Vai trò của auxin trong sự phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân cây đậu vigna angularis (willd ) ohwi et ohashi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS ( WILLD.) OHWI ET OHASHI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS ( WILLD.) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BÙI TRANG VIỆT TS LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Đề tài thực phòng thí nghiệm môn sinh lí thực vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Sư phạm- Tp Hồ Chí Minh, hướng dẫn giúp đỡ Quý Thầy Cô Để hoàn thành luận văn này, em chân thành gởi lời cảm ơn đến: Thầy hướng dẫn PGS TS Bùi Trang Việt tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian làm luận văn Cô hướng dẫn TS Lê Thị Trung tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm tạo điều kiện thuận lợi để em thực thí nghiệm cho luận văn Em xin chân thành cảm ơn cô TS Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS Trần Thị Thanh Thủy, cô TS Trần Thị Cúc, cô TS Nguyễn Thị Mong, thầy TS Phạm Văn Ngọt, thầy PGS TS Bùi Văn Lệ giảng dạy suốt thời gian em học tập trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn sinh lí thực vật trường ĐHKHTN: cô TS Trần Thanh Hương, Thầy ThS Phan Ngô Hoang, cô ThS Trịnh Thị Cẩm Tú, cô ThS Trần Thanh Hiền em Hồ Thị Mỹ Linh quản lí phòng thí nghiệm trường ĐHSP cho em mượn dụng cụ hóa chất để thực thí nghiệm Cảm ơn BGH trường THPT Nguyễn Văn Linh dã giúp đỡ để có thời gian hoàn thành chương trình học Xin gởi lời cảm ơn đến bạn lớp sinh học thực nghiệm khóa 19, khóa 20, bạn bè đồng nghiệp em sinh viên phòng môn sinh lí thực vật Cuối cùng, xin nói lời cảm ơn vô hạn với bố mẹ, người cố gắng nuôi dưỡng dạy dỗ để học tập trưởng thành Chị Nhiên cho em bày tỏ lòng biết ơn tới hai người nhé, có hi sinh định để em thực ước mơ làm cô giáo Cảm ơn bé Trinh nấu cơm cho chị suốt năm qua Cảm ơn anh bên em, yêu thương chia với em sống Tp HCM, tháng năm 2011 Nguyễn Hồ Dịu Thắm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 4T T MỤC LỤC 4T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4T 4T LỜI MỞ ĐẦU 4T T CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4T T 1 Giới thiệu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 4T T 1.1 Phân loại T 4T 1 Đặc điểm sinh học T 4T 1 Nguồn gốc, phân bố tình hình sản xuất giới T T 1 Thành phần hóa học T 4T 1 Giá trị thực phẩm giá trị dược liệu T T 1 Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi T T 1.2 Sự phát sinh hình thái 4T 4T Định nghĩa T 4T 2 Phương pháp nghiên cứu T 4T Sự phát sinh rễ T 4T Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh hình thái 4T T Vai trò auxin tăng trưởng thực vật T T 1 Sinh tổng hợp vận chuyển auxin T T Auxin phát triển rễ 10 T T 3 Auxin sinh trưởng, phân chia phân hóa tế bào 11 T T Vai trò giberelin tăng trưởng thực vật 11 T T Sự phát 11 T 4T 2 Nơi tổng hợp di chuyển 12 T 4T 3 Tác dụng sinh lí 12 T 4T 3 Vai trò Citokinin tăng trưởng thực vật 13 T T 3 Sự phát 13 T 4T 3 Nơi tổng hợp 13 T 4T 3 Tác dụng sinh lí 13 T 4T Vai trò axit abcisic (AAB) 14 T 4T Vai trò Etilen 15 T 4T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP 16 4T T 2.1 Vật liệu 16 4T T 2 Phương pháp 16 4T 4T 2 Khử trùng mẫu 16 T 4T 2 Nuôi cấy hạt tạo in vitro 17 T 4T 2 Khảo sát ảnh hưởng IAA BA lên khả tạo rễ in vitro 17 T T 2 Khảo sát ảnh hưởng auxin phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp đậu Vigna angularis 17 T 4T 2 Ảnh hưởng auxin lên phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis 18 T 4T 2 Ảnh hưởng auxin nồng độ cao lên phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis 18 T 4T 2 Khảo sát phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian ảnh hưởng auxin 19 T T 2 Khảo sát di chuyển hữu cực auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp 19 T T 2 Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích Vigna angularis ngày tuổi 19 T T 2 10 Đo cường độ hô hấp 19 T 4T 2 11 Đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật 19 T T 2 12 Xử lý thống kết thu 20 T 4T CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 21 4T T 3.1 Kết 21 4T T 1 Khử trùng mẫu 21 T 4T Nuôi cấy hạt tạo in vitro 21 T 4T 3 Khảo sát ảnh hưởng IAA BA lên chiều cao khả tạo rễ in vitro 23 T T 4 Ảnh hưởng auxin lên giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp đậu Vigna angularis 25 T 4T Ảnh hưởng auxin lên giai đoạn phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis ngày tuổi 30 T 4T Ảnh hưởng auxin nồng độ cao lên phát sinh rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis ngày tuổi 35 T 4T Khảo sát hình thành rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis ngày tuổi theo thời gian ảnh hưởng nồng độ auxin 37 T T Khảo sát di chuyển hữu cực auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp 38 T T Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích đậu Vigna angularis 39 T T 10 Sự thay đổi cường độ hô hấp chất điều hòa tăng trưởng thực vật trình phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp Vigna angularis 40 T T Thảo luận 41 4T T Khử trùng mẫu 41 T 4T 2 Ảnh hưởng AIA BA lên khả tạo rễ in vitro 41 T T 3 Ảnh hưởng auxin lên giai đoạn hình thành phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp trụ thượng diệp 42 T T 4 Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp vị trí theo thời gian ảnh hưởng auxin 5mg/l 44 T T Khảo sát di chuyển hữu cực auxin 44 T T Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích 44 T T Sự thay đổi cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát triển rễ bất định 45 T T CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 4T T 4.1 Kết luận 46 4T T 4 Đề nghị 46 4T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 4T 4T PHỤ LỤC 4T T PHỤ LỤC 4T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisic acid BA : Benzyl adenin CĐHTTTV : chất điều hòa tăng trưởng thực vật GA R : Gibberellin R IAA : Indole-3-acetic acid MS : Murashige Skoog TLT : trọng lượng tươi LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ giai đoạn đầu người biết trồng trọt, họ có ý thức chọn lọc trồng mang đặc tính có lợi cho người Quá trình chọn lọc phải nhiều thời gian, hàng chục hàng trăm năm không mang lại hiệu cao Đến đầu kỉ XX, sinh học đạt nhiều thành tựu lớn khám phá định luật di truyền Mendel, tượng di truyền liên kết Morgan nghiên cứu khác nữa, nhờ tạo trồng mang biến dị tổ hợp nhiều gen có lợi Và kĩ thuật gây đột biến đời góp phần tạo nhiều giống có đặc tính quý Ngày chất lượng sống gia tăng, thị hiếu người phong phú, nhu cầu lương thực, thực phẩm lớn Làm nhân nhanh nhiều giống hay tạo nhiều giống nhằm đáp ứng thị hiếu nhu cầu người vấn đề lớn đặt cho nhà chọn lọc tạo giống vật nuôi trồng Phát sinh hình thái sở cho vi nhân giống thực vật nên giới nước ta quan tâm Việc phát auxin chất điều hòa tăng trưởng thực vật mở cho nghiên cứu trồng trọt đầy hấp dẫn Auxin kích thích khúc cắt hình thành rễ bất định bước đột phá lớn cho nhân giống thực vật ( Environ, 2007 ) Đề tài “Vai trò auxin phát phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi” thực nhằm tìm hiểu giai đoạn phát triển rễ bất định in vitro đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi ảnh hưởng auxin để bổ sung kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu giảng dạy CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Giới thiệu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1.1 Phân loại Giới : Plantae Ngành : Angiospermae Lớp : Dicotiledoneae Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Chi : Vigna Loài : Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng Hộ, 1999) 1 Đặc điểm sinh học Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi cỏ niên, thân đứng hay leo, cao 50 đến 80 cm, nhánh có cạnh, có lông dài Bộ nhiễm sắc thể 2n = 22 Cuống 10 đến 12 cm, có lông, phụ xoan, đầu tròn, có thùy, dài đến cm, gân phụ đến cặp, bẹ thon, hình lọng, cao mm Chùm nách lá, dài đến 10 cm, đài ngắn; vành vàng, cao 15 mm, lườn xoắn 360 ( Phạm Hoàng Hộ, 1999 ) Hoa có màu vàng nhạt với cánh hoa màu vàng chanh xếp thành cặp Quả hình trụ, dài đến 8cm, rộng đến 10mm, lông, chứa đến 10 hạt Hạt có hình thuôn, hai đầu vuông, lông, dài đến 7mm , đường kính 5mm, màu nâu sẫm ( Hu, 2005 ) Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi giữ năm độ ẩm hạt 13% độ ẩm không khí 15% Hạt nẩy mầm đất nhiệt độ đến 10 0C tốt 30 đến P P 34 0C Sau trỉa đến 20 ngày mầm nhô lên khỏi mặt đất So với đậu khác, Vigna P P angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi phát triển chậm nên cần làm cỏ giai đoạn nảy mầm hoa (Brink Belay, 2006) Hình 1.1 Một số phận : a nhánh; b hoa; c.đài; d nhụy; e nhị; f.quả; g hạt (Nguồn: Hu, 2005) Hoa kéo dài 30 đến 40 ngày Cây tự thụ phấn xảy thụ phấn chéo Thời gian sinh trưởng khoảng 60, 80, 90 hoặc120 ngày Rễ cộng sinh với vi khuẩn Bradyrhizobium nên có khả cố định N 100kg N/ ha, số phụ thuộc vào độ ẩm pH đất (Brink Belay, 2006) Vigna angularis sống tốt vùng có khí hậu ấm áp cận nhiệt đới với lượng mưa trung bình năm 500 đến 1750 mm, nhiệt độ từ 15 đến 300C Cây chịu nhiệt độ cao P P nhạy cảm với sương mù Ở nhiệt đới, Vigna angularis thích hợp vùng cao độ pH đất từ đến 7,5 (Brink Belay, 2006) Ở Trung Quốc, Vigna angularis thường trồng xen với ngô kê, Nhật luân canh xen vụ với khoai tây, củ từ hay lúa mì Vigna angularis thường bị nhiễm bệnh nấm, vi khuẩn hay côn trùng công Erysiphe polygoni, Xanthomonas campestris, Matsumuraeses phaseoli … Quả đậu không dễ vỡ nên người ta thu hoạch máy gặt Thông thường, người ta cắt tay sau phơi nhiều ngày trước xếp thành đống khô Khi độ ẩm hạt 16% tiến hành đập Nhiều trái đậu có vỏ mỏng, hạt lại ẩm ướt nên nảy mầm bên vỏ Sản lượng hạt thu hoạch đạt đến 3500kg Ở Kenya, người ta trồng thí nghiệm thu khoảng 500 đến 600 kg (Brink Belay, 2006) 1 Nguồn gốc, phân bố tình hình sản xuất giới Vigna angularis trồng vùng châu Á nguồn gốc chưa biết (Ohashi Tahashahi, 1981) Việc hóa Vigna angularis biết tới từ thời xa xưa Hàn Quốc, Trung Quốc T 2T 2T T Nhật, sau trồng giới thiệu tới nhiều quốc gia khác giới Tại Châu phi, T 2T Vigna angularis trồng thí nghiệm Congo, Kenya Angola Khó ghi lại số liệu sản lượng đậu Vigna angularis toàn giới thống kê với loại đậu khác: Trung Quốc (470,000 ha), Nhật (60,000 ha), Hàn Quốc (25,000 ha) Đài Loan (15,000 ha) Từ 1996 đến 2000, Nhật sản xuất năm từ 70000 đến 90000 tấn, khoảng 80 đến 85% sản lượng thu hoạch từ phía bắc quần đảo Hokkaido Tuy nhiên, năm Nhật Bản tiêu thụ 140.000 T T nên phải nhập đậu từ quốc gia Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan Canada Vào năm thập niên 90, Trung Quốc năm xuất trung bình 20.000 đến 40.000 Gần đây, Trung Quốc Úc hợp tác nghiên cứu việc sản xuất Vigna angularis Hạt bột làm từ hạt hai thứ hàng hóa quan trọng chợ phương đông (Singh Jauhar, 2005; Brink Belay, T T 2006) Ở nước ta, trồng lấy hột Nha Trang, Sài Gòn (Phạm Hoàng Hộ, 1999) 1 Thành phần hóa học Hạt đậu Vigna angularis có vị 100 g hạt đậu chứa: nước 13,4 g; lượng 1377 kJ; protein 19,9 g; chất béo 0,5 g; carbohydrat 62,9 g; chất xơ 12,7 g; Ca 66 mg; Mg 127 mg; P 381 mg; Fe 5,0 mg; Zn 5,0 mg; vitamin A 17 IU; thiamin 0,46 mg; riboflavin 0,22 mg; niacin 2,6 mg, vitamin B 0,35 mg; folat 622 μg Ngoài ra, hạt đậu có axit amin không thay thế: R R tryptophan 191 mg; lysin 1497 mg; methionin 210 mg; phenylalanin 1052 mg; threonin 674 mg; valin 1023 mg; leucin 1668 mg isoleucin 791 mg; hứa axit béo axit linoleic 113 mg axit oleic 50 mg (Brink Belay, 2006) 1 Giá trị thực phẩm giá trị dược liệu Hạt đậu khô nấu chín để ăn hay làm thành bột dùng cho súp, loại bánh kem Việc sử dụng đậu Vigna angularis gắn liền với văn hóa quốc gia Người Nhật có quan niệm Vigna angularis biểu thành công may mắn Vì thế, Ở Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc Nhật, vào dịp chúc mừng hạnh phúc sinh nhật, đám cưới, kì thi… Vigna angularis nấu chung với nếp để ăn Người Nhật xem Vigna angularis thành phần quan trọng ăn truyền thống bánh bao, bột đậu trộn với agar để làm tráng miệng Ở Trung Quốc, bột đậu trộn với bột mì để làm sợi mì Ở Nepal, người ta lấy trái non mầm giá để làm rau cải (Singh and Jauhar, 2005) T T Ngoài ra, hạt Vigna angularis rang lên dùng để thay cho cà phê hay tẩm đường để ăn Thân dùng làm thức ăn cho gia súc hay làm phân bón cho đất Đặc biệt, bột đậu thể dùng để sản xuất dầu gội, kem dưỡng da mặt thành phần môi trường nuôi cấy Người Trung Quốc biết sử dụng hạt đậu Vigna angularis để chữa bệnh thận, chứng táo bón, khối u, xảy thai, không tiết sữa, lưu thông máu, lợi tiểu Lá đậu có tác dụng hạ sốt, mầm ngăn chặn xảy thai bị thương ( Brink Belay, 2006) Ở Việt Nam, không dùng rộng rãi chế biến thực phẩm, Vigna angularis thầy thuốc Đông y coi vị thuốc dễ sử dụng an toàn Vigna angularis có tính mát, giúp giải nhiệt, chữa chứng suy nhược thể Rễ đắp trị sưng; hột lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ, 1999) 1 Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi Vigna angularis loại đậu phổ biến Nhật, nghiên cứu mặt nông học thực vật học Một số tác giả cho phát sinh hình thái phấn hoa điểm phân biệt đáng ý chi Phaseolus chi Vigna ((Ohashi Tahashahi, 1981; Merechal et al., 1978) Để tăng khả kháng thuốc diệt cỏ, gen hpt, gfp phosphinothricin bar chuyển vào Vigna angularis nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Mutasim et al., 2004) Một nhóm nhà khoa học phát dịch chiết từ vỏ hạt Vigna angularis có chứa proanthocyanidin chất xơ nên chống oxi hóa, chống chứng tăng huyết áp chữa trị thận hư (Sato et al., 2009) Nhóm nhà khoa học người Úc nghiên cứu hiệu thời gian điều kiện cất giữ tác động đến tinh bột, protein, độ cứng chất lượng hạt nấu Để giữ chất lượng đậu, tốt nên bảo quản 10 0C, độ ẩm 65% (Yousif et al., 2002) P P 1.2 Sự phát sinh hình thái Định nghĩa Phát sinh hình thái thuật ngữ dùng để thay đổi thể thực vật theo thời gian để hoàn thành chu trình phát triển ( Bùi Trang Việt, 2003 ) Phát sinh hình thái thực vật bao gồm trình: - Phát sinh mô ( Histogenesis ) - Phát sinh quan (Organogenesis) - Phát sinh phôi ( Embryogenesis ) Phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai trình bản: điều hòa hướng kéo dài tế bào kiểm soát vị trí hướng mặt phẳng phân chia tế bào Chính kiểu tăng trưởng tế bào riêng rẽ đinh hình thái quan thể thực vật ( Bùi Trang Việt, 2003 ) 2 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu phát sinh hình thái in vitro dẫn tới nhiều ứng dụng sinh học thực vật cho nghiên cứu thực vật học, sinh hóa học, vi nhân giống phát triển trồng chuyển gen ( transgenic crops ) ( Lund et al., 2008; Mironova et al., 2010; Phillips, 2008 ) Phát sinh hình thái vấn đề phức tạp sinh học Nhiều nhà sinh học thực vật cho mô tả hình thái cấu trúc thực vật mà cần phải tìm hiểu nguồn gốc phát sinh yếu tố liên quan biến đổi hình thái cấu trúc Do đó, kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ chứng minh tất khía cạnh Những kĩ thuật từ nhiều lĩnh vực khác mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học di truyền học giúp ta tìm hiểu tượng phát sinh hình thái ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Trong số phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường dùng là: - Cắt bỏ vùng lân cận mô phân sinh theo dõi biến đổi phát triển sau - Nuôi cấy in vitro điều kiện vô trùng có kiểm soát phần tách rời thể thực vật Trong thí nghiệm in vitro, nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành kích thước bé nhỏ loại mô cấy, nên áp dụng hormon thực vật ngoại sinh cách hữu hiệu phát sinh hình thái ( Bùi Trang Việt, 2000 ) 1 Sự phát sinh rễ Rễ mầm phát triển từ sinh mô chóp (tiền sinh mô) Sinh mô có hoạt tính đặc biệt riêng cho loài thực vật Về nguồn gốc rễ có hai cách giải thích: - Do ba tế bào nguyên thủy tạo ra: tạo vùng trục trung tâm, tạo vùng vỏ, tạo vùng chóp Có thể vùng có tế bào nguyên thủy riêng - Chóp rễ vỏ tạo thành nhóm không phân biệt tế bào nguyên thủy chung cho ba vùng Vì rễ thường khởi đầu từ trụ nên rễ thường cho có nguồn gốc nội sinh Tuy nhiên, Cardamine pratensis, thay đổi xảy vùng tế bào nằm phía vùng trụ Đây trường hợp rễ có nguồn gốc ngoại sinh Sau thoát khỏi vỏ hạt tăng trưởng, rễ phát triển tạo rễ nhánh rễ phụ Sự phát triển gồm loại phản ứng phân hóa Rễ nhánh xuất rễ chính, chế giống rễ bất định Sự tạo rễ bất định bước ngoặc quan trọng nhân giống vô tính gỗ quý, lương thực, thực phẩm Rễ bất định rễ thông thường thực vật có mạch tạo nhiều vùng thể thực vật đốt, nhánh phụ, lá, thực vật cấp thấp có mạch; đơn tử diệp hay song tử diệp nhân giống giò, dây leo hay thủy thực vật thực vật sống bám vào chủ Hiện tượng hình thái giải phẫu thực vật chung cho hai quan rễ nhánh rễ bất định ( Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001) Rễ bất định mọc từ mô thân điều kiên môi trường stress hay bị vết thương học môi trường tái sinh chồi Có hai đường hình thành rễ bất định: từ tế bào có khả tạo quan tế bào tượng tầng hay từ mô sẹo ( Pop et al., 2011 ) Sự hình thành rễ bất định điều hòa nhiều nhân tố môi trường yếu tố nội sinh ( Sorin et al., 2005 ) Các tác giả cho cân chất hoạt hóa chất ức chế phiên mã Auxin Response Factor ( ARF ) điều khiển tượng rễ bất định (Gutierrez et al., 2009 ) Auxin etilen xem hormon kích thích hình thành rễ bất định cytokinin gibberelin ngược lại (Pop et al., 2011) Sự hình thành rễ bất định cành chiết, cành giâm chia làm ba giai đoạn: + Giai đoạn đầu tái phân chia mô phân sinh bên (tầng phát sinh) tức số tế bào xảy phản phân hóa mạnh vùng xuất rễ tạo nên đám tế bào lộn xộn mầm mống rễ ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ) Giai đoạn khử phân hóa tế bào xảy sau: lúc ban đầu không bào to, lạp thể ti thể phân cắt mạnh, lúc nhỏ, tế bào trở nên giống tế bào mô phân sinh cấp hai; sau tế bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân hạch nhân to Sau giai đoạn hoạt hóa này, tế bào có đặc tính tế bào vùng mô phân sinh cấp có khả sinh quan Tiếp theo, tế bào có phát triển mạnh hoạt tính phân chia tế bào để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ Sự phân chia tăng lên tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa tế bào mô phân sinh cấp ( Bùi Trang Việt, 2003 ) + Giai đoạn giai đoạn xuất mầm rễ + Giai đoạn cuối sinh trưởng kéo dài rễ, rễ thoát khỏi vỏ tạo nên rễ bất định ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ) A B Hình 1.2 Sự hình thành phát triển rễ A: Sự hình thành sơ khởi rễ; B: Sơ khởi rễ rễ kéo dài ( Nguồn: Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001 ) Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh hình thái Mở đầu thực cho nghiên cứu hormon tăng thực vật đánh dấu thí nghiệm Darwin ( 1880 ) hiệu ứng ánh sáng cong diệp tiêu Avena phát Went (1928 ) vai trò kích thích kéo dài tế bào auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Hormon thuật ngữ nhà sinh lí học động vật Bayliss Starling gọi vào năm 1904 Dựa vào định nghĩa hormon động vật, ta có định nghĩa: “hormon thực vật chất hữu tế bào tạo nơi thể thực vật chuyển tới nơi khác, đó, với nồng độ thấp, chất gây phản ứng sinh lý” Song song với hormon tổng hợp thể thực vật, ngày đường hóa học người tổng hợp nên hàng loạt chất khác có hoạt tính sinh lí tương tự có ứng dụng rộng rãi nông nghiệp (Vũ Văn Vụ cs, 2008 ) Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật chất dinh dưỡng, vitamin hay nguyên tố khoáng thiết yếu cho thực vật (Bùi Trang Việt, 2000 ) thành phần quan trọng bậc môi trường nuôi cấy Nhờ chất này, nhà nghiên cứu chủ động điều khiển trình phát sinh hình thái thực vật in vitro (Vũ Văn Vụ cs, 2008 ) Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng việc đảm bảo mối quan hệ hài hòa quan, phận thể điều chỉnh trình sinh trưởng, phát triển hoạt động sinh lí thực vật ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ) Chất điều hòa sinh trưởng thực vật tác động đến thực vật cách trực tiếp ( phân chia tế bào, tăng trưởng tế bào) hay gián tiếp ( tương tác với hormon phân tử khác ) (Pop et al., 2011) Hai nhóm chất sử dụng rộng rãi auxin citokinin (Vũ Văn Vụ cs, 2008 ) Vai trò auxin tăng trưởng thực vật Auxin hợp chất tương đối đơn giản: acid indol-3-acetic ( IAA) Các chất có cấu trúc gần giống IAA dẫn xuất hay tiền chất IAA, có vai trò với IAA vài quan gọi auxin theo nghĩa rộng 1 Sinh tổng hợp vận chuyển auxin Auxin tổng hợp thân, mô phân sinh (ngọn lóng) non, từ tryptophan tổng hợp trưởng thành ánh sáng Sau auxin di chuyển xuống rễ tích tụ rễ Trong trình phát sinh hình thái, di chuyển auxin có vai trò việc thiết lập tính hữu cực quan thực vật tác động theo nồng độ phát sinh quan ( Bùi Trang Việt, 1998; Berleth cs, 2001) Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần quan với phân cực rõ ràng nhìn rõ quan thực vật non, trình chuyển vận này, chúng bị thoái hóa auxin – oxydase, điều cho thấy nồng độ auxin cao gần với nơi tổng hợp chúng Như auxin diện với nồng độ vừa đủ mức độ điểm tăng trưởng phát hoa để đảm bảo nhân giống kéo dài tế bào ( Dương Công Kiên, 2002 ) Auxin tổng hợp thường không dạng tự mà dạng liên kết với acid amin hay glucid Các dạng liên kết hoạt tính auxin mà dạng dự trữ vận chuyển auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Sự di chuyển hữu cực từ tới gốc cần lượng, tùy thuộc vào định hướng mô, chịu ảnh hưởng trọng lực, chậm, thường xảy tế bào nhu mô bao quanh bó mạch thân tế bào diệp tiêu ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Auxin phát triển rễ Auxin đóng vai trò quan trọng trình phát sinh hình thái Đặc tính di chuyển hiệu ứng theo nồng độ auxin định chiều hướng tính hữu cực phát sinh quan (Sachs, 1993) Từ auxin lần đầu mô tả, nhà nghiên cứu tìm thấy liên hệ chặt chẽ auxin với phát triển rễ (Overvoorde et al., 2010) Auxin giúp kéo dài tế bào, phân chia, phát triển trì mô phân sinh rễ (Mironova et al., 2010) Một hiệu ứng rõ nét auxin phân hóa tế bào chứng thực từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann) khả phát sinh rễ Hiệu ứng tạo nên ứng dụng quan trọng auxin chất gần giống auxin, sở tất sản phẩm thương mại (bột nhão hay dung dịch ) nhằm xúc tiến giâm cành (Nguyễn Như Khanh, 2007) Auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ ( phát thể non rễ ), ngăn cản tăng trưởng sơ khởi Đặc tính ứng dụng phổ biến giâm cành, tượng chứng minh bao gồm hai giai đoạn: tạo sơ khởi kéo dài sơ khởi (Mai Trần Ngọc Tiếng cs, 1980) Trong tạo rễ, auxin cần phối hợp với vitamin ( thiamin mà rễ không tổng hợp được), axit amin (như arginin) hợp chất ortho- diphenolic ( axit cafeic, axit chlorogenic) (Bùi Trang Việt, 2000) Vai trò auxin cho phân hóa rễ thể rõ nuôi cấy mô Trong môi trường có auxin mô nuôi cấy xuất rễ mà Vì kĩ thuật nhân giống vô tính việc sử dụng auxin để kích thích rễ quan trọng bắt buộc ( Vũ Văn Vụ, 1999) Nhiều nghiên cứu chứng minh auxin cảm ứng tượng rễ bất định (adventitious root initiation) khúc thân in vitro với nồng độ auxin khác ( Lund et al., 2008; Mironova et al., 2010; Sorin et al., 2005) Cùng với chất, nồng độ khuynh độ auxin (auxin gradients) giải thích phần tạo rễ bất định mức phân tử (Gutierrez et al 2009) Những thay đổi nồng độ auxin nội sinh liên quan với giai đoạn sinh lí rễ, nồng độ auxin nội sinh cao thường ứng với giai đoạn hình thành sơ khởi rễ (Caboni et al., 1997) Khi xử lí auxin ngoại sinh khúc cắt, nồng độ auxin nội sinh đạt tới đỉnh cao trùng với thời điểm tạo sơ khởi rễ (Pop et al., 2011) Điều đáng lưu ý việc sử dụng auxin có hiệu ức chế nồng độ thấp hệ rễ Đối với rễ, auxin có tác dụng kích thích nồng độ thấp khoảng 10 -10 – P P 10-12 M; thân nồng độ cao 10-6 – 10-7 M Trong auxin NAA IBA hai loại sử P P P P P P dụng nhiều môi trường nuôi cấy mô IAA dùng bền hấp khử trùng môi trường (Võ Thị Bạch Mai, 2004 ) 3 Auxin sinh trưởng, phân chia phân hóa tế bào Auxin có ảnh hưởng quan trọng tăng trưởng phát sinh hình thái thực vật Auxin cần thiết cho phân chia tăng trưởng tế bào thực vật ( Bùi Trang Việt, 2000) Auxin kích thích sinh trưởng giãn tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ( Vũ Văn Vụ, 2008 ) Auxin kích thích mạnh kéo dài tế bào diệp tiêu tế bào vùng kéo dài thân Sự kéo dài tế bào rễ cần nồng độ thấp nhiều so với tế bào thân Ở nồng độ cao, auxin kích thích tạo mô sẹo từ tế bào sống Đặc tính áp dụng nuôi cấy tế bào ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Auxin kích thích mạnh phân chia tế bào tượng tầng ( tầng phát sinh libe- mộc ) đồng thời giúp phân hóa mô dẫn (libe- mạch mộc), không tác động mô phân sinh sơ cấp Như auxin tác động tăng trưởng theo đường kính ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Vai trò giberelin tăng trưởng thực vật Sự phát Năm 1926 Kurosawa (Nhật) phát chất trích nấm Gibbrella fujikuroi gây bệnh lúa von Năm 1938 Yabuta Sumili cô lập từ Gibbrella hỗn hợp mà họ gọi giberelin chưa rõ chất (Bùi Trang Việt, 2000) Năm 2003, 126 loại GA khác với vòng gibban tìm thấy thực vật nấm Giberelin nhóm lớn, giberelin A x hay G x theo thứ tự R R R R khám phá (Võ Thị Bạch Mai, 2004) 2 Nơi tổng hợp di chuyển Axit mevalonic chất khởi đầu tổng hợp giberelin Trong cây, giberelin dạng tự dạng liên kết với chất khác (glucose, protein…) Giberelin tổng hợp non, phôi, rễ non, non tổng hợp mạnh lục lạp Giberelin chuyển từ mạch mộc qua libe nhờ liên hệ hai hệ thống Giberelin qua mạch nhờ tế bào tia lõi Giberelin di chuyển nhờ thoát nước Trong bị cắt đứt ngọn, giberelin đẩy theo ảnh hưởng sức đẩy rễ ( Mai Trần Ngọc Tiếng , 2001 ) 3 Tác dụng sinh lí Giberelin kích thích kéo dài lóng, vừa kéo dài vừa phân chia nhân tế bào thân Giberelin kích thích mạnh phân chia tế bào nhu mô vỏ biểu bì Giberelin liều cao kích thích mạnh tăng trưởng Trên yến mạch hay diệp tiêu lúa, giberelin có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Giberelin ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng dạng đột biến lùn Ảnh hưởng đặc trưng giberelin lên hoa kích thích sinh trưởng kéo dài nhanh chóng cụm hoa Trong biểu phái tính hoa, giberelin ức chế phát triển hoa (Vũ Văn Vụ cs, 2008), kích thích tạo hoa đực ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật, giberelin làm giảm bớt ngăn cản tạo chồi, rễ bất định phát sinh phôi xoma Ở mô sẹo thuốc lá, GA đặc biệt có tác dụng cản R R tạo chồi có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng cản mạnh mẫu cấy nuôi tối Thông thường GA3 có tác dụng cản rễ xử lí cành giâm với GA3 R R R R nồng độ cao (1-10mg/l) vị trí đáy cành giâm cành không tạo rễ (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Ở số loài thực vật, xử lí GA3 trước chuyển cành giâm vào môi trường rễ làm R R tăng tạo rễ Tác dụng làm tăng rễ xảy cách mạnh mẽ xử lí acid giberelic xuất rễ bắt đầu, sau thời gian ngắn sau acid giberelic lại có tác dụng cản (Nguyễn Đức Lượng- Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo lại dòng bệnh, ích lợi việc thêm kích thích tố giberelin vào môi trường nuôi cấy kiểm tra Pennazio Redolfi (1974), hai tác giả quan sát thấy việc gia tăng hồi phục nuôi cấy lên đến 49% so với đối chứng môi trường lỏng (Dương Công Kiên, 2002 ) Nồng độ giberelin sử dụng môi trường nuôi cấy khoảng từ 0,1 đến 10 ppm, thường dùng dạng acid giberelic (GA ) (Võ Thị Bạch Mai, 2004) R R 3 Vai trò Citokinin tăng trưởng thực vật 3 Sự phát Năm 1938 Bonner trích từ trái đậu chất làm tăng trưởng tế bào trái gọi citokinin Năm 1955 Miller Skoog chiết xuất từ tinh dịch cá thu chất có khả kích thích phân chia tế bào mạnh gọi kinetin Năm 1963 Letham Miller chứng minh chất trích từ phôi nhũ bắp non có hiệu ứng với kinetin, gọi zeatin Sau zeatin, 30 citokinin khác cô lập Ngày nay, citokinin nhóm chất thiên nhiên hay nhân tạo có đặc tính sinh lý giống nước dừa hay kinetin (Bùi Trang Việt, 2000) 3 Nơi tổng hợp Citokinin dạng liên kết dạng tự tương tự phytohormon khác ( Vũ Văn Vụ cs 2008 ) Mô phân sinh rễ nơi tổng hợp chủ yếu citokinin tự cho thể thực vật Từ rễ, citokinin di chuyển mạch mộc để tới chồi ( Bùi Trang Việt, 2000; Kieber, 2002 ), rễ bị thương có phát triển yếu nụ không tạo đủ citokinin ( Mai Trần Ngọc Tiếng , 2001 ) Ngoài ra, số quan non sinh trưởng mạnh có khả tổng hợp citokinin chồi, non, non, tầng phát sinh ( Vũ Văn Vụ cs, 2008 ) 3 Tác dụng sinh lí Kích thích phân chia tế bào Citokinin kích thích phân chia tế bào với điều kiện có auxin Citokinin tác động hai bước phân chia tế bào: phân nhân phân bào ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Có hiệu citokinin hoạt hóa mạnh mẽ tổng hợp axit nucleic protein ( Vũ Văn Vụ cs, 2008 ) Khi nuôi cấy mô nghèo citokinin ( mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu ), auxin kích thích nhân đôi nhiễm sắc thể, chí tạo tế bào hai nhân, phân vách ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Kích thích tạo quan Citokinin ảnh hưởng rõ rệt đặc trưng lên phân hóa quan thực vật, đặc biệt phân hóa chồi ( Vũ Văn Vụ cs, 2008 ) Citokinin kích thích tăng trưởng lá, phân hóa mầm