Vai trò của auxin trong sự phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân cây đậu vigna angularis (willd ) ohwi et ohashi

HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS WILLD... Khảo sát ảnh hưởng của auxin tr

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Hồ Dịu Thắm

VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH

HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC

( WILLD.) OHWI ET OHASHI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Hồ Dịu Thắm

VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH

HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC

CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS

( WILLD.) OHWI ET OHASHI

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

L ỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn sinh lí thực vật của trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Đại học Sư phạm- Tp Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn và giúp đỡ của Quý Thầy Cô Để hoàn thành luận văn này, em chân thành gởi lời cảm ơn đến:

Thầy hướng dẫn PGS TS Bùi Trang Việt đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều

kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian làm luận văn

Cô hướng dẫn TS Lê Thị Trung đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cũng

như tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện các thí nghiệm cho luận văn

Em xin chân thành cảm ơn cô TS Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS Trần Thị Thanh Thủy, cô TS Trần Thị Cúc, cô TS Nguyễn Thị Mong, thầy TS Phạm Văn Ngọt, thầy PGS TS Bùi Văn Lệ đã giảng

dạy trong suốt thời gian em học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô ở Bộ môn sinh lí thực vật trường ĐHKHTN: cô TS Trần Thanh

Hương, Thầy ThS Phan Ngô Hoang, cô ThS Trịnh Thị Cẩm Tú, cô ThS Trần Thanh Hiền và em

Hồ Thị Mỹ Linh quản lí phòng thí nghiệm trường ĐHSP đã cho em mượn dụng cụ và hóa chất để thực hiện thí nghiệm

Cảm ơn BGH trường THPT Nguyễn Văn Linh dã giúp đỡ để tôi có thời gian hoàn thành chương trình học

Xin gởi lời cảm ơn đến các bạn lớp sinh học thực nghiệm khóa 19, khóa 20, các bạn bè đồng nghiệp

và các em sinh viên ở phòng bộ môn sinh lí thực vật

Cuối cùng, con xin nói lời cảm ơn vô hạn với bố mẹ, người đã cố gắng nuôi dưỡng và dạy dỗ để con

có thể được học tập và trưởng thành Chị và Nhiên ơi cho em bày tỏ lòng biết ơn tới hai người nhé,

đã có những hi sinh nhất định để em có thể thực hiện ước mơ làm cô giáo Cảm ơn bé Trinh đã nấu cơm cho chị trong suốt năm qua Cảm ơn anh luôn ở bên em, yêu thương và chia sẽ với em trong cuộc sống

Tp HCM, tháng 8 năm 2011 Nguyễn Hồ Dịu Thắm

M ỤC LỤC

4

LỜI CẢM ƠN4 3

4

MỤC LỤC4 4

4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT4 7

4

LỜI MỞ ĐẦU4 1

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU4 2

4

1 1 Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4 2

4

1 1.1 Phân loại4 2

4

1 1 2 Đặc điểm sinh học4 2

4

1 1 3 Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới4 4

4

1 1 4 Thành phần hóa học4 4

4

1 1 5 Giá trị thực phẩm và giá trị dược liệu4 4

4

1 1 6 Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4 5

4

1.2 Sự phát sinh hình thái4 6

4

1 2 1 Định nghĩa4 6

4

1 2 2 Phương pháp nghiên cứu4 6

4

1 2 3 Sự phát sinh rễ4 7

4

1 3 Vai trò các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái4 9

4

1 3 1 Vai trò của auxin trong sự tăng trưởng thực vật4 9

4

1 3 1 1 Sinh tổng hợp và vận chuyển auxin4 9

4

1 3 1 2 Auxin trong sự phát triển rễ4 10

4

1 3 1 3 Auxin trong sự sinh trưởng, phân chia và phân hóa tế bào4 11

4

1 3 2 Vai trò của giberelin trong sự tăng trưởng thực vật4 11

4

1 3 2 1 Sự phát hiện4 11

4

1 3 2 2 Nơi tổng hợp và di chuyển4 12

4

1 3 2 3 Tác dụng sinh lí4 12

4

1 3 3 Vai trò của Citokinin trong sự tăng trưởng thực vật4 13

4

1 3 3 1 Sự phát hiện4 13

4

1 3 3 2 Nơi tổng hợp4 13

4

1 3 3 3 Tác dụng sinh lí4 13

4

1 3 4 Vai trò của axit abcisic (AAB)4 14

4

1 3 5 Vai trò của Etilen4 15

4

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP4 16

4

2.1 Vật liệu4 16

2 2 Phương pháp 16

2 2 1 Khử trùng mẫu4 16

4

2 2 2 Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro4 17

4

2 2 3 Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro4 17

4

2 2 4 Khảo sát ảnh hưởng của auxin trong sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây

đậu Vigna angularis4 17

4

2 2 5 Ảnh hưởng của auxin lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu

Vigna angularis4 18

4

2 2 6 Ảnh hưởng của auxin ở các nồng độ cao lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng

diệp của cây đậu Vigna angularis4 18

4

2 2 7 Khảo sát sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin4 19

4

2 2 8 Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4 19

4

2 2 9 Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây Vigna angularis 7 ngày tuổi4

19

4

2 2 10 Đo cường độ hô hấp4 19

4

2 2 11 Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật4 19

4

2 2 12 Xử lý thống kết quả thu được4 20

4

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN4 21

4

3.1 Kết quả4 21

4

3 1 1 Khử trùng mẫu4 21

4

3 1 2 Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro4 21

4

3 1 3 Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên chiều cao và khả năng tạo rễ của cây con in vitro4 23

4

3 1 4 Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây

đậu Vigna angularis4 25

4

3 1 5 Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu

Vigna angularis 7 ngày tuổi.4 30

4

3 1 6 Ảnh hưởng của auxin ở nồng độ cao lên sự phát sinh rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu

Vigna angularis 7 ngày tuổi.4 35

4

3 1 7 Khảo sát sự hình thành rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi

theo thời gian dưới ảnh hưởng của cùng nồng độ auxin.4 37

4

3 1 8 Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4 38

4

3 1 9 Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây đậu Vigna angularis4 39

4

3 1 10 Sự thay đổi cường độ hô hấp và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển

rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở cây Vigna angularis4 40

4

3 2 Thảo luận4 41

4

3 2 1 Khử trùng mẫu4 41

4

3 2 2 Ảnh hưởng của AIA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro4 41

4

3 2 3 Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn hình thành và phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp4 42

4

3 2 4 Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin 5mg/l4 44

3 2 5 Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin 44

3 2 6 Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao cây và diện tích lá4 44

4

3 2 7 Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển

rễ bất định4 45

4

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ4 46

4

4.1 Kết luận4 46

4

4 2 Đề nghị4 46

4

TÀI LIỆU THAM KHẢO4 47

4

PHỤ LỤC4 1

4

PHỤ LỤC 14 2

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA : Abscisic acid

BA : Benzyl adenin

CĐHTTTV : chất điều hòa tăng trưởng thực vật

GAR 3 R: Gibberellin

IAA : Indole-3-acetic acid

MS : Murashige và Skoog

TLT : trọng lượng tươi

L ỜI MỞ ĐẦU

Ngay từ giai đoạn đầu khi con người biết trồng trọt, họ đã có ý thức chọn lọc các cây trồng

mang những đặc tính có lợi cho con người Quá trình chọn lọc như thế phải mất nhiều thời gian, hàng chục hoặc hàng trăm năm nhưng không mang lại hiệu quả cao Đến đầu thế kỉ XX, sinh học đạt được nhiều thành tựu lớn như khám phá ra định luật di truyền Mendel, hiện tượng di truyền liên kết của Morgan và những nghiên cứu khác nữa, nhờ đó tạo ra cây trồng mang biến dị tổ hợp của nhiều gen có lợi Và rồi kĩ thuật gây đột biến ra đời đã góp phần tạo ra nhiều giống mới có các đặc tính quý

Ngày nay chất lượng cuộc sống gia tăng, thị hiếu con người phong phú, nhu cầu về lương thực, thực phẩm lớn Làm sao nhân nhanh nhiều giống hay tạo ra nhiều giống mới nhằm đáp ứng thị hiếu và nhu cầu con người là vấn đề lớn đặt ra cho các nhà chọn lọc và tạo giống vật nuôi và cây trồng

Phát sinh hình thái là cơ sở cho vi nhân giống thực vật nên rất được thế giới và nước ta quan tâm Việc phát hiện auxin là chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã mở ra cho những nghiên cứu trồng trọt đầy hấp dẫn Auxin kích thích khúc cắt hình thành rễ bất định là bước đột phá lớn cho nhân giống thực vật ( Environ, 2007 )

Đề tài “Vai trò của auxin trong sự phát sự phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi” được thực hiện nhằm tìm hiểu về các giai đoạn phát triển rễ bất định in vitro ở cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi dưới ảnh

hưởng của auxin để bổ sung kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu và giảng dạy

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi

1 1.1 Phân loại

Giới : Plantae

Ngành : Angiospermae

Lớp : Dicotiledoneae

Bộ : Fabales

Họ : Fabaceae

Chi : Vigna

Loài : Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi

(Phạm Hoàng Hộ, 1999)

1 1 2 Đặc điểm sinh học

Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi là cỏ nhất niên, thân đứng hay leo, cao 50 đến 80

cm, nhánh có cạnh, có lông dài Bộ nhiễm sắc thể 2n = 22 Cuống 10 đến 12 cm, có lông, lá phụ xoan, đầu tròn, có thùy, dài 6 đến 8 cm, gân phụ 4 đến 5 cặp, lá bẹ thon, hình lọng, cao 8 mm

Chùm ở nách lá, dài 3 đến 10 cm, đài 5 răng ngắn; vành vàng, cao 15 mm, lườn xoắn 360 ( Phạm

Hoàng Hộ, 1999 ) Hoa có màu vàng nhạt với những cánh hoa màu vàng chanh xếp thành từng cặp

Quả hình trụ, dài 5 đến 8cm, rộng 8 đến 10mm, không có lông, chứa 6 đến 10 hạt Hạt có hình thuôn, hai đầu vuông, không có lông, dài 4 đến 7mm , đường kính 5mm, màu nâu sẫm ( Hu, 2005 )

Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi có thể được giữ ít nhất 5 năm nếu độ ẩm hạt là 13%

và độ ẩm không khí 15% Hạt nẩy mầm trên đất ở nhiệt độ 6 đến 10 P

0

P

C nhưng tốt nhất là 30 đến

34 P

0

P

C Sau khi trỉa 7 đến 20 ngày cây mầm mới nhô lên khỏi mặt đất So với các đậu khác, Vigna

angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi phát triển rất chậm nên cần làm sạch cỏ giữa giai đoạn nảy mầm

và ra hoa (Brink và Belay, 2006)

Hình 1.1 Một số bộ phận chính của cây : a nhánh; b hoa;

c.đài; d nhụy; e nhị; f.quả; g hạt (Nguồn: Hu, 2005)

Hoa kéo dài 30 đến 40 ngày Cây tự thụ phấn nhưng vẫn có thể xảy ra thụ phấn chéo Thời

gian sinh trưởng khoảng 60, 80, 90 hoặc120 ngày Rễ cây cộng sinh với vi khuẩn Bradyrhizobium

nên có khả năng cố định N hơn 100kg N/ ha, con số này còn phụ thuộc vào độ ẩm và pH của đất (Brink và Belay, 2006)

Vigna angularis sống tốt nhất ở vùng có khí hậu ấm áp và cận nhiệt đới với lượng mưa trung

bình hằng năm 500 đến 1750 mm, và nhiệt độ từ 15 đến 30P

0

P

C Cây có thể chịu được nhiệt độ cao

nhưng rất nhạy cảm với sương mù Ở nhiệt đới, Vigna angularis thích hợp ở vùng cao và độ pH của

đất từ 5 đến 7,5 (Brink và Belay, 2006)

Ở Trung Quốc, Vigna angularis thường được trồng xen với ngô hoặc kê, còn ở Nhật thì luân canh xen vụ với khoai tây, củ từ hay lúa mì Vigna angularis thường bị nhiễm bệnh do nấm, vi khuẩn hay do côn trùng tấn công như Erysiphe polygoni, Xanthomonas campestris, Matsumuraeses

phaseoli …

Quả đậu không dễ vỡ nên người ta có thể thu hoạch bằng máy gặt Thông thường, người ta cắt bằng tay sau đó phơi nhiều ngày trước khi xếp thành đống khô Khi độ ẩm hạt còn 16% thì tiến hành đập Nhiều trái đậu có vỏ mỏng, hạt lại ẩm ướt nên đã nảy mầm bên trong vỏ quả Sản lượng

hạt thu hoạch trên một ha có thể đạt đến 3500kg Ở Kenya, người ta trồng thí nghiệm và đã thu

được khoảng 500 đến 600 kg trên ha (Brink và Belay, 2006)

1 1 3 Ngu ồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới

Vigna angularis được trồng ở vùng châu Á nhưng nguồn gốc của nó thì chưa được biết (Ohashi và Tahashahi, 1981)

2

Việc thuần hóa 2Vigna angularis 2được biết tới từ thời xa xưa ở Hàn Quốc2, Trung Quốc và Nhật, sau đó 2cây trồng này 2được giới thiệu tới nhiều quốc gia khác trên thế giới Tại Châu phi,

Vigna angularis được trồng thí nghiệm ở Congo, Kenya và Angola Khó có thể ghi lại số liệu sản

lượng đậu Vigna angularis trên toàn thế giới vì nó được thống kê cùng với các loại đậu khác: Trung

Quốc (470,000 ha), Nhật (60,000 ha), Hàn Quốc (25,000 ha) và Đài Loan (15,000 ha) Từ 1996 đến

2000, Nhật sản xuất hằng năm từ 70000 đến 90000 tấn, trong đó khoảng 80 đến 85% sản lượng này được thu hoạch từ phía bắc quần đảo Hokkaido5.5 Tuy nhiên, mỗi năm Nhật Bản tiêu thụ 140.000 tấn nên phải nhập khẩu đậu từ các quốc gia như Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan và Canada Vào những năm của thập niên 90, Trung Quốc hằng năm xuất khẩu trung bình 20.000 đến 40.000 tấn Gần đây,

Trung Quốc và Úc đã hợp tác nghiên cứu về việc sản xuất Vigna angularis Hạt và bột làm từ hạt là

hai thứ hàng hóa quan trọng trong các chợ phương đông (5Singh và Jauhar, 2005;5 Brink và Belay, 2006) Ở nước ta, trồng lấy hột ở Nha Trang, Sài Gòn (Phạm Hoàng Hộ, 1999)

1 1 4 Thành ph ần hóa học

Hạt đậu Vigna angularis có vị ngọt 100 g hạt đậu chứa: nước 13,4 g; năng lượng 1377 kJ;

protein 19,9 g; chất béo 0,5 g; carbohydrat 62,9 g; chất xơ 12,7 g; Ca 66 mg; Mg 127 mg; P 381 mg;

Fe 5,0 mg; Zn 5,0 mg; vitamin A 17 IU; thiamin 0,46 mg; riboflavin 0,22 mg; niacin 2,6 mg, vitamin BR 6 R 0,35 mg; folat 622 μg Ngoài ra, hạt đậu này còn có các axit amin không thay thế: tryptophan 191 mg; lysin 1497 mg; methionin 210 mg; phenylalanin 1052 mg; threonin 674 mg; valin 1023 mg; leucin 1668 mg và isoleucin 791 mg; và hứa các axit béo như axit linoleic 113 mg

và axit oleic 50 mg (Brink và Belay, 2006)

1 1 5 Giá tr ị thực phẩm và giá trị dược liệu

Hạt đậu khô có thể nấu chín để ăn hay làm thành bột dùng cho các món súp, các loại bánh và kem Việc sử dụng đậu Vigna angularis gắn liền với nền văn hóa của quốc gia Người Nhật có quan niệm Vigna angularis biểu hiện của sự thành công và may mắn Vì thế, Ở Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc và Nhật, vào những dịp chúc mừng hạnh phúc như sinh nhật, đám cưới, kì thi… Vigna

angularis được nấu chung với nếp để ăn Người Nhật còn xem Vigna angularis là thành phần quan

trọng trong những món ăn truyền thống như bánh bao, bột đậu trộn với agar để làm món tráng miệng Ở Trung Quốc, bột đậu trộn với bột mì để làm sợi mì Ở Nepal, người ta còn lấy những trái còn non và cây mầm giá để làm rau cải (Singh and Jauhar5, 2005)5

Ngoài ra, hạt Vigna angularis rang lên có thể được dùng để thay thế cho cà phê hay tẩm

đường để ăn Thân cây có thể dùng làm thức ăn cho gia súc hay làm phân bón cho đất Đặc biệt, bột đậu còn thể dùng để sản xuất dầu gội, kem dưỡng da mặt hay là thành phần trong môi trường nuôi

cấy Người Trung Quốc còn biết sử dụng hạt đậu Vigna angularis để chữa các bệnh về thận, chứng

táo bón, khối u, xảy thai, không tiết sữa, sự lưu thông máu, lợi tiểu Lá đậu có tác dụng hạ sốt, còn cây mầm ngăn chặn sự xảy thai do bị thương ( Brink và Belay, 2006)

Ở Việt Nam, tuy không được dùng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, Vigna angularis được các thầy thuốc Đông y coi là một vị thuốc dễ sử dụng và an toàn Vigna angularis có tính mát, giúp giải nhiệt, chữa chứng suy nhược cơ thể Rễ đắp trị sưng; hột lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ,

1999)

Vigna angularis là một loại đậu phổ biến nhất ở Nhật, được nghiên cứu về mặt nông học cũng như thực vật học Một số tác giả cho rằng phát sinh hình thái phấn hoa là một trong những

điểm phân biệt đáng chú ý giữa chi Phaseolus và chi Vigna ((Ohashi và Tahashahi, 1981; Merechal

et al., 1978)

Để tăng khả năng kháng thuốc diệt cỏ, các gen hpt, gfp và phosphinothricin bar được chuyển vào Vigna angularis nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Mutasim et al., 2004)

Một nhóm nhà khoa học phát hiện dịch chiết từ vỏ hạt Vigna angularis có chứa các

proanthocyanidin và chất xơ nên có thể chống oxi hóa, chống chứng tăng huyết áp và chữa trị thận

hư (Sato et al., 2009)

Nhóm nhà khoa học người Úc đã nghiên cứu hiệu quả thời gian và các điều kiện cất giữ tác động đến tinh bột, protein, độ cứng và chất lượng hạt khi nấu Để giữ được chất lượng đậu, tốt nhất nên bảo quản ở 10 0C, độ ẩm 65% (Yousif et al., 2002)