảm bạch cầu trung tính nhiều hơn, gây tổn thương niêm mạc Những bệnh nhân này cũng được điều trị bằng phác

đồ kháng sinh thường xuyên hơn và kéo dài, có xu hướng ngăn chặn các vi khuẩn thường trú Tất cả các yếu tố trên dẫn đến gia tăng tỷ lệ nhiễm nấm bệnh viện, làm gia tăng đáng kể các bệnh nhiễm vi nấm xâm lấn gây ra bởi các vi nấm cơ hội như :

Candida spp, Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp, Penicillium marneffei

Tại Bệnh viện Truyền máu huyết học thành phố Hồ Chí Minh, các bệnh nhân

bị các bệnh lý huyết học được chỉ định điều trị bằng các loại thuốc khác nhau trong

đó có thuốc ức chế miễn dịch Phần lớn các bệnh nhân thường bị sốt cao, không đáp ứng với các kháng sinh nhưng không tìm ra được nguyên nhân gây bệnh Vì vậy cần phải tiến hành cấy máu để xác định chính xác tác nhân gây bệnh để có hướng

chẩn đoán và điều trị kịp thời

Hiện nay, vẫn chưa có một nghiên cứu tổng thể về tỷ lệ nhiễm vi nấm của các bệnh nhân này tại Việt Nam Do đó cần thiết phải có một nghiên cứu ban đầu về các loại bệnh nhiễm vi nấm cơ hội, các tác nhân gây bệnh hay gặp trên các bệnh nhân suy giảm miễn dịch mắc phải do sử dụng thuốc điều trị bệnh lý huyết học Qua đó

sẽ có thông tin bổ ích cho cán bộ xét nghiệm để áp dụng kỹ thuật xử lý thích hợp đồng thời giúp các bác sĩ lâm sàng cho chỉ định điều trị kịp thời Từ đó giảm thiểu khả năng bỏ sót bệnh, giúp phát hiện sớm và điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân

Mục tiêu đề tài

Xác định các chủng vi nấm gây bệnh trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch không phải HIV/AIDS và xác định độ nhạy của các loại vi nấm phân lập được với các thuốc kháng nấm hiện hành

Nhiệm vụ của đề tài

- Phân lập và định danh các chủng vi nấm trên bệnh phẩm cấy máu

- Thực hiện kháng nấm đồ đối với các chủng vi nấm phân lập được

Đối tượng

Các mẫu máu của bệnh nhân từ Bệnh viện Truyền máu huyết học

Thời gian, địa điểm, phạm vi nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 11- 2010 đến tháng 10 – 2011

- Địa điểm: Phòng xét nghiệm vi nấm Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Thành phố

Hồ Chí Minh

- Phạm vi nghiên cứu: Bệnh phẩm cấy máu của các bệnh nhân từ Bệnh viện

Truyền máu huyết học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ VI NẤM

1.1 Gi ới thiệu về hình dạng và đặc điểm sinh học

Là những vi sinh vật có vách tế bào và nhân điển hình, chia làm hai nhóm vi nấm: nấm sợi (moulds) và nấm men (yeasts) [2], [4]

1.1.1 Hình d ạng

N ấm men: là những tế bào nhỏ, hình cầu hay elip, đường kính vào khoảng 5µm

đến 10µm Khi cấy trên môi trường thí nghiệm, nấm men sẽ tạo nên những khúm phẳng, tròn, có thể có màu sắc, có thể bóng hoặc đục mờ và nhỏ hơn khúm của nấm sợi

N ấm sợi : là những sợi tơ nhỏ, dài, mảnh, đường kính 5µm đến 10µm Bên

trong sợi tơ là nguyên sinh chất và nhân, có thể có hoặc không có vách ngăn [4], [6]

1.1.2 Đặc tính nuôi cấy của vi nấm

1.1.2.1 Dinh dưỡng

Các vi nấm rất dễ nuôi cấy Để có thể mọc được, các vi nấm cần: một nguồn hydrat carbon, một nguồn đạm hữu cơ hoặc vô cơ (nitrat, ammonium…), một ít muối khoáng: P, K, Mn, Ca, S…,nước

Các vi nấm hoại sinh thường mọc nhanh hơn vi nấm sinh bệnh[4]

1.1.2.4 Hi ện tượng biến hình (pleomorphism)

Các vi nấm gây bệnh khi để lâu hoặc khi cấy chuyển nhiều lần, khúm chỉ còn

là một đám sợi tơ màu trắng, các bào tử biến mất nên không còn đủ yếu tố để định danh Ví dụ: trường hợp của Epidermophyton floccosum, Microsporum canis [4]

1.1.2.5 Hi ện tượng nhị độ ( hiện tượng lưỡng hình)

Một số vi nấm gây bệnh khi cấy lên môi trường giàu chất dinh dưỡng, ủ ở

37oC hoặc khi ở cơ thể ký chủ, vi nấm có dạng hình cầu, elip Khi cấy lên môi trường nghèo chất dinh dưỡng, ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm hoặc khi ở ngoại

cảnh, vi nấm có dạng sợi tơ Ví dụ: trường hợp Histoplasma capsulatum, Sporothrix

schenchii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides braziliensis [4]

1.1.3 Sinh sản

Sinh sản bằng nẩy chồi (nẩy búp): đặc trưng cho nấm men

Sinh sản bằng bào tử vô tính hoặc hữu tính: đặc trưng cho nấm sợi[4]

Bệnh do các loài nấm men gây ra như Cryptococcus spp, Candida spp

Bệnh do nấm sợi gây ra như Aspergillus spp, Penicillium marneffei,

Rhinosporidium…[8]

1.3 Gi ới thiệu vi nấm cơ hội

1.3.1 Vi n ấm cơ hội

Là những loài nấm trong điều kiện bình thường không gây bệnh Chúng chỉ gây bệnh ở những người có hệ miễn dịch yếu như trẻ sơ sinh, người già, người bị bệnh ung thư, phụ nữ có thai, bệnh nhân sau phẫu thuật…hay tình trạng suy giảm miễn dịch mắc phải như bệnh nhân HIV/AIDS [4]

Các yếu tố tạo nên suy giảm miễn dịch mắc phải không do HIV/AIDS

 Yếu tố trong cơ thể

Về sinh lý (độ tuổi): người già, trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai

Về bệnh lý:

- Suy dinh dưỡng, sinh thiếu tháng

- Rối loạn chức năng chuyển hóa như tiểu đường

- Các bệnh lý làm suy giảm miễn dịch như bệnh ung thư, bệnh bạch cầu cấp hoặc mãn.…

Các tế bào hình cầu, elip, đường kính 3-5 µm

Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi Trong những điều kiện nhất định, chúng

sẽ tạo ra sợi tơ nấm giả Sợi tơ nấm không màu sắc, có nhiều vách ngăn rộng từ 3-5

µm, đôi khi chỉ thấy sợi tơ mà không thấy tế bào hình cầu

Khi nuôi cấy trên thạch Sabouraud tạo thành khuẩn lạc hình tròn, đường kính

từ 1-3 mm, trắng, đục mờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và 35o

C

Bệnh do vi nấm Candida spp có thể là bệnh ngoài da, có thể là bệnh kinh niên

ở móng, bệnh ở miệng, họng, âm đạo hay bệnh nội tạng thường gây tỷ lệ tử vong cao khi vào phổi, tim hay cơ quan khác

Tác nhân gây bệnh Candida spp quan trọng nhất là Candida albicans Các loại

Candida spp khác cũng có thể gây bệnh nhưng hiếm hơn[8], [9]

b Dịch tễ học

Chủng vi nấm Candida albicans và một số loài Candida spp khác là các loại nấm sống hoại sinh trên cơ thể người Bệnh nấm Candida spp là bệnh phổ biến duy

nhất do loại nấm thường xuyên cư trú trên người gây ra

Bệnh do Candida spp được coi là loại bệnh có nguồn gốc nội sinh Tuy nhiên

một số dạng bệnh được xếp vào nhóm bệnh lây truyền qua đường tình dục Một số

nấm Candida spp thường lây nhiễm qua kim tiêm hoặc các dụng cụ y tế

Bệnh nhân bị lao, ung thư, nhổ răng, phẫu thuật, đái tháo đường, nghiện thuốc,

có thai, đặt catheter, dùng kháng sinh kéo dài đặc biệt là điều trị bằng steroid, bệnh

Hình 1.1 Candida spp với dạng cầu và sợi tơ nấm giả

(x100) (nguồn từ BV Bệnh nhiệt đới)

nhân HIV/AIDS, giảm đáp ứng miễn dịch, rối loạn di truyền rất dễ mắc bệnh nấm

Candida spp [6]

c Tỷ lệ nhiễm

Theo Chai YL và cộng sự, năm 2007, tại Singapore, khi nghiên cứu sự nổi

trội của vi nấm Candida tropicalis trong máu tại Đại học Singapore, trong 52 ca nhiễm vi nấm, Candida tropicalis chiếm 36%, Candida albicans chiếm 29%,

Candida parapsilosis chiếm 21% [20] Theo Mokaddas EM và cộng sự, năm 2007, tại Đại học Kuwait, Safat, Kuwait, khi nghiên cứu sự phân bố và khả năng kháng vi

nấm Candida phân lập từ máu của bệnh nhân ở Kuwait, phân tích 607 mẫu máu phân lập trong 10 năm tại Kuwait, Candida albicans chiếm 39.5%, Candida

parapsilosis chiếm 30.6%, Candida tropicalis chiếm 12.4% [41] Theo Saikat Basu

và cộng sự, năm 2011, tại Ấn Độ, đặc điểm sinh học của Candida tropicalis phân

lập từ các bệnh nhân của khoa hồi sức cấp cứu, khi phân lập vi nấm trong máu,

Candida tropicalis chiếm 5/10 (50%), Candida albicans chiếm 3/10 (30%) ,

Candida glabrata chiếm 2/10 (20%) [52] Theo Pagano L và cộng sự, năm 2006 tại Rome - Ý trong nghiên cứu 2004 về dịch tễ học nhiễm nấm ở bệnh nhân u ác tính

có bệnh lý huyết học, Candida spp chiếm 91%, Trichosporon spp chiếm 4%

[46].Theo Ray Hachem MD và cộng sự, năm 2008, tại Houston, Texas, sự thay đổi

dịch tễ học của nhiễm Candida trong máu, trong 281 ca nhiễm Candida spp từ các bệnh nhân bệnh huyết học ác tính, Candida albicans chiếm 14%, Candida

Sinh sản bằng cách nảy búp (nẩy chồi)

Là vi nấm đơn độ có dạng tròn khi ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm hay ở 35o

C Sau 2-3 ngày ủ tạo thành những khuẩn lạc nhỏ, nhẵn bóng, hình tròn, màu ngà

Cryptococcus neoformans cho phản ứng urease dương, môi trường đổi màu

hồng ít giờ sau, còn Candida albicans thì cho phản ứng urease âm

Gây bệnh ở một số cơ quan trong cơ thể như: màng não, máu, phổi, da, nguy hiểm nhất là bệnh viêm màng não nấm [8], [9]

b Dịch tễ học

Có nhiều loài nấm Cryptococcus neoformans nhưng chỉ có Cryptococcus

neoformans gây bệnh cho người

Cryptococcus neoformans phát triển trong đất, đặc biệt là ở phân chim bồ câu

Bệnh nấm Cryptococcus neoformans trước đây rất hiếm gặp Cryptococcus spp xảy

ra ở bệnh nhân mắc AIDS, u lympho, bệnh bạch cầu… Bệnh viêm màng não do

nấm Cryptococcus neoformans là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở bệnh nhân

HIV/AIDS [4], [9]

c Tỷ lệ nhiễm

Theo Pagano L và cộng sự, năm 2006, nghiên cứu SEIFEM-2004 về dịch tễ

học nhiễm nấm ở bệnh nhân u ác tính huyết học, Crypyococus spp chiếm 8/192 trong bệnh AML, Crypyococus spp chiếm 5/8 (62.5%) trong bệnh ALL chiếm

2/8(25), trong bệnh non-Hodgkin´s lymphoma chiếm 1/8(12.5%) [46]

Sống hoại sinh trong ruột Ở người khỏe mạnh có thể gây bệnh trứng tóc trắng

hoặc viêm da Ở người suy giảm miễn dịch có thể gây bệnh toàn thân [4]

Nhiễm trùng phổ biến thường xuyên nhất liên quan đến bệnh bạch cầu, cấy ghép nội tạng, đa u tủy, thiếu máu bất sản, lymphoma, các khối u rắn và AIDS

c T ỷ lệ nhiễm

Theo Watson KC và cộng sự, năm 1970, trong nghiên cứu áp xe não do

Trichosporon cutaneum đã mô tả tác nhân Trichosporon spp lần đầu tiên trong y

văn như một nguyên nhân gây bệnh xâm lấn [63] Theo Tyler E Warkentien và

cộng sự, năm 2009 tại San Diego, trên các bệnh nhân nhiễm Trichosporon trong

máu, có khoảng 400 trường hợp nhiễm Trichosporon spp xâm lấn [61]

1.3.2.3.Penicillium marneffei

a Hình thể

Sinh sản theo cách phân đôi

Penicillium marneffei là vi nấm duy nhất trong loài Penicillium spp có tính nhị

độ Nuôi cấy ở 35oC chúng phát triển giống như dạng nấm men Khuẩn lạc nấm quan sát bằng mắt thường thấy có nếp gấp, không sinh sắc tố màu đỏ Nuôi cấy ở

25oC hay nhiệt độ phòng, chúng phát triển thành dạng mốc, sinh sắc tố đỏ trên môi trường Sabouraud Soi tươi sợi tơ nấm trong LPCB thấy dạng bào tử sắp xếp hình bàn tay

Bệnh do vi nấm Penicillium marneffei còn gọi là bệnh nấm Penicillinosis Đây

là bệnh vi nấm lan toả Người bệnh thường có những tổn thương ở nội tạng và ở da, bệnh nhân sẽ tử vong nếu không điều trị kịp thời bằng thuốc kháng nấm[4]

Hình 1.2 Khuẩn lạc Penicillium marneffei trên môi trường

thạch Sabouraud (tiết sắc tố đỏ làm chuyển màu môi trường)

(nguồn từ BV Bệnh nhiệt đới)

Các vùng dịch tễ của vi nấm này là Miến Điện, nam Trung Quốc, Mã Lai, Indonesia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam Tuy rằng tác nhân này có thể gặp

ở người không suy giảm miễn dịch nhưng việc nhiễm toàn thân thường xảy ra hơn ở những người bị ức chế miễn dịch, đặc biệt là người bị nhiễm HIV/AIDS[4]

1.3.2.4.Histoplasma capsulatum

a Hình thể

Trong sinh thiết mô, Histoplasma capsulatum là những tế bào tròn nhỏ, đường

kính 2-4 µm nằm trong các đại thực bào Tế bào chất co lại tạo thành một khoảng trống giữa vách và tế bào chất, trông tựa như một “bao”

Histoplasma capsulatum là một vi nấm nhị độ

Trên thạch Sabouraud, sau 3-5 ngày ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, vi nấm bắt đầu mọc thành những sợi tơ trắng mịn, nhô lên không khí; sau 1-2 tuần, khúm có đường kính 1 cm, mượt như nhung, màu trắng, hoặc vàng nâu nhạt Xem mảnh khúm nấm dưới kính hiển vi sẽ thấy sợi tơ có vách ngăn và tiểu đính bào tử nhỏ, tròn hay hình quả lê [8], [9]

Bệnh vi nấm Histoplasma gặp ở khắp nơi, từ 45ovĩ độ Bắc đến 30o vĩ độ Nam Bệnh rất phổ biến ở thung lũng sông Mississippi, bệnh nhân thuộc mọi lứa tuổi nhưng thường là trẻ nhỏ, nam nhiều hơn nữ Ở châu Á, người ta đã gặp bệnh tại Ấn

Độ, Thái Lan, Việt Nam, Nhật Bản, Hong Kong, Indonesia và Philippines Càng ngày bệnh càng thấy nhiều hơn ở người AIDS

Histoplasma capsulatum được tìm thấy trong đất có lẫn phân dơi, chim bồ câu,

gà con và có lẽ những động vật khác [4]

c Tỷ lệ nhiễm trong cộng đồng

Tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới TP.HCM, từ năm 1994 đến nay chỉ có hai ca

nhiễm Histoplasma capsulatum

Theo Nguyễn Thị Tố Như, năm 2008, tại Bệnh viện Chợ Rẫy, có 2 ca nhiễm Histoplasma ở bệnh nhân có tiền căn lao phổi [7]

1.3.2.5 Aspergergillus spp

a Hình thể

Là những sợi tơ có vách ngăn, rộng khoảng 4-5 µm, nhiều nhánh, nhánh và sợi

tơ chính thường hợp thành một góc 450 Một số có nhiều bào tử bao dày, có thể rộng đến 10 µm

Là nấm đơn độ, khi ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm hoặc 350

C sau 3-5 ngày sẽ

thấy rõ các khúm Aspergillus spp Tùy theo loại, các khúm sẽ có màu sắc khác nhau

nhưng đều có vòng trắng viền quanh

Có khoảng 100 loài Aspergillus, đa số sống hoại sinh trong không khí Nhiều loài có thể xâm nhập da, tai, mắt của người Bệnh nội tạng thường do Aspergillus

fumigatus trong phổi của người [8],[9]

Hình 1.3 Hình thể của nấm Aspergillus fumigatus (x40) nuôi

cấy trong MT Sabouraud ở nhiệt độ phòng (nguồn từ BV Bệnh

nhiệt đới)

b Dịch tễ học

Các thể bệnh do Aspergillus spp xảy ra khắp nơi trên thế giới Bệnh thường

làm cho bệnh nhân tử vong Thể bệnh ít gặp ở người khỏe mạnh mà thường thấy ở người bị suy nhược như người già, người đã mắc một bệnh nặng, nhất là những người được điều trị lâu ngày bằng kháng sinh [4]

c Tỷ lệ nhiễm trong cộng đồng

Theo Kume H và cộng sự tại Khoa Bệnh học, trường Đại học Y Kitasato, Sagamihara, Kanagawa, Nhật Bản năm 2006 khi nghiên cứu về dịch tễ học của nấm

nội tạng ở bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu và loạn sản tủy , tỷ lệ nhiễm Aspegillus

spp chiếm 54.2%[35] Theo Pagano L và cộng sự năm 2006, nghiên cứu

SEIFEM-2004 về dịch tễ học nhiễm nấm ở bệnh nhân u ác tính huyết học, trong 346 ca

nhiễm nấm mốc Aspergillus spp chiếm 310/346 [46]

1.4 Đặc điểm các loại thuốc điều trị bệnh nấm hiện nay [67]

1.4.1 Amphotericin B (Fungizone)

Là thuốc diệt nấm thuộc nhóm polyen

Tác dụng:

+ làm thành tế bào nấm không dãn ra được

+ làm suy yếu chức năng của màng tế bào dẫn đến thoát các thành phần tế

bào có trọng lượng phần tử thấp ra khỏi tế bào, kết quả là tế bào nấm sẽ chết

+ làm tăng hiệu quả của 5-fluorocytosin (5-FC) do làm tăng khả năng hấp

thụ của 5-FC qua màng tế bào nấm đã bị suy yếu

Cách dùng: dùng đường tĩnh mạch và nội màng trong hầu hết trường hợp bệnh

nấm nội tạng

1.4.2 Ketoconazole (Nizoral)

Là thuốc diệt nấm phổ rộng thuộc nhóm azol

Tác dụng: ức chế quá trình sinh tổng hợp ergosterol, là thành phần cấu tạo chính màng tế bào nấm Thiếu ergosterol, màng tế bào sẽ bị suy yếu, giảm độ hoạt hóa của enzyme liên quan tới màng tế bào và sự tổng hợp chất kitin (chất cần thiết

để sinh tổng hợp thành tế bào nấm)

Cách dùng: dùng tại chỗ hay đường uống, có tác dụng trong bệnh nấm bề mặt, nấm da, bệnh nấm nội tạng

1.4.3 Nystatin

Là loại thuốc kháng nấm nhóm polyen giống amphotericin B

Tác dụng: cản trở quá trình tổng hợp ergosterol của màng tế bào nấm

Cách dùng: điều trị tại chỗ, chỉ định các loài nấm Candida phát triển mạnh

trong hệ tiêu hóa, thực quản, ở da, bộ phận sinh dục Không dùng cho điều trị nấm nội tạng do: thuốc không tan trong nước, không hấp thụ vào mô tế bào, độ độc cao khi dùng ngoài đường tiêu hóa

1.4.4 Fluconazole

Là một loại thuốc kháng nấm phổ rộng mới hơn trong nhóm triazol

Cách dùng: dạng viên uống và dạng dung dịch dùng đường tĩnh mạch Rất hiệu quả trong điều trị nấm men gây bệnh ở niêm mạc và nội tạng, đặc biệt đối với

tưa miệng, bệnh nấm Candida thực quản và bệnh viêm màng não do Cryptococcus

spp

1.4.5 5- Fluorocytosine

Là chất kìm nấm, có thể thấm sâu vào tất cả các dịch lỏng trong cơ thể

Tác dụng: 5-FC ngăn cản sinh tổng hợp acid nucleic, xâm nhập vào tế bào qua phần nội bào, lấy từ trong tế bào khối chất DNA tổng hợp để tạo thành RNA làm ngăn cản việc tổng hợp protein

Cách dùng: thường dùng kèm với amphotericin B đường tĩnh mạch để tăng tác

dụng trong việc điều trị viêm màng não do Cryptococcus spp

1.4.6 Clotrimazole

Là thuốc thuộc nhóm azol, ức chế quá trình sinh tổng hợp ergosterol

Tác dụng: kìm nấm ở nồng độ 10 µg/ml và diệt nấm ở nồng độ cao hơn

Có hiệu quả với lớp nấm da (Dermatophytes), nấm men, nấm sợi, nấm gây bệnh thể

lưỡng tính

Cách dùng: tại chỗ dưới dạng dung dịch 1% hoặc kem bôi

1.5 Các bệnh lý cần điều trị với thuốc ức chế miễn dịch [68], [69]

1.5.1 Các bệnh lý cần điều trị với thuốc ức chế miễn dịch

Bệnh ung thư, ghép tạng, ghép thận, các bệnh tự miễn, bệnh lupus ban đỏ hệ thống, bệnh viêm bì cơ, viêm mao mạch (vasculitis), bệnh vảy nến nặng, vảy nến thể mủ, viêm da cơ địa, viêm bì cơ, viêm da mủ, bệnh lichen da và niêm mạc, bệnh thượng bì bọng nước bẩm sinh, rụng tóc thành mảng, xơ cứng bì thành dải v.v…

1.5.2 Thuốc ức chế miễn dịch

Là các thuốc làm giảm hoạt động của hệ miễn dịch của cơ thể Thuốc ức chế miễn dịch được sử dụng sau phẫu thuật ghép cơ quan để tránh sự thải bỏ cơ quan ghép, cũng dùng để ngăn sự tiến triển của bệnh tự miễn (hệ miễn dịch của cơ thể tấn công vào chính mô của nó) khi các cách điều trị khác không hiệu quả Tuy nhiên thuốc không có khả năng phục hồi mô đã bị tổn thương

Thuốc ức chế miễn dịch ức chế sản xuất và hoạt động của lympho bào, một loại bạch cầu có vai trò quan trọng trong việc chống lại nhiễm trùng và loại bỏ các

tế bào bất thường tạo thành bướu ác tính

Tuy nhiên, các loại thuốc này có rất nhiều tác dụng phụ Khi chúng được chỉ định trong các điều trị dài ngày rất dễ làm cho hệ miễn dịch suy yếu, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh cơ hội phát triển

1.5.3 Các loại thuốc ức chế miễn dịch

1.5.3.3 Mycophenolate mofetil

Tác dụng: ức chế bạch cầu lympho phân bào và biệt hoá do đó ức chế hình thành kháng thể, dẫn tới tác dụng ức chế miễn dịch Ức chế sự di chuyển và gắn kết của bạch cầu với tế bào nội mô Thuốc này thường được dùng kết hợp với

Cyclosporine hoặc Prednisolone trong các trường hợp ghép thận

1.3.5.6 Hydroxyurea

Tác dụng ức chế tổng hợp DNA bằng cách ức chế men ribonucleotide diphosphate reductase Do vậy thuốc tác động mạnh lên các tế bào có khả năng phân bào mạnh và đang trong giai đoạn phân bào

1.6 Tình hình nghiên cứu các bệnh nhân sử dụng thuốc ức chế miễn dịch

1 6.1.Trên thế giới

1.6.1.1 Về tỷ lệ nhiễm vi nấm

Theo Roongpoovapatr P và cộng sự, năm 2010, tại Đại học Chulangkorn, Bangkok, Thái Lan, khi nghiên cứu tác nhân gây sốt ở bệnh nhân giảm bạch cầu tại Bệnh viện King Chulalongkorn Memorial, tỷ lệ nhiễm vi nấm là 6.2% [50] Theo Saikat Basu và cộng sự , năm 2011, tại Ấn độ, khi nghiên cứu đặc điểm sinh học

của Candida tropicalis phân lập từ các bệnh nhân ở khoa hồi sức cấp cứu, tỷ lệ

nhiễm vi nấm trong máu chiếm 8.3% [52].Theo Mikulska M, năm 2009 tại bệnh viện đại học San Martino Genoa, Italy, nhiễm trùng máu của người ghép tế bào gốc tạo máu: gia tăng tỷ lệ của vi khuẩn Gram âm và kháng thuốc, tỷ lệ nhiễm vi nấm chiếm 6% [40]

1.6.1.2 Về tỷ lệ phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi

Bệnh bạch cầu cấp thể lympho chiếm 80% các bệnh bạch cầu cấp ở trẻ em

Tần suất mắc bệnh cao nhất ở độ tuổi 3-7 tuổi, tuy nhiên bệnh bạch cầu cấp dòng lympho cũng gặp ở người trưởng thành, chiếm khoảng 20% Bệnh bạch cầu cấp

dòng tủy chủ yếu gặp ở người trưởng thành với tuổi trung bình mắc bệnh là 50, bệnh này vẫn gặp ở người trẻ tuổi và trẻ em [66] Theo Hiệp hội bệnh ung thư, năm 2010-2011 tại Hoa Kỳ, bệnh bạch cầu chiếm 27.5%, Hodgkin lymphoma chiếm 7.2%, Non - Hodgkin lymphoma chiếm 6.6% là những loại ung thư phổ biến của trẻ

từ 0-19 tuổi Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho phổ biến ở trẻ em từ 0-19 tuổi Theo

số liệu của năm 2007, có 2859 ca mới (74%) gặp ở trẻ em, bệnh bạch cầu cấp dòng tủy và bệnh bạch cầu mãn tính dòng lympho (CLL) là 2 loại bệnh phổ biến nhất thường gặp nhất của người trưởng thành [27]

1.6.1.3 Về tỷ lệ vi nấm phân lập được trên những mẫu cấy nấm dương tính

Theo Chai YA và cộng sự, năm 2007, tại Singapore, khi nghiên cứu sự nổi trội

của vi nấm Candida tropicalis trong máu tại Đại học Singapore, trong 52 ca nhiễm

vi nấm, Candida tropicalis chiếm 36%, Candida albicans chiếm 29%, Candida

parapsilosis chiếm 21%[20] Theo Anirudhan D và cộng sự, năm 2008, tại New Delhi, Ấn Độ, khi nghiên cứu dịch tễ và kết quả của tổn thương màng nhầy miệng

do hóa trị liệu ở trẻ em bệnh bạch cầu cấp dòng lymphoma, có 6/ 70 trẻ em mắc

bệnh nhiễm Candida trong máu Candida tropicalis chiếm 2/6 (33.3%), Candida

albicans (0%), Candida parasilosis chiếm 1/6 (16.6%), nấm sợi chiếm 3/6 (66.67%) [14].Theo Horn DL , năm 2008, tại Hoa Kỳ, theo dịch tễ học và kết quả

nhiễm Candida trong máu của 2019 bệnh nhân: Dữ liệu từ Cơ quan điều trị kháng nấm tương lai, tỷ lệ nhiễm các loài Candida khác chiếm 54.4% cao hơn so với

Candida albicans 45.6% [25]

Theo Corrado Girmenia và cộng sự, năm 2009, tại Ý, nhiễm trùng xâm lấn do

Trichosporon spp và Geotrichum capitatum trên bệnh nhân có khối u ác tính do bệnh huyết học: Một nghiên cứu đa trung tâm từ Ý và tổng kết y văn, sự phân bố

của 287 ca nhiễm Trichosporon spp ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch được báo cáo

như sau: Châu Âu chiếm 27.2% trong đó Ý chiếm 32%, Bắc Mỹ chiếm 33.4%, Hoa

Kỳ chiếm 32%, Châu Á chiếm 32.4% trong đó Nhật Bản chiếm 23%, Châu Phi

2.8%, Úc chiếm 2.1% Tỷ lệ nhiễm Trichosporon spp trong các bệnh nhân bệnh

huyết học như sau: 41.8% trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy , 13.1% trong bệnh

bạch cầu cấp dòng lympho , 10.6% trong bệnh lymphoma, 1.9% trong bệnh bạch cầu mãn dòng lympho, 6.2 % trong bệnh bạch cầu mãn dòng tủy [24]

Theo Lukic-Grlic A và cộng sự, năm 2011, tại Zagreb, Croatia, có 3 trẻ sơ sinh

nhiễm Candida utilis trong máu [36]

1.6.1.4 Về tỷ lệ chẩn đoán theo từng loại bệnh lý

Theo Roongpoovapatr P và cộng sự, năm 2010, tại Đại học Chulangkorn, Bangkok, Thái Lan, khi nghiên cứu tác nhân gây sốt ở bệnh nhân giảm bạch cầu tại Bệnh viện King Chulalongkorn Memorial, tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp dòng tủy chiếm 36.6%, bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chiếm 10.5% [50] Theo Kume H và cộng

sự tại Khoa Bệnh học, trường Đại học Y Kitasato, Sagamihara, Kanagawa, Nhật Bản năm 2006 khi nghiên cứu về dịch tễ học của nấm nội tạng ở bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu và bệnh loạn sản tủy , có 1260 trường hợp nhiễm nấm trong bốn năm nghiên cứu, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy và bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 35.5% và 33.5% [35] Theo Pagano L và cộng sự năm 2006, trong nghiên cứu 2004

về dịch tễ học nhiễm nấm ở bệnh nhân u ác tính có bệnh lý huyết học, bệnh bạch cầu cấp dòng tủy chiếm 3012/11802 (25.5%), bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chiếm 1173/11802 (9.9%) [46]

1.6.1.5 Về tỷ lệ chẩn đoán theo tác nhân gây bệnh

Theo Corrado Girmenia và cộng sự, năm 2009, tại Ý, nhiễm trùng xâm lấn do

Trichosporon spp và Geotrichum capitatum trên bệnh nhân có khối u ác tính do bệnh huyết học: Một nghiên cứu đa trung tâm từ Ý và tổng kết y văn, trong bảng

đặc điểm lâm sàng của các trường hợp nhiễm Trichosporon spp và Geotrichum

capitatum trên bệnh nhân huyết học được báo cáo trong y văn, tỷ lệ nhiễm

Trichosporon spp của bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chiếm 21/160 (13.1%), bệnh bạch cầu cấp dòng tủy chiếm 67/160 (41.9%), các bệnh khác của máu chiếm 5/160 (3.1%) [24] Theo Kume H và cộng sự năm 2006, tại trường Đại học Y Kitasato, Sagamihara, Kanagawa, Nhật Bản, khi nghiên cứu về dịch tễ học của nấm nội tạng

ở bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (AML) và loạn sản tủy (MDS) có 3/4

bệnh nhân AML và 1 mắc bệnh hội chứng MDS nhiễm Trichosporonon máu khi

đang được điều trị thuốc kháng nấm Khi phân lập xác định Trichosporon beigelii chiếm 2/4 và Trichosporon asahii chiếm 2/4 (50%) [35]

1.6.1.6 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm (MIC)

a Độ nhạy cảm với thuốc của Candida tropicalis

Theo Ruan Sheng-yuan và cộng sự, năm 2009, tại Đài loan, nhiễm

Trichosporon trong máu do Trichosporon asahii và những loài Trichosporon khác tại Trung tâm y khoa Đài Loan, Candida tropicalis đề kháng với azoles

(fluconazole, itraconazole, voriconazole) chiếm (10.2%-13.6%) [51] Theo Saikat

Basu và cộng sự năm 2011, tại Ấn Độ, đặc điểm sinh học của Candida tropicalis phân lập từ các bệnh nhân của khoa hồi sức cấp cứu, 80% Candida tropicalis nhạy

với Amphotericin B, 60% nhạy với Fluconazole, 20% kháng với Amphotericin B, 40% kháng với Fluconazole [52] Theo Peter G.Pappas và cộng sự năm 2009, tại

Hoa Kỳ, hướng dẫn thực hành lâm sàng cho quản lý nhiễm Candida trong máu: cập nhật thông tin xã hội các bệnh truyền nhiễm của Mỹ năm 2009, Candida tropicalis

nhạy với Fluconazole và Amphotericin B [47]

b Độ nhạy cảm với thuốc của Candida albicans

Theo Tan Than Yen và cộng sự, năm 2008, trong phân tích độ nhạy kháng

nấm Candida phân lập từ máu của bệnh viện Singapore, 100% Candida albicans

nhạy với Fluconazole, 98.1% nhạy với Flucytosine, 1.9% kháng với Flucytosine [57] Theo Ruan Sheng-yuan và cộng sự, năm 2009 tại Đài Loan, nhiễm

Trichosporonosis do Trichosporon asahii và những loài Trichosporon khác tại

Trung tâm y khoa Đài Loan, tỷ lệ đề kháng với azoles (fluconazole, itraconazole, voriconazole) của Candida albicans chiếm (12.5%-18.8%) [51] Theo Peter G

Pappas và cộng sự năm 2009, tại Hoa Kỳ, hướng dẫn thực hành lâm sàng cho việc

quản lý nhiễm Candida trong máu: cập nhật thông tin xã hội các bệnh truyền nhiễm của Mỹ năm 2009, Candida albicans còn nhạy với Fluconazole và Amphotericin B

[47]

c Độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm của Trichosporon asahii

Theo Ruan Sheng-yuan và cộng sự, năm 2009, tại Đài loan, nhiễm Trichosporon trong máu do Trichosporon asahii và những loài Trichosporon khác tại trung tâm y

khoa Đài Loan, thuốc gốcAzoles nhạy trong phòng thí nghiệm trong khi AB không

có tác dụng kháng với Trichosporon spp [51] Theo Thomas C Chagas-Neto, năm

2009, tại São Paulo, Brazil, nhiễm trùng máu do Trichosporon spp: sự phân bố loài, xác định kiểu gen Trichosporon asahii trên cơ sở của Ribosomal DNA Intergenic

Spacer 1 Sequencing và kiểm tra tính nhạy cảm kháng nấm, 50% Trichosporon

asahii đề kháng với AB, 87% đề kháng với 5-FC, 100% nhạy với voriconazole [59]

1.6.2 Tại Việt Nam

Hiện nay, tại Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu nào về tỷ lệ nhiễm nấm của các bệnh nhân sử dụng thuốc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch Ngoại trừ một số ca nhiễm bệnh tìm thấy tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới và trên trẻ sơ sinh Theo

Nguyễn Thị Diệu Huyền và cộng sự, năm 2005, đặc điểm nhiễm nấm Candida máu

và kết quả điều trị bằng amphotericin B tại Khoa Hồi Sức Bệnh Viện Nhi Đồng 2 năm 2000 – 2003, tỷ lệ nhiễm 1.2% (22 trẻ) trong một nghiên cứu từ tháng 10-2004 đến tháng 12-2005 [3]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 V ật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả các bệnh phẩm máu từ các bệnh nhân Bệnh viện Truyền máu huyết học được gửi xét nghiệm tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới TP.HCM trong khoảng thời gian từ tháng 11/2010 đến hết tháng 10/2011

2.1.2 Hóa chất

2.1.2.1 Thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB)

Loại thuốc nhuộm này làm chất dầm khi ta quan sát tế bào vi nấm

Dung dịch này giúp ta thấy vi nấm rõ hơn, giết vi nấm và giữ mẫu kính được khá lâu (có mẫu kính giữ được hàng năm)

Neopepton (peptone, phyton) 5 g

Độ pH 5,6

2.1.5.2 Môi trường Chrom agar (MT2) dùng để định danh Candida spp

Thành phần pha trộn trong 1l nước

2.1.5.3 Bộ kit định danh nấm Candida (MT3) - tên sản phẩm: API 20C

AUX - hãng sản xuất: BioMérieux

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Đây là nghiên cứu cắt ngang mô tả hàng loạt ca trong khoảng thời gian từ tháng 11/2010 đến 10/2011 tại Phòng xét nghiệm vi nấm Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu: Lấy toàn bộ số ca

Vì chưa tính được p do không có các nghiên cứu nào trước đây ở Việt Nam Do

đó phải lấy toàn bộ số ca

2.2.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Các mẫu máu của bệnh nhân bị bệnh lý huyết học đang điều trị thuốc ức chế miễn dịch tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học, được gởi đến Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới để cấy máu

2 3.Các kĩ thuật dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Cấy máu

a Nguyên tắc hoạt động

Trong môi trường cấy, khi có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu, chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất, thải khí carbon dioxide ( CO2) vào môi trường Lượng CO2 này phản ứng với một chất nhuộm được gắn trong bộ phận cảm biến ở

Hình 2.2 API 20C AUX

mỗi đáy chai và phát ra ánh sáng Mẫu dương tính được báo hiệu ngay bằng nguồn ánh sáng chỉ thị nằm phía trước máy và đèn báo, vị trí mẫu dương tính được hiển thị trên màn hình LCD Sau đó, lấy mẫu dương tính ra khỏi máy, tiến hành nhuộm Gram, phân lập và định danh vi sinh vật

b Cách tiến hành

Máu lấy từ bệnh nhân được tiêm trực tiếp vào chai cấy Trẻ em sử dụng chai

có dung tích 1-3 ml, người lớn 8-10 ml Đánh số thứ tự của chaiĐưa vào trong máyTheo dõi sự hiển thị thông báo của máy khi phát hiện ra trong máu có sự hiện diện của vi sinh vật (mẫu dương tính)

c Yêu cầu kết quả

Phát hiện được các chai cấy máu dương tính

2.3.2 Kỹ thuật nhuộm Gram

a Nguyên tắc hoạt động

Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau

Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm nên không

bị rửa trôi khi xử lý bằng acetone.Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram dương

Loại phức chất thứ hai không giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng acetone và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung (màu hồng) Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram âm

b Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch iot lên mẫu đã cố định trên lam để khoảng 1 phútRửa bằng nước Nhỏ dung dịch lugol  để khoảng 5-10 giây Rửa bằng nước Nhỏ acetone lên lam 5-10 giây cho đến khi không ra màu nữa Rửa bằng nướcNhỏ dung dịch safranin hoặc fuchsin lên, đảo nhẹ 5-10 giâyRửa bằng nướcĐể khô

c Yêu cầu kết quả

Quan sát mẫu nhuộm với vật kính dầu

Mẫu bắt màu tím (Gram dương), có hình cầu, bầu dục có nẩy chồi thì kết luận

là nấm men Sau đó ta đem cấy bệnh phẩm vào môi trường MT1 để định danh chính xác các chủng Candida

2.3.3 Kỹ thuật cấy phân lập các vi nấm trên môi trường Sabouraud (MT1)

Với các mẫu đem soi ta chỉ có thể kết luận rằng mẫu có chứa vi nấm hay không Để định danh chính xác một vi nấm cơ hội ta phải cấy lên MT1 để phân lập trước Khi có khuẩn lạc mọc trên môi trường ta mới sử dụng các kỹ thuật định danh

c Yêu cầu kết quả

Các khuẩn lạc hình thành riêng rẽ nhau

2.3.4 Kỹ thuật soi khúm nấm sau khi cấy bằng lactophenol cotton blue (LPCB)

a Nguyên tắc: thuốc nhuộm giết các vi nấm , giúp quan sát vi nấm tốt hơn và

giúp giữ mẫu kính được lâu

b Cách tiến hành

Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm LPCB lên lam kính Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc nấm đặt lên phiến kính Trộn đều hỗn dịch trên Đậy lamen lên và quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với vật kính x 40 và rút ra kết luận

c Yêu cầu kết quả

Quan sát tìm các tế bào nấm men và cách nảy chồi của chúng

2.3.5 Kỹ thuật định danh các vi nấm

2.3.5.1 Kỹ thuật định danh các chủng Candida trên môi trường Chrom agar (MT2)

a Nguyên tắc

Trong quá trình phát triển, các chủng Candida sẽ tiết ra các loại enzym khác

nhau tạo nên các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau khi cấy trên MT2

b Cách tiến hành

Ghi tên bệnh nhân, mẫu bệnh phẩm, ngày cấy lên phía ngoài của đĩa thạch

Dùng que cấy lấy một ít nấm men đã được ủ sau 2 ngày dàn đều trên mặt MT2

Đậy hộp petri lại, ủ trong nhiệt độ 250

C

Sau 24-48 giờ quan sát sự hình thành màu sắc của khuẩn lạc

c Yêu cầu kết quả

Candida albicans: màu xanh lá

Candida tropicalis: màu xanh dương

Candida spp: màu hồng

Đối với các khuẩn lạc Candida màu hồng, để định danh chính xác tên chủng ta

phải tiến hành thực hiện trên MT3

2.3.5.2 Kỹ thuật định danh bằng các phản ứng đồng hóa đường trên bộ kit API 20C AUX( MT3)

a Nguyên tắc

Các chủng Candida có khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau Bộ sản

phẩm API 20C AUX bao gồm 20 giếng chứa các chất khử đặc trưng cho 19 phản ứng đồng hoá Những giếng đó chứa các loại đường ở dạng bán rắn, nấm men sẽ

phát triển trên đó nếu chúng có thể tận dụng được nguồn cacbon

Phản ứng có thể đọc được bằng cách đối chứng với ô chứng (ô cuối cùng) Kết quả đọc bằng phần mềm tương ứng

b Cách tiến hành

Thực hiện theo sơ đồ dưới:

c Yêu cầu kết quả

Dựa vào độ đục của các giếng sẽ định danh được tên chủng Candida thông qua

chương trình đọc của máy tính

Hình 2.3 Sơ đồ định danh các chủng Candida bằng bộ kit API

2.3.5.3 Tóm tắt quá trình phân lập và định danh các chủng nấm men

như sau:

Nhuộm Gram (xác định bệnh phẩm nhiễm VN)

Cấy phân lập các vi nấm trên MT Sabouraud

Soi khúm nấm sau khi cấy bằng LPCB

Cấy định danh các chủng VN trên MT Chrom agar

Định danh trên bộ kit API 20C AUX

Các Candida spp, Trichosporon asahii

Candida albicans

Candida tropicalis

Lấy bệnh phẩm (cấy máu vào chai cấy máu của hãng Batec plus) ở BV Truyền

máu huyết học

Vận chuyển ngay đến khoa xét nghiệm –BV Bệnh Nhiệt Đới

Đưa vào máy cấy máu

Mẫu dương

2.3.6 Kỹ thuật khảo sát độ nhạy cảm của các loại thuốc kháng nấm

Hình dạng không đồng nhất, dạng elip, không thấy vỏ bao dày

Cấy lên môi trường Chrom agar

Khuẩn lạc có màu không đặc trưng

Candida utilis

Khuẩn lạc có màu xanh da trời, trơn

pipet nhỏ dịch nấm vào MT1, dàn đều dịch nấm men bề mặt MT1Dùng kẹp đặt các đĩa thuốc kháng nấm vàoỦ trong 24 giờĐo đường kính của vòng vô khuẩn

và rút ra kết luận

c Yêu cầu kết quả

Nếu vi nấm kháng thuốc sẽ không hình thành vòng vô khuẩn Nếu vi nấm nhạy cảm với thuốc sẽ hình thành vòng vô khuẩn.Vòng càng rộng, khả năng nhạy cảm của vi nấm với thuốc càng cao

2.3.7 Kỹ thuật bảo quản các chủng vi nấm

2.3.7.1 Bảo quản các chủng vi nấm bằng nước cất (ở nhiệt độ thường)

c Yêu cầu kết quả

Đảm bảo mẫu bảo quản phải vô trùng, không bị tạp nhiễm

2.3.7.2 Bảo quản bằng dung dịch BHI-glyxerol (ở nhiệt độ -20 0

Dùng que cấy phết nhẹ vào khuẩn lạc nấm

Hòa vào lọ chứa dung dịch BHI-glyxerol

Dùng parafin quấn quanh miệng nắp chai cho kín

Ghi chú tên bệnh nhân , bệnh phẩm, ngày giữ mẫu, tên vi nấm

Lưu mẫu vào tủ lạnh ở -200

C

c Yêu cầu kết quả

Đảm bảo mẫu bảo quản phải vô trùng, không bị tạp nhiễm