A. MỞ ĐẦU Cây ngô là một trong những cây lương thực quan trọng không chỉ đối với thế giới mà còn quan trọng đối với cả Việt Nam. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn diện tích trồng ngô tại Việt Nam trong những năm gần đây có giảm, nhưng vẫn đạt vào khoảng 1,1 triệu ha năm, năng suất bình quân gần 4,0 tấn ha vụ, sản lượng chưa đến 4,0 triệu tấn, vì thất thoát trên đồng ruộng do sâu bệnh (nấm, mối, mọt) sau thu hoạch ước tính thất thoát từ 10 13%. Trong khi đó nhu cầu sử dụng ngô cho ngành chăn nuôi lên đến 5,5 triệu tấn. Và, Việt Nam hàng năm phải bỏ ra nửa tỷ USD để nhập khẩu ngô hạt. Theo số liệu mới nhất của tổng cục thống kê năm 2008 giá trị thu nhập nguyên liệu thô (ngô, đậu tương) cho sản xuất thức ăn chăn nuôi lên tới 1,3 tỷ USD 12. Hàng trăm năm qua con người đã luôn tìm kiếm các phương pháp để cải tiến cây trồng với mục tiêu tăng năng suất cũng như chất lượng. Mặc dù các phương pháp chọn tạo truyền thống đã mang lại nhiều thành tựu trong công tác phát triển giống cây trồng nông nghiệp, nhưng dường như vẫn chưa thỏa mãn những yêu cầu của thực tế. Công nghệ gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau. Tính trạng mong muốn sẽ được tạo ra bằng cách đưa một đoạn gen vào hệ gen của cây bằng cách trực tiếp hay gián tiếp thông qua kỹ thuật chuyển gen. Vì vậy, việc nghiên cứu cây ngô biến đổi gen đang được đầu tư mạnh mẽ. Đến nay, sau 19 năm đưa vào canh tác, cây ngô biến đổi gen đang mang lại những hiệu quả rõ rệt như tăng năng suất, cải thiện chất lượng, giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao thu nhập cho người dân,… Cây ngô biến đổi gen đang chiếm một diện tích đáng kể trên toàn cầu và hứa hẹn còn tiếp tục phát triển trong những năm tới. Việc nắm bắt khoa học và theo kịp công nghệ của thế giới trong lĩnh vực nông nghiệp đang là một thách thức. Việt Nam chúng ta đã có những nghiên cứu tạo ra các giống ngô biến đổi gen tốt nhưng chưa theo kịp được thế giới, chúng ta vẫn đang phải nhập khẩu các giống ngô biến đổi gen có nhiều đặc tính quý (như tính chịu hạn, tính đề kháng với thuốc trừ sâu, và khả năng kháng sâu bệnh). Vậy nên, cập nhật thành tựu chuyển gen trên cây ngô sẽ tạo tiền đề cho nền khoa học nông nghiệp nước ta phát triển hơn. A. NỘI DUNG CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 1.1. Kỹ thuật chuyển gen 1.2. Các phương pháp chuyển gen 1.2.1. Chuyển gen gián tiếp 1.2.1.1. Phương pháp gián tiếp sử dụng Agrobacterium tumefaciens 1.2.2. Chuyển gen trực tiếp 1.2.2.1. Phương pháp siêu âm 1.2.2.2. Phương pháp xung điện CHƯƠNG II. THÀNH TỰU CHUYỂN GEN TRÊN CÂY NGÔ 2.1. Một số thành tựu tiêu biểu về chuyển gen ở thực vật 2.1.1. Cây trồng và các tính trạng chuyển gen Theo số liệu báo cáo của Trung tâm dịch vụ Quốc tế về tiếp thu các ứng dụng Công nghệ Sinh học trong Nông nghiệp (ISAAA, 2015), đến nay các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen cho 24 loại cây trồng khác nhau với 364 s2.1.2 Những thành tựu quan trọng đánh dấu sự phát triển của kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Năm 1980: Lần đầu tiên thực hiện chuyển ADN ngoại lai vào cây nhờ Agrobacterium. Năm 1983: Tạo các marker chon lọc như chỉ thị màu sắc, chỉ thị kháng với kháng sinh.
A MỞ ĐẦU Cây ngô lương thực quan trọng không giới mà quan trọng Việt Nam Theo thống kê Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn diện tích trồng ngô Việt Nam năm gần có giảm, đạt vào khoảng 1,1 triệu/ ha/ năm, suất bình quân gần 4,0 / ha/ vụ, sản lượng chưa đến 4,0 triệu tấn, thất thoát đồng ruộng sâu bệnh (nấm, mối, mọt) sau thu hoạch ước tính thất thoát từ 10 - 13% Trong nhu cầu sử dụng ngô cho ngành chăn nuôi lên đến 5,5 triệu Và, Việt Nam hàng năm phải bỏ nửa tỷ USD để nhập ngô hạt Theo số liệu tổng cục thống kê năm 2008 giá trị thu nhập nguyên liệu thô (ngô, đậu tương) cho sản xuất thức ăn chăn nuôi lên tới 1,3 tỷ USD [12] Hàng trăm năm qua người tìm kiếm phương pháp để cải tiến trồng với mục tiêu tăng suất chất lượng Mặc dù phương pháp chọn tạo truyền thống mang lại nhiều thành tựu công tác phát triển giống trồng nông nghiệp, dường chưa thỏa mãn yêu cầu thực tế Công nghệ gen đời ví “chìa khóa đa năng” để mở nút thắt vốn gây nhiều khó khăn cho nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo giống trồng “hoàn hảo” chúng kết hợp với Tính trạng mong muốn tạo cách đưa đoạn gen vào hệ gen cách trực tiếp hay gián tiếp thông qua kỹ thuật chuyển gen Vì vậy, việc nghiên cứu ngô biến đổi gen đầu tư mạnh mẽ Đến nay, sau 19 năm đưa vào canh tác, ngô biến đổi gen mang lại hiệu rõ rệt tăng suất, cải thiện chất lượng, giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao thu nhập cho người dân,… Cây ngô biến đổi gen chiếm diện tích đáng kể toàn cầu hứa hẹn tiếp tục phát triển năm tới Việc nắm bắt khoa học theo kịp công nghệ giới lĩnh vực nông nghiệp thách thức Việt Nam có nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen tốt chưa theo kịp giới, phải nhập giống ngô biến đổi gen có nhiều đặc tính quý (như tính chịu hạn, tính đề kháng với thuốc trừ sâu, khả kháng sâu bệnh) Vậy nên, cập nhật thành tựu chuyển gen ngô tạo tiền đề cho khoa học nông nghiệp nước ta phát triển B NỘI DUNG CHƯƠNG I GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 1.1 Kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen kỹ thuật đưa hay nhiều gen lạ thiết kế dạng AND tái tổ hợp vào tế bào chủ trồng nói riêng sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật,…) làm cho gen lạ tồn dạng plasmid tái tổ hợp gắn vào gen tế bào chủ Trong tế bào chủ gen hoạt động tổng hợp nên protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiên đặc tính thể chuyển gen 1.2 Các phương pháp chuyển gen Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp phương pháp chuyển gen trực tiếp Phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen chuyển vào tế bào thực vật qua sinh vật trung gian thường vi sinh vật vius Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen chuyển trực tiếp vào tế vào thực vật thông qua thiết bị thao tác định mà không cần phải nhờ sinh vật trung gian 1.2.1 Chuyển gen gián tiếp 1.2.1.1 Phương pháp gián tiếp sử dụng Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn gam âm, sống đất Agrobacterium tumefaciens thể phát sinh ung thư (oncogenic) chuyển vào tế bào thực vật gây bệnh ghẻ khối u (crown gall) Sự hình thành khối u để tổng hợp loại dinh dưỡng đặc biệt giúp vi khuẩn phát triển Nó có khả xâm nhiễm tế bào thực vật cách chuyển đoạn ADN vào tế bào thực vật Khi ADN vi khuẩn hợp với nhiễm sắc thể thực vật, công vào hệ thống tổ chức tế bào cách có hiệu sử dụng để đảm bảo cho sinh sôi quần thể vi khuẩn Ðể khai thác sử dụng A tumefaciens vector chuyển gen nhà khoa học loại bỏ gen gây khối u gen mã hoá opine T - ADN thay vào marker chọn lọc, trì vùng bờ phải bờ trái T - ADN gen vir Gen chuyển xen vào vùng bờ T - ADN Nó chuyển vào tế bào trở nên hợp với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium kiểm tra xâm nhập bền vững, biểu di truyền gen chuyển đặc biệt Gen chuyển nạp vào hai mầm thông qua Agrobacterium tỏ ổn định Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp loại mô biến nạp, giai đoạn phát triển mô, mức độ khởi đầu vi khuẩn A tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau biến nạp, marker sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng kiểu gen thực vật Phương pháp tỏ hạn chế mầm 1.2.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta sử dụng virus làm vector chuyển gen vào trồng Chuyển gen nhờ virus thuận lợi virus dễ xâm nhập lây lan thể thực vật động vật đồng thời virus mang đoạn ADN lớn nhiều so với khả plasmid Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen cần phải có tiêu chuẩn sau: - Hệ gen virus phải AND - Virus có khả di chuyển từ tế bào sang tế bào khác qua lỗ vách tế bào - Có khả mang đoạn ADN (gen) mới, sau chuyển gen vào tế bào thực vật - Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây) - Không gây tác hại đáng kể cho thực vật Đối chiếu tiêu chuẩn trên, có hai loại virus sử dụng làm vector chuyển gen caulimovirus geminivirus Tuy nhiên, việc sử dụng virus để chuyển gen thực vật sử dụng ADN virus khó ghép nối với hệ gen thực vật 1.2.2 Chuyển gen trực tiếp Chuyển gen trực tiếp bao gồm nhiều phương pháp, có phương pháp sử dụng nhiều như: 1.2.2.1 Phương pháp siêu âm Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần protoplast Sau tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù Cắm đầu siêu âm máy siêu âm ngập hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20KHz theo nhịp ngắn, nhịp khoảng 100 mili giây Số nhịp khoảng - nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 – 900 mili giây Sau siêu âm, đem protoplast nuôi môi trường thích hợp, chọn lọc để tách protoplast chuyển gen nuôi cấy in vitro để tái sinh Chọn lọc đưa trồng môi trường 1.2.2.2 Phương pháp xung điện Xung điện (electroporation) phương pháp học sử dụng để đưa phân tử phân cực vào tế bào chủ qua màng tế bào Vì lớp phospholipid kép màng sinh chất có đầu ưa nước phía đầu kỵ nước phía trong, nên phân tử phân cực nào, bao gồm ADN protein, khả qua màng cách tự (Farabee, 2001) Trong phương pháp này, xung điện cao khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo lỗ thủng tạm thời cho phép phân tử ADN ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên tế bào Ðể tạo xung điện cao thời gian ngắn người ta sử dụng thiết bị gọi máy xung gen (gene pulser) Xung điện tạo làm rối loạn phospholipid kép màng tế bào tạo lỗ tạm thời Vì vậy, phân tử ADN nạp điện vào màng tế bào thông qua lỗ cách tương tự điện di Với số mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà thể thực phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium người ta thành công với phương pháp Hiệu biến nạp cao Lượng DNA ngoại lai cần thiết so với phương pháp khác (Withers, 1995) Phương pháp thực với mô in vivo nguyên vẹn (Weaver, 1995) Ðoạn DNA ngoại lai biến nạp có kích thước lớn Phương pháp có hạn chế là: xung điện có cường độ chiều dài không số lỗ tế bào trở nên lớn bị hỏng đóng lại sau tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương bị thủng (Weaver, 1995) Một hạn chế vận chuyển ADN ngoại lai vào khỏi tế bào suốt thời gian điện biến nạp tương đối không đặc hiệu Ðiều dẫn đến kết không cân ion mà sau làm rối loạn chức tế bào tế bào chết (Weaver, 1995) 1.2.2.3 Phương pháp PEG (polyethylene glycol) Ðể ADN dễ xâm nhập vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast Protoplast trì môi trường nuôi cấy tế bào sinh trưởng cách độc lập với môi trường đặc hiệu, vách tế bào tạo thành toàn tái sinh từ tế bào Quá trình chuyển gen thực cách trực tiếp chế vật lý đơn giản, không cần có vector Ðể nâng cao hiệu biến nạp, người ta đã xử lý protoplast với PEG Phương pháp PEG áp dụng yếu tố dung hợp việc lai tạo tế bào soma nhiều loài động vật thực vật Trong phương pháp PEG gen lạ chuyển nạp vào tế bào trần dạng plasmid ADN, cho kết phục hồi tốt tái sinh Phương pháp chuyển gen có hiệu quả, đặc biệt loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thực Bên cạnh đó, việc tạo protoplast tái sinh từ protoplast không đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng nhiều yếu tố môi trường 1.2.2.4 Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm (microinjection) sử dụng micropipette (kim tiêm) để tiêm dung dịch ADN lạ vào tế bào trần áp lực cao, tạo chuyển gen (Neuhaus cộng 1987) 1.2.2.5 Phương pháp bắn gen Phương pháp bắn gen phương pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào trồng Trong phương pháp người ta sử dụng thiết bị gọi súng bắn gen (Gene gun) Nó sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, thiết kế cho biến nạp adn ngoại lai vào tế bào thực vật phát triển vào đầu thập niên 1980 nhà thực vật học Ðại học Corrnell với nhà nghiên cứu Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA Các tế bào biến đổi di truyền sử dụng để tạo thực vật bao gồm sửa đổi di truyền mong muốn tất tế bào chúng (Voiland, 1999) Mục tiêu súng bắn gen thường callus tế bào thực vật giống sinh trưởng môi trường gel đĩa petri Sau hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel callus bị phá vỡ nhiều Tuy nhiên số tế bào không bị phá vỡ va chạm mạnh tiếp nhận hạt tungsten bao bọc ADN cuối phân tử ADN ngoại lai xâm nhập hợp vào nhiễm sắc thể thực vật Các tế bào từ đĩa petri tập hợp lại chọn lọc tế bào hợp thành công biểu ADN ngoại lai kỹ thuật hóa sinh đại sử dụng gen chọn lọc nối tiếp Northern blots Các tế bào đơn chọn lọc từ callus xử lý với số hormone thực vật auxin, gibberelin tế bào phân chia, biệt hóa thành tế bào mô, quan, tế bào chuyên hóa toàn Cây có nguồn gốc từ tế bào nảy mầm thành công mang đặc tính di truyền Đối với phương pháp này, thao tác thực dễ dàng, chuyển gen vào nhiều loại tế bào mô, tế bào biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa gen vào tế bào vị trí mong muốn Nhưng hạn chế nguyên liệu đắt xác suất thành công không cao 1.2.2.6 Phương pháp trực tiếp qua ống phấn Phương pháp chuyển gen qua ống phấn phương pháp chuyên gen không qua nuôi cấy in vitro Nguyên tắc phương pháp AND ngoại lai chuyển vào theo đầu ống phấn, chiu vào bầu nhụy Thời gian chuyển gen vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh, tốt chuyển gen xảy trình thụ tinh noãn cho tế bào hợp tử chưa phân chia Như chuyển gen xảy tế bào sinh dục tái sinh không hình thành thể khảm - Sau thời gian hoa nở 1-2 giờ, cắt 2/3 ¾ phần hoa lúa - Sau cắt hoa, dùng ống mao quản nhỏ có đường kính 0,2mm đưa dung dịch AND tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy bị cắt (nồng độ AND tái tổ hợp khoảng 50µg/ml) - Bao lúa lại, chờ lúa chín, thu hái - Phân tích xác định kết chuyển gen hệ sau 1.3 Cây chuyển gen Cây chuyển gen (transgenic plant) mang nhiều gen đưa vào phương thức nhân tạo thay thông qua lai tạo trước Những gen tạo đưa vào (gen chuyển) phân lập từ loài thực vật có quan hệ họ hàng từ loài khác biệt hoàn toàn Thực vật tạo gọi thực vật “chuyển gen” thực tế tất thực vật “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại chúng trình hóa, chọn lọc lai giống có kiểm soát thời gian dài [1] Cây chuyển gen tạo phòng thí nghiệm cách thay đổi cấu trúc gen chúng Để làm điều này, người ta dùng kĩ thuật di truyền thêm vào nhiều gen gen trồng Hai phương pháp phổ biến phương pháp bắn gen (súng hạt) chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CHƯƠNG II THÀNH TỰU CHUYỂN GEN TRÊN CÂY NGÔ 2.1 Một số thành tựu tiêu biểu chuyển gen thực vật 2.1.1 Cây trồng tính trạng chuyển gen Theo số liệu báo cáo Trung tâm dịch vụ Quốc tế tiếp thu ứng dụng Công nghệ Sinh học Nông nghiệp (ISAAA, 2015), đến nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu, phát triển trồng biến đổi gen cho 24 loại trồng khác với 364 kiện (Event) chuyển gen tạo ra, bao gồm nhóm lấy hạt, lấy dầu, lấy củ, lấy quả, lấy sợi hoa (Bảng 1) Trong số đó, ngô nghiên cứu chủ yếu với 138 kiện, tiếp đến vải (54), khoai tây (42), cải dầu (36), đậu tương (30) Trong tổng số 36 gen chuyển vào trồng có 14 gen (Bảng 2) ứng dụng rộng rãi như: gen kháng kháng sinh, gen kháng côn trùng, gen kháng thuốc diệt cỏ, gen nâng cao khả chống chịu hạn,…[6] Bảng Cây trồng kiện chuyển gen Cây trồng Event Cây trồng Ngô - Zea mays L 138 Bông - Gossypium hirsutum L 54 Khoai - Solanum tuberosum L 42 tây Cải dầu Argentina- Brassic a napus Đậu tương - Glycine max L Cẩm chướng – Dianthus caryophyllus Cà chua - Lycopersicon esculentum Lúa - Oryza sativa L Event Cây trồng Event Thuốc Alfalfa – Medicago - Nicotiana sativa tabacum L Cả dầu Ba Lan Cà tím - Solanum - Brassica rapa melongena Creeping Củ cải đường Bentgrass - Beta vulgaris - Agrostis stolonifera 32 Mía đường - Saccharum sp Lanh - Linum usitatissumum L 30 Táo-Malus Domestica Mận - Prunus domestica 19 Hoa hướng dương - Populus sp Petunia - Petunia hybrida 11 Hoa hồng - Rosa hybrida Bí - Cucurbita pepo x Ớt - Capsicum annuum Lúa mì - Triticum aestivum Bảng Các tính trạng chuyển gen STT Tính trạng Kháng kháng sinh Kháng côn trùng cánh vẩy Cây trồng Bông, Alfalfa, Lanh Ngô, khoai tây 1 Kìm hãm trình chín Chịu hạn Phục hồi hữu dục Kháng thuốc diệt cỏ Glufosinate Cà chua, cẩm chướng, chanh Ngô, mía đường Cải dầu, ngô Bông, cải dầu Kháng thuốc diệt cỏ Glyphosate Ngô, Alfalfa, cải dầu 10 11 12 Kháng côn trùng cánh cứng Bông, ngô, đậu tương, lúa Gây bất dục đực hạt phấn Cải, ngô Biến đổi màu sắc hoa Hoa hồng, hoa cẩm chướng Biến đổi acid béo Đậu tương, cải dầu Gen kháng đa côn trùng Hướng dương, bông, ngô Tổng hợp amino acid thiết yếu với có Cây lanh, đậu tương, bông, ngô mặt thuốc diệt cỏ Sulfonylurea Đậu, bí, ớt ngọt, cà chua, mận, đu Kháng bệnh virus đủ, khoai tây 13 14 [6] 2.1.2 Những thành tựu quan trọng đánh dấu phát triển kỹ thuật chuyển gen thực vật Năm 1980: Lần thực chuyển ADN ngoại lai vào nhờ Agrobacterium Năm 1983: Tạo marker chon lọc thị màu sắc, thị kháng với kháng sinh Thiết kế lại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u cài gen mong muốn vào plasmid Ti) Năm 1984: Thực chuyển gen trực tiếp gián tiếp vào tế bào protoplast Năm 1985: Tạo giống trồng kháng virus, đưa chuyển gen đồng ruộng Năm 1987: Chuyển gen kháng sâu súng bắn gen Năm 1988: Tạo khoai tây chống nấm, cà chua chín chậm Năm 1990: Chuyển gen bất dục đực cho ngô vào phôi nuôi cấy vô tính Năm 1992: Chuyển gen cho lúa mì Năm 1994: Thương mại hóa cà chua chuyển gen Đây sản phẩm chuyển gen thương mại hóa 10 Năm 1998: Toàn giới có 48 giống trồng chuyển gen thương mại hóa Năm 1999: Chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng hàm lượng vitamin cao Năm 2000: Lần nhà khoa học biến đổi gen thực phẩm để gia tăng giá trị dinh dưỡng việc sản xuất hạt gạo vàng [1] Từ năm 2000 đến nay, trồng chuyển gen không ngừng phát triển Công nghệ chuyển gen đạt nhiều thành tựu trình tạo trồng chuyển gen có đặc tính quý (như tính chịu hạn, tính đề kháng với thuốc trừ sâu, khả kháng sâu bệnh) rút ngắn, cá thể chuyển gen có đặc tính mong muốn ổn định thời gian dài Dưới vài số thành tựu tiêu biểu có tính ứng dụng cao: + Về mặt kháng sâu bệnh: Tạo mang gen Bt kháng sâu hại Sâu hại số sâu bệnh chủ yếu trồng Nếu không sử dụng thuốc trừ sâu, suất trồng bị giảm, sử dụng thuốc trừ sâu làm tăng chi phí sản xuất, đẩy giá thành sản phẩm lên cao, gây tác hại đến môi trường ảnh hưởng sức khỏe người tiêu dùng Nhưng mang gen Bt (ngô Bt, Bt, đậu tương Bt,… ) kháng lại sâu hại chúng có chứa protein loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis Loại vi khuẩn tiết protein độc tố có tác dụng với số loài sâu hại mà không ảnh hưởng tới loại côn trùng, động vật người Vì vậy, mang gen Bt mang lại nhiều lợi ích giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu, giảm giá thành đảm bảo suất cho người nông dân sức khỏe cho người tiêu dùng (giảm nguy có lẫn thuốc trừ sâu thực phẩm) [3], [4] + Về mặt dinh dưỡng: Gạo vàng chứa hàm lượng vitamin A cao… Bệnh mù mắt thiếu vitamin A bệnh thường gặp nước giới thứ ba Theo báo cáo tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm ước tính giới có 500,000 trường hợp mù mắt thiếu vitamin A triệu người chết biến chứng thiếu vitamin A Các nhà khoa học Viện công nghệ 11 trồng-viện khoa học liên bang Thụy Sĩ tạo giống gạo vàng có chứa hàm lượng cao chất beta-carotene (vitamin A) công nghệ biến đổi gen [5] Ước tính 72 gram gạo cung cấp 50% lượng vitamin A hàng ngày trẻ 1-3 tuổi Hiện nay, viện có kế hoạch nghiên cứu làm tăng hàm lượng sắt có giống gạo vàng nói + Về cảnh: Một loại hoa hồng tím tạo cách chuyển cấu trúc bao gồm bốn loại gen khác lúc có gen delphinidin vốn tạo màu xanh loài hoa khác [8] Điều mang lại nhiều lợi nhuận cho nhà sản xuất hoa hồng người tiêu dùng ưa chuộng loại hoa hồng tím với màu sắc chưa có + Về mặt y học: Vac xin thuốc thường đòi hỏi chi phí cao để sản xuất bảo quản [9] Các nhà khoa học tạo giống khoai tây cà chua biến đổi gen có chứa vacxin Các vấn đề vận chuyển, bảo quản hay quản lý vacxin có loại củ trở nên dễ dàng kinh tế nhiều so với phương thức truyền thống [10] 2.2 Thành tựu chuyển gen ngô 2.2.1 Vài nét ngô Ngô (Zea mays L.) nông nghiệp mầm thuộc chi Zea, họ hòa thảo (Poaceae hay gọi Gramineae) Các giống ngô Việt Nam có đặc điểm chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, chống chịu sâu bệnh thích ứng với điều kiện ngoại cảnh khác Song ngô có dặc điểm chung hình thái, giải phẫu Các phận ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) hạt • Rễ ngô Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho rễ họ hòa thảo Độ sâu mở rộng rễ phụ thuộc vào giống, độ phì nhiêu độ ẩm đất Ngô có lọai rễ chính: Rễ mầm, rễ đốt rễ chân kiềng • Thân ngô 12 Thân ngô đặc, đường kính khoảng - cm tùy thuộc vào giống, môi trường sản xuất trình độ thâm canh Thân ngô cao từ -4m Lóng mang bắp kéo dài thích hợp để bắp ngô định vị phát triển Trong điều kiện bình thường ngô cao 1,8 – 2m có số lóng thay đổi tùy thuộc vào giống • Lá ngô Căn vào vị trí thân hình thái chia ngô làm loại: - Lá mầm: Là nhỏ, chưa phân biệt phiến với vỏ bọc - Lá thân: Lá mọc đốt thân, có mầm nách kẽ chân - Lá ngọn: mọc ngọn, mầm nách kẽ - Lá bi: Là bao bắp Lá ngô điển hình cấu tạo bẹ lá, (phiến lá) lưỡi (thìa lìa, tai lá) Tuy nhiên có số loại thìa lìa làm cho bó, gần thẳng đứng theo • Bông cờ bắp ngô Ngô loài có hoa khác tính gốc Hai quan sinh sản: đực (bông cờ) (bắp) nằm vị trí khác • Hạt ngô Hạt ngô thuộc loại dính gồm phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ chân hạt Vỏ hạt màng nhẵn bao xung quanh hạt Lớp alơron nằm vỏ hạt bao lấy nội nhũ phôi Nội nhũ phần hạt chứa tế bào dự trữ chất dinh dưỡng 2.2.2 Thành tựu chuyển gen ngô Ngô trồng quốc gia giới cấp phép sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi nhiều với tổng số 35 giống khác nhau, vượt hẳn trồng đứng thứ (với 19 giống khác nhau) Giống ngô cấp phép nhiều ngô kháng sâu bệnh (MON 810) ngô kháng thuốc trừ cỏ (NK603), hai giống ngô đợc 18 nước cấp phép 13 Ở Việt Nam, để tạo đà cho phát triển trồng biến đổi gen, nhiều quan nghiên cứu Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long … có nghiên cứu ban đầu sàng lọc gen hữu ích, thiết kế vector chuyển gen Đã có báo cáo kết ban đầu nghiên cứu chuyển gen ngô, đậu tương, lúa, Việt Nam hạn chế Công tác nghiên cứu, phát triển trồng biến đổi gen trở nên ngày mạnh mẽ hơn, đặc biệt việc khảo nghiệm đánh giá rủi ro đa dạng sinh học môi trường chuyển gen: ngô, vải, đậu tương với mục đích làm giống Chính phủ cho phép Cho tới Việt Nam mua hạt giống ngô chuyển gen từ công ty Syngenta, DEKALB, Pioneer Hi-bred tính trạng kháng sâu thuốc trừ cỏ, bao gồm Bt11, GA21, Bt11xGA21, MON89034, NK603, MON89034xNK603, TC1507 [6] Ngoài nhiều giống ngô mang kiện khác gen cry3Bb1 dùng để kiểm soát sâu đục thân ngô gen cry1Fa2 dùng để kiểm soát tốt sâu bọ cánh phấn; ngô biến đổi gen mang kiện MIR162 mang đặc tính chống chịu thuốc trừ cỏ [7]; NK66 BT (mang kiện chuyển gen Bt11), NK66 GT (mang kiện chuyển gen GA21) NK66 Bt/GT (mang kiện chuyển gen Bt11 GA21) có hiệu phòng trừ sâu đục thân cao chống chịu cao với thuốc trừ cỏ; khảo nghiệm ruộng ngô biến đổi gen NK4300 Bt/GT Vĩnh Phúc NK4300 Bt/GT loại ngô biến đổi gen mang hai kiện Bt 11 kháng sâu đục thân kiện GA21 chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate [11] Dùng phôi ngô nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh hữu thụ mang gen bar biến nạp Sử dụng phương pháp bắn gen chọn lọc thuốc diệt cỏ bialaphos cho kết mô callus phát sinh phôi biến nạp gen Các biến nạp gen hữu thụ tái sinh, ổn định di truyền biểu gen bar với hoạt tính chức enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát hệ sau 14 Gần đây, kết biến nạp gen gián tiếp ngô nhờ Agrobacterium thông báo Các thể biến nạp gen dòng ngô lai gần (inbredline) A188 tái sinh sau đồng nuôi cấy (cocultivation) binary vector với phôi non Tần số biến nạp thông báo dòng A188 khoảng 5-30% Các thể lai hệ thứ dòng A188 dòng lai gần khác biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số biến nạp gen độc lập/phôi) 2.2.3 Cơ sở khoa học định hướng tạo ngô biến đổi gen 2.2.3.1 Chuyển gen kháng chất diệt cỏ Ước tính khoảng 10% tổng sản lượng lương thực hàng năm giới bị mát cỏ dại, tiêu tốn khoảng 10 tỷ USD sử dụng 100 loại hoá chất khác để diệt trừ Hơn nữa, dùng thuốc diệt cỏ dại bị hạn chế nhiều loại thuốc không phân biệt cỏ dại trồng Glyphosate (phosphonomethyl glycine) loại thuốc diệt nhiều loại cỏ dại chúng làm chết trồng Vì vậy, tạo giống chuyển gen chống chịu glyphosate dùng phổ biến để diệt cỏ Một hướng nghiên cứu chuyển gen sản xuất dư thừa 5enolopyruvyl-shikimate-3-phosphatase (EPSP), enzyme bị ức chế thuốc diệt cỏ glyphosate Nghĩa sản xuất nhiều enzyme EPSP chúng chống chịu glyphosate Chất diệt cỏ phương pháp chọn lựa để kiểm soát cỏ dại hầu hết hệ thống nông nghiệp quy mô lớn Chúng đóng vai trò quan trọng việc tăng sản lượng trồng cách giảm thiểu cạnh tranh trồng với cỏ dại không gian, ánh sáng, nước chất dinh dưỡng Cỏ dại hoạt động nguồn cung cấp tác nhân gây bệnh cho trồng Do gen kháng chất diệt cỏ gen thị chọn lọc hiệu trồng trọt, nên tính trạng chuyển gen sản xuất 15 thương mại hóa, thứ (variety) chống chịu chất diệt cỏ trồng chuyển gen sinh trưởng rộng rãi Dựa sở biểu gen không mẫn cảm chất diệt cỏ, thoái biến chất diệt cỏ biểu mạnh sản phẩm gen đích chất diệt cỏ, mà tính kháng chuyển gen thích hợp phạm vi rộng chất diệt cỏ như: 2,4-D, glyphosate, glufosinate, protoporphyrinogen oxidase inhibitors, imidazalonones, chlorsulfuron/sulfonylureas, bromoxynil, triazines isoxazoles Hiện nay, có chứng tốt cho thấy không tăng sử dụng chất diệt cỏ, mà điều chỉnh trồng chuyển gen kháng chất diệt cỏ cung cấp cho nông dân cho kết giảm sử dụng glyphosate tới 33% giống đậu tương Roundup Ready, giảm sử dụng glufosinate khoảng 20% giống canola Liberty Link [1] 2.2.3.2 Chuyển gen kháng sâu bệnh ∗ Kháng côn trùng Sử dụng hóa chất để phòng trừ sâu bọ côn trùng vừa đắt tiền vừa tác động xấu đến môi trường Nhiều giống ngô chuyển gen sinh trưởng thương mại biểu độc tố Bacillus thuringiensis (Bt) để tạo tính kháng côn trùng nhóm nhai - nghiền (chewing insects) Bt tổng hợp protein δendotoxin tinh thể mã hóa gen Cry Khi côn trùng ăn vào bụng, prototoxins bị đứt gãy dày kiềm côn trùng để tạo thành độc tố hoạt động Các liên kết tạo receptor đặc trưng tế bào biểu mô ruột làm thành lỗ chân lông cuối gây chết côn trùng Một số ưu điểm độc tố Bt sau : - Tính đặc hiệu, protein Cry hoạt động chống lại một vài loài côn trùng 16 - Sự đa dạng, nhiều protein Cry khác nhận biết - Các ảnh hưởng không bất lợi bị giảm xác nhận côn trùng đích địch thủ tự nhiên côn trùng - Độc tính với động vật có vú thấp - Có thể thoái biến dễ dàng Kết nghiên cứu cho thấy điểm mấu chốt gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein tinh thể trừ sâu vi khuẩn Bt chủng kurstaki, chưa đặc biệt biểu rõ trồng Để nâng cao hiệu độc tố, nhà nghiên cứu cắt bớt gen để tổng hợp phần protein có hoạt tính chứa độc tố mà không cần phần gen phụ khác Gen Cry cắt bớt biểu tổng hợp protein gấp 500 lần so với gen tự nhiên Hiện nay, 40 gen khác mang tính kháng côn trùng hợp trồng chuyển gen với vài giống thương mại hóa nước khác Mỹ Úc Đưa lợi ích độc tố Bt kiểm soát côn trùng, phương thức quản lý khác phải chấp nhận để làm chậm phát triển tính kháng côn trùng Bt Bao gồm : - Bố trí vùng bên cạnh trồng không chuyển gen Bt làm nơi trú ẩn để giảm áp lực chọn lọc hướng tới việc kháng côn trùng - Triển khai gen kháng côn trùng khác (ví dụ: protease inhibitors) - Dùng loại độc tố Bt cho receptors đích khác - Dùng promoter khác để điều chỉnh biểu gen Bt - Dùng promoter đặc trưng mô (tissue-specific promoter) côn trùng ăn mà không tổn hại đến kinh tế phận quan trọng thực vật 17 Có hướng khác để phát triển tính kháng côn trùng cho chuyển gen dựa sở: protease inhibitors, α-amylase, lectins, chitinases, cholesterol oxidase, virus côn trùng tạo dòng, tryptophan decarboxylase, antichymotrypsin, anti-elastace, nhân tố ức chế trypsin tuyến tuỵ bò nhân tố ức chế lách [1] ∗ Kháng virus thực vật Các virus gây thiệt hại đáng kể hầu hết trồng lương thực cho sợi phạm vi giới Nhiều phương thức sử dụng để kiểm soát xâm nhiễm virus bao gồm xử lý hóa học để giết vector virus, chuyển vào trồng gen kháng tự nhiên từ loài liên quan, sử dụng chẩn đoán dẫn để đảm bảo nhân giống vật liệu khởi đầu virus (ví dụ: hạt, củ…) Tuy nhiên, phát triển khai thác tính kháng xuất phát từ tác nhân gây bệnh, ví dụ: sử dụng trình tự xuất phát từ virus biểu chuyển gen để cung cấp tính kháng virus thực vật Hướng dựa sở nghiên cứu gây nhiễm (inoculation) hay xâm nhiễm (infection) thực vật khởi đầu với chủng virus nhẹ cung cấp bảo vệ chống lại gây nhiễm với loại chủng virus virus liên quan gần gũi Tính kháng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh đòi hỏi biến nạp thực vật với trình tự xuất phát từ virus; tính kháng vật chủ xuất cho kết từ hai chế khác nhau: (1) bảo vệ dàn xếp biểu protein virus tự nhiên cải biến (ví dụ: protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết), (2) bảo vệ dàn xếp mức độ phiên mã (ARN-mediated resistance), đòi hỏi phiên mã ARN từ chuỗi hoàn chỉnh phần xuất phát từ virus đích (bao gồm gen cho protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết, protease, protein vận động…) Trường hợp phân tử làm tảng cho tính kháng xuất phát từ virus đối tượng nghiên cứu chuyên sâu Cơ sở tính kháng virus đặt 18 ARN (ARN-mediated) im lặng gen hậu dịch mã có khả tương tự phản ánh họat động tế bào thực vật để phát hiện, bất hoạt đào thải ADN ARN ngoại lai [1] Ví dụ: gen nội sinh thực vật chèn vào virus PVX biểu im lặng gen nội sinh thực vật Để tạo giống trồng chống chịu virus, có hướng : - Bảo vệ chéo - Sử dụng ARN vệ tinh - Sử dụng enzyme replicase 2.2.3.3 Chuyển gen thay đổi hàm lượng chất lượng chất dinh dưỡng cây: Ngô thức ăn người gia súc Tuy nhiên ngô có protein chứa axít amin methionin Người ta nghiên cứu để chuyển gen mã hóa cho protein chứa nhiều methionin vào ngô Kết chuyển gen tăng loại protein giàu methionin lên 8% tổng số protein có hạt C KẾT LUẬN Ðối với phát triển công nghệ sinh học kỷ XXI công nghệ chuyển gen có vị trí đặc biệt quan trọng Có thể nói công nghệ chuyển gen hướng công nghệ cao công nghệ sinh học đại phục vụ sản xuất đời sống, phương tiện giúp giảm bớt áp lực nguồn thực phẩm đồng thời giúp trồng có khả đề kháng với sâu bệnh tốt quan trọng có suất cao Diện tích trồng chuyển gen ngày gia tăng đặc biệt nước phát triển Triển vọng công nghệ chuyển gen lớn, cho phép tạo giống vật nuôi, trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho người mà 19 chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, luôn có Với ưu điểm có khả kháng sâu bệnh, thuốc trừ cỏ, ngô biến đổi gen giải pháp thích hợp nhằm gia tăng suất trồng, tăng thu nhập cho nông dân, đặc biệt tiến tới giảm lệ thuộc vào nguồn nguyên liệu phải nhập từ nước Ngoài ra, ngô chuyển gen góp phần bảo vệ môi trường, cải thiện canh tác, giảm việc đồng ruộng Vì vậy, việc nghiên cứu áp dụng thành tựu chuyển gen giống ngô mang gen có phẩm chất tốt, suất cao, phù hợp với điều kiện nước ta đảm bảo an toàn cho người nhiệm vụ quan trọng phát triển vững mạnh nông nghiệp nói riêng kinh tế Việt Nam nói chung D TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]: Giáo trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp, 2005, NXB Nông Nghiệp [2]: m.123.doc.org/ [3]:Carpenter, J.E Peer-reviewed surveys indicate positive impact of commercialized GM crops Nat Biotech 28, 319-321 (2010) [4]:Hellmich, R.L & Hellmich, K.A Use and Impact of Bt Maize Nature Education Knowledge 3, (2012) [5]: Potrykus, I Golden Rice and Beyond Plant Physiology 125, 1157-1161 (2001) [6]: tuaf.edu.vn/khocnsh/baiviet/ 20 [7]: vi.wikipedia.org/wiki/ [8]: Katsumoto, Y et al Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully Generated Blue-Hued Flowers Accumulating Delphinidin Plant and Cell Physiology 48, 1589-1600 (2007) [9]: Awale, M.M et al Transgenic Plant Vaccine: A Breakthrough in Immunopharmacotherapeutics Vaccines and Vaccination 3, (2012) [10]: sitemap/visonline.org [11]: Agbiotech.com.vn/vietnam/ [12]: Tailieu.vn/ 21