Nghiên cứu thiết kế vectơ pB2GW7 mang gen cryIA(c) và đánh giá khả năng chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM —————————————— BÙI TRI THỨC NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM —————————————— BÙI TRI THỨC NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.46.30 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Ngô Xuân Bình Thái Nguyên – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: PGS TS Ngô Xuân Bình, giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại học, môn Sinh học phân tử Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN thầy cô giáo, cán khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Bùi Tri Thức Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực,chưa công bố công trình khác Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn A tumefaciens trình chuyển gen vào trồng 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn A tumefaciens 1.1.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid 1.1.3 Cơ chế trình chuyển gen nhờ A tumefaciens 1.1.4 Một số hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 1.2 Vector chuyển gen dựa Ti-plasmid 10 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens .13 1.4 Công nghệ Gateway vector sử dụng đề tài .16 1.4.1 Công nghệ Gateway 16 1.4.2 Vector nhân dòng pENTRTMD/TOPO cloning 20 1.4.3 Vector chuyển gen pB2GW7 .22 1.5 Vi khuẩn B thuringiensis gen cry 23 1.5.1 Những nghiên cứu chung vi khuẩn B thuringiensis .23 1.5.2 Những nghiên cứu gen cry 24 1.5.3 Những nghiên cứu gen cry1A 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.6 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào A thaliana 25 1.6.1 Đặc điểm nông sinh học A thaliana .25 1.6.2 Những nghiên cứu A thaliana 26 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 28 2.1.1 Vật liêu nghiên cứu 28 2.1.2 Hóa chất sử dụng đề tài 29 2.1.3 Thiết bị sử dụng đề tài 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) .30 2.2.1.1 Nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 31 2.2.1.2 Gắn gen cryIA(c) lên vector tách dòng pENTR™/D-TOPO® 32 2.2.1.3 PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc thu sau nhân dòng với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) 32 2.2.1.4 Xác định trình tự đoạn ADN nhân dòng 32 2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn A tumefacien mang vector pB2GW7-cryIA(c) 33 2.2.2.1 Gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 34 2.2.2.2 Phân tích dòng tế bào E coli thu sau chọn lọc 35 2.2.2.3 Biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A tumefacicen .35 2.2.2.4 PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) .36 2.2.3 Đánh giá khả chuyển gen hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c) A thaliana 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3.1 Tạo A thaliana chuyển gen 36 2.2.3.2 Đánh giá A thaliana chuyển gen dựa khả kháng thuốc diệt cỏ 37 2.2.3.3 Đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 37 2.2.3.4 Đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) 38 2.2.3.5 Đánh giá khả sinh trưởng A thaliana chuyển gen 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Kết nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) 39 3.1.1 Kết nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 39 3.1.2 Kết gắn gen cryIA(c) lên vector tách dòng pENTR™/D-TOPO® 39 3.1.3 Kết PCR kiểm tra dòng khuẩn E coli thu với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) .40 3.1.4 Kết xác định trình tự đoạn ADN nhân dòng 41 3.2 Kết tạo chủng vi khuẩn A tumefacien mang vector pB2GW7cryIA(c) 45 3.2.1 Kết gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 45 3.2.2 Kết phân tích dòng tế bào E coli thu sau chọn lọc .46 3.2.3 Kết biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A tumefacicen 47 3.2.4 Kết PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) .48 3.3 Đánh giá khả chuyển gen hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c) A thaliana 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.1 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen dựa khả kháng thuốc diệt cỏ 49 3.3.2 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 50 3.3.3 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) 51 3.3.4 Đánh giá khả sinh trưởng A thaliana chuyển gen 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận .53 Đề nghị .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Viết tắt A thaliana A tumefaciens A260 nm A280 nm ADN ADNaza Amp VAM ARN ARNaza AS BC BLAST Nội dung Arabidopsis thaliana Agrobacterium tumefaciens Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang bước sóng 280 nm Axít deoxyribonucleic Deoxyribonuclease (enzyme phân hủy ADN) Ampicillin Anfa mosaic virus (virut khảm anfa) Axít ribonucleic Ribonuclease (enzyme phân hủy ARN) Asetoseringon Bacillus cereus Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ BT cADN VCaM Cry CTAB ddNTP E.coli EDTA Gen GUS ISAAA Bacillus thuringiensis Complementary DNA (ngân hàng gen) Cauliflower mosaic virus (virut gây khảm súp lơ) Crystal Cetyl trimetyl amonium bromid Dideoxyribonucleotide triphosphate Escherichia coli Axít etylendiaminetetraacetic Gen mã hóa β-glucuronidase International Survice for the Acquisition of Agri-Biotech Application Kilobase Left border (trật tự biên trái đoạn T-ADN) Mol/lit Messenger RNA kb LB M mARN Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MS NCBI NPTII OD ori PCR rARN RB T-ADN TAE Taq polymeraza TE Ti-plasmid Vir YAC Murashige and Skoog National Center for Biotechnology Information-Trung tâm thông tin quốc gia thông tin công nghệ sinh học Neomycin phospho transferase gen Optical density Origin of replication Polymerase chain reaction Ribosomal RNA Right border (trật tự biên phải đoạn T-ADN) Transfer DNA (đoạn ADN chuyển sang tế bào thực vật) Tris-acetate-EDTA Thermostable DNA polymeraza Tris : EDTA (10:1) Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) Virulence (vùng gen gây độc) Yeast artificial chromosome (NST nhân tạo nấm men) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... ĐẠI HỌC SƯ PHẠM —————————————— BÙI TRI THỨC NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành... đánh giá A thaliana chuyển gen dựa khả kháng thuốc diệt cỏ 49 3.3.2 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 50 3.3.3 Kết đánh giá A thaliana. .. gen cryIA(c) 38 2.2.3.5 Đánh giá khả sinh trưởng A thaliana chuyển gen 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Kết nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16 -cryIA(c) 39 3.1.1 Kết