Nghiên cứu cải thiện độ ổn định của ketoconazol trong hệ tiểu phân nano lipid sử dụng qua da

HOÀNG THỊ THANH NGAMã sinh viên: 1101351 NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KETOCONAZOL TRONG HỆ TIỂU PHÂN NANO LIPID SỬ DỤNG QUA DA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016... HOÀNG

HOÀNG THỊ THANH NGA

Mã sinh viên: 1101351

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KETOCONAZOL TRONG HỆ TIỂU PHÂN

NANO LIPID SỬ DỤNG QUA DA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

HOÀNG THỊ THANH NGA

Mã sinh viên: 1101351

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KETOCONAZOL TRONG HỆ TIỂU PHÂN

NANO LIPID SỬ DỤNG QUA DA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

sử dụng máy móc thiết bị và hướng dẫn trong quá trình tôi làm thực nghiệm.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, phòng Đào tạocùng toàn thể các thầy cô các bộ môn và cán bộ các phòng ban trường Đại học Dược Hà Nội

đã tận tình dạy dỗ tôi trong những năm tháng học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi, độngviên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Hoàng Thị Thanh Nga

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Hệ chất mang lipid có cấu trúc nano 2

1.1.1 Đặc điểm của hệ chất mang lipid có cấu trúc nano – NLC 2

1.1.2 Thành phần 5

1.1.3 Kỹ thuật bào chế 6

1.1.4 Ưu, nhược điểm của hệ có cấu trúc nano sử dụng chất mang lipid 6

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới độ ổn định của dược chất trong hệ NLC 7

1.1.6 Một số nghiên cứu bào chế hệ NLC tăng độ ổn định của dược chất 9

1.2 Tổng quan về ketoconazol 10

1.2.1 Công thức hóa học 10

1.2.2 Tính chất 10

1.2.3 Đặc tính dược động học của ketoconazol 10

1.2.4 Tác dụng, chỉ định và dạng bào chế thường gặp 11

1.2.5 Một số nghiên cứu về độ ổn định hóa học của ketoconazol 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phương pháp bào chế 15

2.2.2 Đánh giá một số chỉ tiêu của hệ chất mang lipid có cấu trúc nano ketoconazol 17

2.2.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định của hệ chất mang lipid có cấu trúc nano ketoconazol và gel nạp NLC-ketoconazol 20

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ 22

3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ ketoconazol 22

3.2 Kết quả khảo sát thông số quy trình bào chế, thành phần công thức hệ NLC 22

3.2.4 Khảo sát lựa chọn lipid lỏng 293.2.5 Khảo sát lựa chọn chất diện hoạt thân nước 313.2.6 Khảo sát lựa chọn chất chống oxi hóa 343.3 Kết quả đánh giá sơ bộ độ ổn định của gel chứa hệ chất mang lipid có cấu trúcnano nạp ketoconazol 38KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BHT Butylated hydroxytoluen

CDH Chất diện hoạt

EE Hiệu suất bẫy thuốc

HLB Hệ số cân bằng thân dầu – thân nước

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

kl/kl Khối lượng/khối lượng

KTTP Kích thước tiểu phân

KTZ Ketoconazol

Na2EDTA Dinatri edetat

NaLS Natri laurylsulfat

NLC Hệ chất mang lipid có cấu trúc nano

PDI Chỉ số đa phân tán – Polydiversity IndexRES Hệ thống lưới võng nội mô

SLN Hệ tiểu phân nano lipid rắn

Zaverage Kích thước tiểu phân trung bình

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu. 14

Bảng 3.1: Công thức bào chế khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ. 23

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiếp xúc nhiệt lên màu của sản

Bảng 3.3: Công thức khảo sát cho hệ NLC sử dụng các loại lipid khác nhau. 26

Bảng 3.4: Công thức khảo sát cho hệ NLC sử dụng tỷ lệ lipid khác nhau. 28

Bảng 3.5: KTTP, PDI và thời gian xuất hiện tinh thể của các mẫu sau khi bào chế. 30

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ acid oleic tới KTTP, PDI và thời gian xuất hiện

Bảng 3.7: Công thức NLC và kết quả KTTP, PDI và thế Zeta của các mẫu dưới

Bảng 3.8: Công thức và kết quả đo KTTP, PDI và thế Zeta của các mẫu dưới ảnh

hưởng của tổng hàm lượng chất diện hoạt (kl/kl). 33

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CDH thân nước tới một số đặc tính của hệ NLC. 34

Bảng 3.10: Các môi trường tiến hành khảo sát khả năng chống oxi hóa của hệ

Bảng 3.11: Hàm lượng KTZ (%) theo thời gian phụ thuộc nồng độ rongalit. 35

Bảng 3.12: Công thức khảo sát nồng độ các chất chống oxi hóa pha dầu. 36

Bảng 3.13: Công thức gel với tỷ lệ % chất chống oxi hóa khác nhau. 39

Hình 1.2: So sánh khả năng kết tinh của SLN với các loại NLC

I: NLC không hoàn chỉnh – II: NLC vô định hình – III: NLC đa cấu trúc 4Hình 2.1: Sơ đồ bào chế hệ chất mang lipid có cấu trúc nano chứa ketoconazol 16Hình 3.1: Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ ketoconazol – diện

Hình 3.2: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của công suất siêu âm đến KTTP và PDI của

Hình 3.3: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới KTTP và PDI của hệ

chất mang lipid có cấu trúc nano chứa ketoconazol. 25Hình 3.4: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các loại lipid rắn đến KTTP, PDI và độ

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ BHT đến hàm lượng ketoconazol theo thời gian 37Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ BHA tới hàm lượng ketoconazol theo thời gian 37Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ α-tocopherol tới hàm lượng KTZ theo thời gian 38Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ chất chống oxi hóa tới hàm lượng KTZ trong

Việc đưa ketoconazol vào hệ chất mang lipid có cấu trúc nano (NLC) giúp tạo đượclớp vỏ bao gói tránh dược chất tiếp xúc trực tiếp với các tác nhân oxy hóa, đồng thời cảithiện tính thấm, hiệu quả điều trị và thời gian kéo dài điều trị của dược chất Do vậy đề tài

“Nghiên cứu cải thiện độ ổn định của ketoconazol trong hệ tiểu phân nanolipid” đượcthực hiện với mục đích xây dựng công thức, quy trình bào chế và sơ bộ đánh giá độ ổnđịnh hóa học của ketoconazol trong gel chứa hệ chất mang lipid có cấu trúc nano

Đề tài được thực hiện với 2 mục tiêu sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố quy trình và thành phần công thức tới

một số đặc tính hệ tiểu phân trong hệ có cấu trúc nano sử dụng chất mang lipid và

độ ổn định hóa học của ketoconazol trong hệ nano lipid

2 Sơ bộ đánh giá độ ổn định hóa học của dược chất trong gel chứa NLC –

ketoconazol

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Hệ chất mang lipid có cấu trúc nano

Hệ tiểu phân nano lipid là một hệ chất mang được phát triển thay thế cho liposome,nhũ tương nano và hệ nano polyme, có cấu trúc là các phân tử keo, rắn, có kích thước 10– 1000 nm trong đó dược chất được mang, hấp phụ, gắn kết hay hòa tan trong lớp cốtlipid, nhằm giảm độc tính do hấp thu toàn thân, tăng hiệu quả điều trị và tăng tác dụnghướng đích tại lớp biểu bì, cải thiện tính thấm của dược chất Trong những thập niên gầnđây, các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển nhiều hệ vi tiểu phân như hệ tiểu phânnano lipid rắn (SLN), hệ có cấu trúc nano sử dụng chất mang lipid (NLC) và hệ liên hợpdược chất – lipid [9]

NLC được coi là thế hệ thứ hai của hệ tiểu phân nano lipid, được phát triển để khắcphục các nhược điểm của thế hệ đầu tiên là hệ tiểu phân nano lipid rắn (SLN) như: khảnăng nạp thuốc thấp, thải thuốc khỏi cốt trong quá trình bảo quản do chuyển dạng lipid

từ dạng kém bền sang dạng bền vững hơn [2], [24]

1.1.1 Đặc điểm của hệ chất mang lipid có cấu trúc nano – NLC

NLC là những tiểu phân có đường kính trung bình từ 10 – 1000 nm được phân tántrong nước hoặc một dung dịch chất diện hoạt thân nước Mỗi tiểu phân được cấu tạo từmột hỗn hợp lipid rắn và lỏng với tỷ lệ lipid rắn:lipid lỏng từ 70:30 tới 99,9:0,1 Việc phốihợp dầu lỏng vào cấu trúc lipid giúp làm giảm nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp lipid nhưngvẫn duy trì được trạng thái rắn của tiểu phân nano lipid ở nhiệt độ cơ thể [23]

Dựa vào cấu trúc phân loại NLC thành các nhóm: [24]

- Nhóm I: NLC không hoàn chỉnh (cấu trúc của cốt lipid kết tinh không hoàn chỉnh).Việc sử dụng các loại lipid khác nhau sẽ tạo ra các khoảng trống trong tiểu phân nanolipid khi các phân tử lipid kết tinh Có thể sử dụng triglycerid của các acid béo khác nhau

để tạo khoảng trống lớn hơn giữa các mạch acid béo chứa dược chất ở dạng vô định hình

Thêm một lượng nhỏ lipid lỏng làm tăng mạnh khả năng nạp dược chất do độ tan củadược chất trong lipid lỏng cao hơn so với lipid rắn.

- Nhóm II: NLC vô định hình được tạo thành bằng cách phối hợp các lipid rắn vớimột số lipid như hydroxy octacosanylhydroxystearat, isopropylmyristat hoặc triglyceridmạch trung bình như Miglyol 812, do đó có thể ngăn cản quá trình thải thuốc do chuyểndạng kết tinh của lipid rắn trong thời gian bảo quản vì NLC ở dạng rắn vô định hình

- Nhóm III: NLC đa cấu trúc (dầu lỏng/lipid rắn/nước) có tỷ lệ dầu lỏng cao trongcấu trúc của tiểu phân nano [28] Độ tan của nhiều dược chất trong lipid lỏng cao hơntrong lipid rắn Đối với NLC nhóm III, cốt rắn có vai trò ngăn cản dược chất thoát khỏi

hệ và dược chất sẽ tan tốt hơn trong ngăn dầu lỏng có cấu trúc nano

Nhìn chung, hệ NLC có khả năng chống thải thuốc tốt hơn và tỷ lệ nạp dược chất caohơn so với SLN NLC vô định hình giảm thải thuốc khỏi cốt tốt hơn NLC không hoànchỉnh, và NLC nhóm III được sử dụng nhiều trong các công thức có tỷ lệ dược chất cao,

độ tan của các dược chất trong lipid rắn thấp hơn so với lipid lỏng [20]

Hệ chất mang lipid có cấu trúc nano đã được ứng dụng trong nhiều hệ đưa thuốc khácnhau, nhưng phần lớn là sử dụng trong hệ đưa thuốc tại chỗ (coenzym Q10, retinol, β –caroten, ketoprofen, oxybenzon, celecoxib, imidazol,…), ngoài ra còn được ứng dụngtrong các đường dùng khác như đường uống (vinpocetin, domperidon, lovastatin,lutein,…), đường khí dung (celecoxib [21]), các chế phẩm dùng cho niêm mạc mắt(flurbiprofen [14]), đường tiêm (artemether, bufadienolid),…[16], [26]

Cấu trúc và ảnh chụp của các nhóm NLC được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc và ảnh chụp của các nhóm NLC [26].

Hình 1.2 :So sánh SLN với khả năng kết tinh cao của các lipid rắn với các loại NLC I: NLC không hoàn chỉnh – II: NLC vô định hình – III: NLC đa cấu trúc [28].

1.1.2 Thành phần

Thành phần cơ bản của hệ chất mang lipid có cấu trúc nano gồm có dược chất (thândầu hoặc thân nước) và các tá dược sử dụng để bào chế NLC gồm: lipid (lipid rắn vàlipid lỏng), chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt và nước [3], [23]

Lipid lỏng được sử dụng thường là các lipid có khả năng phân hủy sinh học, ít gâykích ứng và cải thiện tính thấm cho các chế phẩm ngoài da Các lipid lỏng được sử dụnggồm triglycerid mạch trung bình (Miglyol 812), dầu parafin, 2-octyl dodecanol, Labrafac,isopropyl myristat và squalen có cấu trúc tương tự Compritol, các acid béo như acid oleic,acid linoleic, acid decanoic và các loại dầu cá từ hồ Baikal và dầu hạt thông [8], [13]

 Chất diện hoạt, đồng diện hoạt

Chất diện hoạt (CDH) có vai trò hình thành nhũ tương và ổn định hệ phân tán của hệ.Tăng nồng độ chất diện hoạt giúp giảm sức căng bề mặt và giảm quá trình kết tụ tiểu phân,đồng thời có thể ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân của NLC

Sử dụng đồng thời chất diện hoạt thân nước và chất diện hoạt thân dầu trong cấu trúcNLC có tác dụng nhũ hóa tốt hơn và ngăn cản quá trình kết tụ tiểu phân Các chất diệnhoạt thân nước hay được dùng như poloxamer 188, polysorbates, polyvinyl alcohol vànatri deoxycholat Chất diện hoạt thân dầu được sử dụng như Span 80 và lecithin [13]

 Các thành phần khác

Ngoài lipid và chất diện hoạt, trong một số dạng NLC các thành phần khác cũng được

sử dụng Trong nghiên cứu bào chế hệ chất mang lipid có cấu trúc nano nạp hydroxycamptothecin do Zhang và cộng sự nghiên cứu sử dụng trong điều trị ung thư,PEG biến tính được thêm vào công thức NLC tạo lớp vỏ giúp ngăn cản quá trình hấp thutiểu phân nano bởi hệ thống lưới võng mạc nội mô (RES) và tăng thời gian tuần hoàn củathuốc, là cơ sở bào chế các hệ tác dụng tại đích [13], [32]

10-1.1.3 Kỹ thuật bào chế

Có nhiều phương pháp được sử dụng trong bào chế hệ chất mang lipid có cấu trúcnano [26] gồm:

- Đồng nhất hóa dưới áp suất cao

- Đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn – Siêu âm

- Bào chế đi từ vi nhũ tương

- Nhũ hóa, bốc hơi dung môi

- Nhũ hóa, khuếch tán dung môi

- Tiêm dung môi, thay thế dung môi

- Phương pháp nhiệt độ đảo pha

- Có khả năng kiểm soát giải phóng thuốc và đưa thuốc hướng đích

- Độ tương thích sinh học cao do sử dụng các lipid sinh lý

- Bảo vệ các dược chất kém bền tránh khỏi sự phân hủy hóa học.

- Có thể kết hợp cả dược chất thân nước và thân dầu

- Dễ dàng nâng cấp quy mô và tiệt khuẩn

- Hạn chế hiện tượng thải thuốc khỏi cốt so với dạng SLN do quá trình chuyển dạngkết tinh của lipid rắn

- Nồng độ tiểu phân trong hệ phân tán lỏng cao hơn hệ SLN (có thể đạt 80%)

- Tăng khả năng thấm thuốc qua da, hydrat hóa lớp sừng dưới da [26]

1.1.4.2 Nhược điểm

- Tăng kích thước tiểu phân trong thời gian bảo quản

- Khó dự đoán xu hướng gel hóa

- Một số chất diện hoạt trong chế phẩm gây kích ứng da khi sử dụng

- Thiếu các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng về tác dụng của NLC trên cáctrường hợp bệnh về xương [26]

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới độ ổn định của dược chất trong hệ NLC

● Lipid

Việc lựa chọn loại lipid và nồng độ lipid ảnh hưởng tới khả năng nạp dược chất,KTTP, khả năng giải phóng dược chất và độ ổn định của dược chất nhất là đối với cácdược chất kém ổn định Việc sử dụng các lipid không phù hợp như tính acid quá cao làmgiảm độ ổn định hóa học của dược chất [19], các lipid rắn có khả năng chuyển dạng kếttinh về trạng thái bền vững kém sẽ tạo được nhiều khoảng trống trong cốt, cải thiện khảnăng giữ dược chất trong cốt, bảo vệ dược chất khỏi tác động của các tác nhân oxi hóa,thủy phân trong môi trường [31]

● Chất diện hoạt

Các loại chất diện hoạt khác nhau ảnh hưởng khác nhau tới khả năng bị oxi hóa củadược chất và độ ổn định vật lý của hệ NLC [19]

Teeranachaideekul V và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất diện hoạt tới độ

ổn định của ascorbyl palmitat (AP) trong hệ NLC Kết quả nghiên cứu đã cho thấy cácchất diện hoạt khác nhau có khả năng làm giảm năng lượng tự do bề mặt và bảo vệ vòngkhông bền của các phân tử AP gắn trên bề mặt tiểu phân khác nhau, từ đó cải thiện độ ổnđịnh của AP trong hệ NLC, tiến hành khảo sát 3 chất diện hoạt Tego care 450, Tween 80

và Miranol Ultra C32 cho thấy hiệu quả ổn định hàm lượng dược chất AP của MiranolUltra C32 cao nhất, và Tween 80 có hiệu quả bảo vệ dược chất thấp nhất [31]

Schwarz và Mehnert đã tiến hành so sánh ảnh hưởng của lecithin đậu nành (Lipoid®)

và Poloxamer 188 tới thế Zeta của SLN chứa tetracain Lipid rắn được sử dụng trongnghiên cứu là Witepsol H5 và Dynasan 112 (glycerol trilaurat) SLN sử dụng Lipoid làmchất nhũ hóa có thế Zeta sau khi bào chế trong khoảng -40 mV tới -50 mV Trong khi đó,SLN sử dụng Poloxamer 188 cho khoảng thế Zeta là -18 mV tới -27 mV, ảnh hưởng tới

độ ổn định vật lý, tăng khả năng kết tụ tiểu phân của hệ SLN [27]

● Nhiệt độ và ánh sáng

Với mục đích đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định của AP được bao góitrong hệ NLC, Teeranachaideekul V và cộng sự đã tiến hành bào chế và định lượng hàmlượng AP còn lại trong hệ NLC – AP sử dụng các loại lipid là Hydrine, Apifil, Imwitor

900, glyceryl monostearat và alcol cetylic được bảo quản song song trong điều kiện nhiệt

độ 4˚C và 25˚C trong th ời gian 30 ngày Kết quả nghiên cứ đã chỉ ra tại điều kiện nhiệt độthấp (4˚C), tốc độ phân hủy AP thấp hơn, hàm lượng AP còn lại trong chế phẩm cao hơn

so với nhiệt độ cao (với hệ NLC sử dụng lipid Imwitor 900 hàm lượng AP còn lại ở nhiệt

độ 4˚C và 25˚C l ần lượt là khoảng 65% và dưới 30%) [31]

● Chất chống oxi hóa: là những chất rất dễ bị oxy hóa và có thế oxy hóa thấp hơn

so với thế oxi hóa của dược chất, nên chúng sẽ bị oxy hóa trước khi dược chất bị oxi hóa.Các chất chống oxi hóa thường dùng là chất sinh SO2, các chất khử,…[4]

Teeranachaideekul V và cộng sự nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ của chất chốngoxi hóa đối với AP được bao gói trong hệ NLC thông qua so sánh hàm lượng AP còn lại

trong công thức có chứa chất chống oxi hóa (F1) và công thức không chứa chất chống oxihóa (A2) được bảo quản tại 25˚C trong thời gian 90 ngày Sau thời gian bảo quản, hàmlượng AP còn lại trong F1 và A2 lần lượt là 80% và 60% Kết quả này chỉ ra các chấtchống oxi hóa pha dầu cải thiện độ ổn định hóa học của AP trong công thức NLC Ngoài

ra, khi kết hợp các chất chống oxi hóa khác nhau một cách phù hợp sẽ đạt hiệu quả chốngoxi hóa tốt nhất [31]

● pH: ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng oxy hóa dược chất, độ nhớt,… của chế phẩmtrong quá trình bảo quản [29]

● Quy trình bào chế:

Quy trình bào chế bao gồm nhiều yếu tố ảnh hưởng tới độ ổn định của hệ cấu trúcnano sử dụng chất mang lipid và dược chất bao gói trong hệ như nhiệt độ, lực phân cắt,loại khí khỏi chế phẩm sau khi bào chế,…

1.1.6 Một số nghiên cứu bào chế hệ NLC tăng độ ổn định của dược chất

Các nghiên cứu đã chỉ ra độ ổn định hóa học của các hợp chất tăng lên khi được đưavào dạng tiểu phân nano lipid trong nhiều sản phẩm mỹ phẩm, ví dụ: coenzym Q10 [11],ascorbyl palmitat [31], tocopherol (vitamin E) [7] và retinol (vitamin A)

Abla M J và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ tocophefol của hệ cấutrúc nano dưới tác động của tia UV Nghiên cứu đã chỉ ra tỷ lệ tocopherol trong dầukhoáng và tocopherol tự do trong methanol bị phân hủy dưới tác động của tia UV lần lượt

là 94% và 88% Nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng tocopherol được bao gói trong NLC

và hệ nhũ tương nano còn lại sau khi phơi nhiễm với tia UV lần lượt là 92 ± 2,6% và 95,9

± 8,8% chứng minh khả năng bảo vệ dược chất của hệ tiểu phân nano lipid [7]

Chen S và cộng sự tiến hành nghiên cứu bào chế hệ NLC chứa coenzym Q10 bằngphương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao với mục đích cải thiện tác dụng tại đích và hạnchế phân hủy Q10 Nghiên cứu đã chứng minh khả năng bảo vệ coenzym Q10 của hệ chấtmang lipid có cấu trúc nano tốt hơn khi so sánh với dung dịch coenzym Q10 trong ethanol

và nhũ tương Q10 Dưới tác động của ánh sáng, sau 24 giờ hàm lượng Q10 còn lại trong

hệ NLC-Q10, nhũ tương Q10 và dung dịch Q10 trong methanol lần lượt là 94,41%;75,39% và 50,26% [11]

 Dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng

 Độ tan: Thực tế không tan trong nước; dễ tan trong dicloromethan, trongmethanol; tan trong propylen glycol (5,9 mg/ml) và polyethylen glycol (1:1) (36,4mg/ml); hơi tan trong ethanol

 Ketoconazol là một base yếu có pKa1 = 6,51; pKa2 = 2,94 do đó độ tan củaketoconazol phụ thuộc vào giá trị pH, tan tốt hơn ở pH acid (khoảng 2, 3) [29]

 Ketoconazol dễ bị oxi hóa, dễ bị thủy phân trong môi trường acid, base [29]

1.2.3 Đặc tính dược động học của ketoconazol

 Hấp thu: KTZ dùng ngoài da không hấp thu vào tuần hoàn chung [12]

 Phân bố: KTZ dùng ngoài da lưu giữ trên lớp sừng, lớp dưới sừng Nồng độ KTZlưu giữ trên lớp sừng giảm tuyến tính sau khi dừng sử dụng chế phẩm từ 1 – 8 giờvới tốc độ giảm 2µg/cm2/h [22].

1.2.4 Tác dụng, chỉ định và dạng bào chế thường gặp

 Tác dụng: ketoconazol là một chất chống nấm phổ rộng, tác dụng trên nhiều loạinấm gây bệnh bao gồm nấm bề mặt da, niêm mạc và nấm nội tạng Ngoài ra ketoconazolcòn có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (+) [5]

 Cơ chế tác dụng: KTZ ức chế α-demethylase (enzym tham gia vào quá trình tổnghợp ergosterol), ngăn cản tổng hợp ergosterol và lipid của màng tế bào nấm, làm thayđổi tính thấm của màng tế bào [5]

 Chỉ định [5]:

- Điều trị các bệnh do nhiễm nấm nhạy cảm ở da, tóc, móng, viêm da tiết bã

 Dạng bào chế:

- Dược phẩm: Shampoo 2% (Nizoral), kem bôi 2% (Nizoral),…

- Mỹ phẩm: Các shampoo có nồng độ ketoconazol < 2% được coi là mỹ phẩm(Hacineal ketoconazol 1,5 %; Dr-Hair chứa ketoconazol 1,8% )

1.2.5 Một số nghiên cứu về độ ổn định hóa học của ketoconazol

● M Skiba và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của pH, nhiệt

độ và nồng độ chất chống oxi hóa tới độ ổn định của KTZ trong chế phẩm lỏng Kết quảnghiên cứu đã chỉ ra KTZ không bền trong môi trường acid, hằng số tốc độ phân hủy tại

pH = 1 cao nhất trong các môi trường nghiên cứu Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ phânhủy của KTZ, định lượng song song hàm lượng KTZ còn lại theo thời gian của 2 chếphẩm cùng công thức được bảo quản ở 25˚C và 50˚C sau 6 tháng l ần lượt là 99% và85% Nồng độ chất chống oxi hóa BHT sử dụng càng cao KTZ càng ổn định [29]

● E B Souto và cộng sự nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano lipid chứaketoconazol ứng dụng vào dạng gel dùng tại chỗ sử dụng phương pháp đồng nhất hóa ở

áp suất cao và tiến hành đánh giá các đặc tính của hệ, so sánh giữa hai hệ SLN và NLC.Nghiên cứu đã chỉ ra SLN-ketoconazol kém ổn định với ánh sáng hơn so với NLC-ketoconazol Ngược lại, NLC-ketoconazol kém ổn định vật lý hơn, sau thời gian 90 ngày

có sự thay đổi KTTP và PDI lớn hơn so với SLN-ketoconazol Tuy nhiên, khi kết hợpvào dạng chế phẩm có độ nhớt cao, độ ổn định của cả hai hệ đều được cải thiện rõ rệt.Kết quả phân tích nhiệt cho thấy chỉ số kết tinh trong hệ SLN cao hơn so với NLC, phùhợp với lý thuyết đặc tính của hệ NLC có ít cấu trúc kết tinh hơn, kém trật tự hơn so với

hệ SLN do các thành phần đặc biệt của hệ [30]

● Mhaske R.A và cộng sự đã nghiên cứu xác định các sản phẩm phân hủy chínhcủa ketoconazol trong các điều kiện khác nhau Quá trình phân hủy ketoconazol đượcthực hiện trong các môi trường gồm: môi trường acid, môi trường base, nhiệt độ cao,ánh sáng và môi trường có thêm các chất oxi hóa Các sản phẩm được xác định bằngphương pháp sắc ký lỏng khối phổ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp phântích nguyên tố Kết quả nghiên cứu chỉ ra KTZ bị phân hủy trong các điều kiện khắcnghiệt trên tạo nhiều sản phẩm phân hủy khác nhau trong đó hai sản phẩm phân hủychính là sản phẩm thủy phân trong môi trường acid/base và sản phẩm oxi hóa Kết quảphân tích khối phổ chỉ ra khối lượng sản phẩm phân hủy do quá trình oxi hóa tăng 16amu so với khối lượng KTZ chứng minh có quá trình gắn thêm nhóm N-oxid vào cấutrúc KTZ và sản phẩm thủy phân trong môi trường acid/base của KTZ mất một nguyên

tử O so với công thức ketoconazol [18]

Bảng 1.1: Các sản phẩm phân hủy chính của ketoconazol [18].

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu:

- Tiểu phân chất mang lipid có cấu trúc nano chứa ketoconazol

- Gel chứa tiểu phân chất mang lipid có cấu trúc nano

 Nguyên vật liệu:

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Ketoconazol Trung Quốc TCCS

2 Alcol cetylic Trung Quốc TCCS

3 Alcol cetostearylic Trung Quốc TCCS

4 Suppocire Trung Quốc TCCS

5 Acid oleic Trung Quốc TCCS

6 Cremophor RH40 Trung Quốc TCCS

9 Carbopol 934 Trung Quốc TCCS

10 Natri hydroxyd Việt Nam TCCS

11 Natri laurylsulfat Trung Quốc TCCS

12 Natri hydroxymethanesulfinat hydrat

16 Acid othorphosphoric Đức HPLC

18 Isopropyl myristat Mỹ TCCS

20 Miglyol 812 Trung Quốc TCCS

 Thiết bị nghiên cứu:

- Máy siêu âm cầm tay Hielscher UP200Ht

- Máy khuấy từ IKA – WERKE (Đức)

- Máy đo pH METTLER TOLEDO FiveEasy

- Máy phân tích kích thước hạt Zetasizer Nano ZS90

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R

- Tủ vi khí hậu Climacell

- Màng siêu lọc Amicon® Ultra-4 cutoff 10 kDa

- Cân phân tích, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, bếp điện và các thiết bị bào chế, kiểmnghiệm khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế

2.2.1.1 Bào chế hệ tiểu phân chất mang lipid có cấu trúc nano chứa ketoconazol

Qua tham khảo tài liệu [3] và [6] kết hợp với một số khảo sát sơ bộ, chúng tôi lựachọn quy trình bào chế như sau:

- Đun chảy pha dầu (lipid rắn, Span 80), sau đó phân tán đều ketoconazol vào pha dầu

đã đun chảy đến khi dược chất hòa tan hoàn toàn Duy trì nhiệt độ 60 – 70˚C

- Phối hợp lipid lỏng vào pha dầu đã đun ch ảy ở nhiệt độ 60 - 70˚C

- Hòa tan chất diện hoạt thân nước trong nước tinh khiết đã đun nóng tới 60 - 70˚C, sau

đó phối hợp nhũ hóa vào trong pha dầu nóng ở trên Bổ sung nước nóng cho đủ 25g tiềnnhũ tương

- Chuyển 25g tiền nhũ tương vào cốc 100ml, đặt lên máy khuấy từ, khuấy từ ở tốc độ

700 vòng/phút kèm siêu âm ở biên độ 50%, công suất 20W – 80W trong 2 – 10 phút

- Mẫu sau đó được làm lạnh nhanh về nhiệt độ phòng sử dụng nước đá [3]

Hình 2.1 Sơ đồ bào chế hệ chất mang lipid có cấu trúc nano chứa ketoconazol

Hệ chất mang lipid có cấu trúc nano

Dung dịch chất diện hoạt/

nước nóng(60 - 70˚C)

Phối hợp, duy trì nhiệt

độ tới tan hoàn toàn

Lipid lỏng

2.2.1.2 Bào chế gel từ hệ chất mang lipid có cấu trúc nano chứa ketoconazol

Qua tham khảo tài liệu [6], chúng tôi lựa chọn chọn thành phần tá dược tạo gel cho hệNLC-ketoconazol là Carbopol 934 0,6% được trung hòa bằng NaOH tới pH 6 – 7 và chấtdiện hoạt được sử dụng để tăng tính thấm qua da cho hệ gel là Tween 80 tỷ lệ 5%; quytrình bào chế gel chứa hệ NLC – ketoconazol như sau:

- Cân NLC, tá dược gel

- Ngâm trương nở Carbopol 934 tạo gel Carbopol 8%

- Trung hòa Carbopol 934 8% bằng dung dịch NaOH 1M tới pH 6 – 7

- Phối hợp Tween 80 vào gel Carbopol 8% đã trung hòa

- Ngâm trương nở gel vào hỗn dịch NLC – ketoconazol, để qua đêm cho tá dược tạogel trương nở hoàn toàn

- Bổ sung nước và các thành phần còn lại cho vừa đủ khối lượng

- Dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ cùng chiều đến khi thu được gel mịn, đồng nhất

- Gel được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng

2.2.2 Đánh giá một số chỉ tiêu của hệ chất mang lipid có cấu trúc nano ketoconazol

2.2.2.1 Phương pháp định lượng ketoconazol trong chế phẩm

- Pha tĩnh: Cột sắc ký Alltech C18 250 × 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm

- Pha động: methanol : dung dịch đệm phosphat (pH 3,0) (65:35)

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Detector UV phát hiện ở bước sóng 254 nm

b Định lượng nồng độ ketoconazol trong hệ NLC bằng phương pháp HPLC

 Điều kiện sắc ký: Tương tự 2.2.2.1.a

 Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat: Hòa tan 7 ml dung dịch acid ortho-phosphoric85% trong khoảng 900 ml nước cất hai lần, chỉnh pH về 3,0 bằng dung dịch NaOH 1M,

bổ sung nước cất hai lần vừa đủ thể tích 1000 ml Lọc qua màng 0,45 µm, siêu âm trong

20 phút

 Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử, xác định hàm lượng ketoconazol

 Mẫu chuẩn:

Cân chính xác khoảng 0,08 g ketoconazol, hòa tan trong methanol vừa đủ 50ml Lấy

1 ml dung dịch trên pha loãng bằng methanol vừa đủ 10 ml được mẫu chuẩn có nồng độchính xác khoảng 160 µg/ml Lọc qua màng 0,45 µm

 Mẫu thử:

Cân chính xác khoảng 0,4 g mẫu (tương đương 0,008g KTZ) Phân tán trong khoảng

40 ml methanol Đun cách thủy 30 phút để đảm bảo hòa tan hết thành phần lipid Đểnguội và bổ sung methanol vừa đủ 50 ml Sau đó làm lạnh ở 10oC cho lipid kết tủa hết

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút ở 10oC Lấy phần dịch lọc qua màng 0,45 µm

● Xác định hàm lượng KTZ theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

● Hàm lượng ketoconazol (%) có trong hệ chất mang lipid có cấu trúc nano so vớihàm lượng lý thuyết theo công thức sau:

H (%) = 10 50 100(%)Trong đó:

- Sc, St: lần lượt là diện tích pic KTZ của mẫu chuẩn và mẫu thử (mAU.phút)

- Cc: nồng độ dung dịch ketoconazol chuẩn (µg/ml)

- 50: hệ số pha loãng của mẫu thử

- m1: khối lượng mẫu thử hệ chất mang lipid có cấu trúc nano (g)

c Định lượng nồng độ ketoconazol trong gel

Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

 Điều kiện sắc ký: tương tự 2.2.2.1.a

 Chuẩn bị dung dịch đệm: tương tự mục 2.2.2.1.b

 Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử, xác định hàm lượng ketoconazol

 Mẫu chuẩn: tương tự 2.2.2.1.b

 Mẫu thử:

Cân chính xác khoảng 0,4000g gel (tương ứng 0,008g KTZ) Phân tán trong hỗnhợp dung môi methanol : đệm phosphat pH 3,0 (65:35) ở 70 – 80oC Thêm hỗn hợpdung môi vừa đủ 50 ml được dung dịch X Lọc qua màng 0,45 µm

 Xác định hàm lượng KTZ theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hàm lượng KTZ (%) có trong gel so với hàm lượng lý thuyết tính theo công thức:

%KTZ = ×× ×× ×100%

Trong đó: Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.phút)

St: Diện tích pic mẫu thử (mAU.phút)

Cc, Ct: Nồng độ mẫu chuẩn và mẫu thử (µg/ml)

mc: Khối lượng gel cân (g)

2.2.2.2 Đánh giá kích thước và phân bố kích thước bằng máy Zetasizer Nano ZS90

Sử dụng máy phân tích kích thước hạt Zetasizer Nano ZS90 đo kích thước hạt trongkhoảng 0,01 – 5000 nm dựa trên nguyên tắc tán xạ ánh sáng động Mẫu được đo ở điềukiện hệ số khúc xạ ánh sáng thực bằng 1,45635 và hệ số hấp thụ bằng 0,01

Tiến hành: Sử dụng dung môi pha loãng là nước cất hai lần, nhiệt độ đo 25˚C [30],lượng nước cất dùng pha loãng vừa đủ sao cho count rate nằm trong khoảng 200 – 400kcps (pha loãng khoảng 100 lần bằng nước cất hai lần)

2.2.2.3 Xác định hiệu suất mang (EE) ketoconazol trong các hạt tiểu phân nano

Hiệu suất mang dược chất được xác định gián tiếp thông qua việc định lượng dượcchất toàn phần và dược chất tự do có trong hệ

a Xác định lượng dược chất toàn phần có trong hệ

 Mẫu chuẩn: tiến hành tương tự mẫu chuẩn trong mục 2.2.2.1.b

 Mẫu thử: tiến hành tương tự mẫu thử trong mục 2.2.2.1.b

Chạy sắc ký mẫu thử và mẫu chuẩn với các thông số được mô tả trong mục 2.2.2.1.a.Dựa trên diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn tính ra lượng dược chất toàn phần cótrong hệ

b Xác định lượng dược chất tự do có trong hệ

 Mẫu chuẩn: tiến hành tương tự mẫu chuẩn ở mục 2.2.2.1.b

 Mẫu thử: Hút khoảng 2 ml NLC thu được vào màng siêu lọc Amicon® Ultra-4,tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ 25˚C trong khoảng 30 – 40 phút Hútlấy phần dịch trong, định lượng bằng kỹ thuật HPLC với các thông số được mô tả ở mục2.2.2.1.a Dựa trên diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn tính ra lượng dược chất tự

do có trong hệ

 Công thức tính hiệu suất mang dược chất:

EE (%) = ổ ự

ổ × 100%

Trong đó: EE: Hiệu suất mang dược chất (%)

mtổng: Lượng dược chất toàn phần có trong hệ (µg/ml)

mtự do: Lượng dược chất tự do có trong hệ (µg/ml)

2.2.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định của hệ chất mang lipid có cấu trúc nano ketoconazol và gel nạp NLC-ketoconazol

2.2.3.1 Đánh giá độ ổn định ketoconazol trong hệ chất mang lipid có cấu trúc nano

- Điều kiện bảo quản: Hệ NLC sau khi bào chế được bảo quản trong lọ thủy tinhtrong suốt, nắp cao su, ở điều kiện phòng thí nghiệm

- Thời điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy vào các thời điểm ban đầu, 15 ngày, 1 tháng,

2 tháng, 3 tháng

- Chỉ tiêu đánh giá:

● Tiến hành định lượng hàm lượng ketoconazol trong hệ NLC theo phương phápHPLC được trình bày trong mục 2.2.2.1

● Đánh giá hình thức cảm quan: Quan sát màu sắc của hệ trong quá trình bảo quản

● Đánh giá kích thước và phân bố kích thước tiểu phân với các thông số được mô

tả ở mục 2.2.2.2

2.2.3.2 Đánh giá độ ổn định gel nạp NLC-ketoconazol

- Điều kiện bảo quản: Gel nạp NLC – ketoconazol được bảo quản trong lọ nhựa đụctrong tủ vi khí hậu có nhiệt độ 40 ± 2˚C và độ ẩm 75 ± 5% và được bảo quản trong lọnhựa đục ở điều kiện phòng thí nghiệm

- Thời điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy vào các thời điểm ban đầu, 15 ngày, 30 ngày

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ

3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ ketoconazol

Pha dãy dung dịch ketoconazol có nồng độ 3,72; 11,16; 18,6; 37,2; 55,8; 74,4; 148,8;

184 µg/ml rồi tiến hành chạy HPLC theo các điều kiện đã nêu ở mục 2.2.2.1.a Đườngchuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ ketoconazol và diện tích pic được thể hiệntrong hình 3.1 và hình ảnh sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử được trình bày trong phụlục 1.1 và phụ lục 1.2

Hình 3.1: Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ KTZ – diện tích pic.

Nhận xét: Kết quả trên cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị diện tích pic

với nồng độ ketoconazol trong khoảng nồng độ từ 4 µg/ml đến 190 µg/ml với hệ sốtương quan R2≈ 1

Kết luận: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao thích hợp để định lượng

ketoconazol trong hệ chất mang lipid có cấu trúc nano và gel trong nghiên cứu khảo sátcác yếu tố công thức và quy trình ảnh hưởng của tới độ ổn định KTZ

3.2 Kết quả khảo sát thông số quy trình bào chế, thành phần công thức hệ NLC

3.2.1 Khảo sát thông số quy trình

a Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định của KTZ và hệ NLC-ketoconazol

y = 14,15x + 3,6905 R² = 0,9998

0 500

Trong thành phần hệ NLC có một số chất có khả năng bị phân hủy dưới tác độngcủa nhiệt tạo sản phẩm phân hủy có màu như acid oleic [25] và ketoconazol [30] Kỹthuật siêu âm sử dụng trong nghiên cứu sinh nhiều năng lượng trong quá trình bào chếnên có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của dược chất và tá dược trong công thức.

Do đó chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định của hệ,với công thức bào chế được trình bày trong bảng 3.1 theo quy trình đã nêu trong mục2.2.1.1, cường độ siêu âm 50%, công suất P = 50W trong thời gian 2 phút để đảm bảonhiệt độ của hệ không quá 75˚C

Bảng 3.1: Công thức bào chế khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.

Pha dầu

Alcol cetylic (g) 1,0

Acid oleic (g) 0,5

Pha nước Tween 80 (g) 1,15

Nước tinh khiết vừa đủ (g) 25

Sản phẩm sau khi siêu âm được đun cách thủy ở các nhiệt độ khác nhau, tiến hànhquan sát màu của sản phẩm để đánh giá sơ bộ độ ổn định hóa học của hệ Kết quả quansát màu sắc của chế phẩm ở nhiệt độ khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhauđược trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiếp xúc nhiệt lên màu của sản phẩm.

Nhận xét: Khi tăng nhiệt độ, độ ổn định của các thành phần trong hệ giảm mạnh.

Ở nhiệt độ 90˚C, các thành phần trong công thức kém ổn định và thay đổi màu trong thờigian ngắn, do đó trong quá trình khảo sát tiếp theo lựa chọn thông số sao cho khoảngnhiệt độ kiểm soát trong khoảng dưới 80˚C

b Khảo sát cường độ siêu âm

Trong quá trình bào chế, tổng năng lượng siêu âm và độ đồng đều của lực phân tán

sẽ quyết định KTTP và PDI của hệ tương ứng Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ảnhhưởng của cường độ siêu âm lên KTTP và PDI của hệ [6]

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm lên KTTP, PDI của NLCketoconazol với công suất siêu âm lựa chọn là 40W, 60W, 70W và 80W Kết quả đoKTTP và PDI của các mẫu được trình bày trong hình 3.2

Hình 3.2: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của công suất siêu âm đến KTTP và PDI của

NLC bào chế được.

Nhận xét: Khi cố định thời gian siêu âm 5 phút, cường độ A = 50% và thay đổi công

suất của máy siêu âm từ 40W tới 60W, Zaveragegiảm Tiếp tục tăng công suất từ 60W lên80W, Zaveragetăng lên trong khi đó PDI của hệ thay đổi không đáng kể, nguyên nhân có

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0 50 100 150 200 250