Thành phần hóa học của cây Dó bầu (Aquilaria crassna pierre)

crassna, thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa các cao chiết và hợp chất tinh khiết cô lập được từ đó đánh giá khả năng sử dụng lá dó bầu như nguồn nguyên liệu sản xuất sản phẩm thứ cấp tạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẶNG UY NHÂN

THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU

AQUILARIA CRASSNA PIERRE

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ

MÃ SỐ: 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TRẦN LÊ QUAN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010

LỜI CẢM ƠN

Thực hiện một luận văn thạc sĩ là một công việc khó khăn mà em phải làm từ trước cho đến nay Trên con đường bắt đầu nghiên cứu khoa học thật không thể tránh khỏi nhiều bỡ ngỡ, khó khăn và nhiều lần thất bại … nếu không có những lời động viên, sự giúp đỡ chân thành từ thầy cô, bè bạn và gia đình chắc chắn em không thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người

Em xin cảm ơn thầy Trần Lê Quan, người đã hết lòng lo lắng, giúp đỡ, tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài Thầy không chỉ truyền dạy cho

em những kiến thức chuyên môn sâu sắc mà còn hướng dẫn cho em nhiều điều bổ ích trong cuộc sống

Em xin cảm ơn GS Poul Erik Hansen và các cộng sự của thầy đã hết lòng

giúp đỡ em trong thời gian làm việc tại đại học Roskilde Đan Mạch

Nguyễn Ngọc Hạnh và thầy TS Nguyễn Trung Nhân đã đóng góp nhiều ý kiến

thiết thực quý báu để em hoàn chỉnh luận văn của mình

Xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô, các em sinh viên, những người bạn khoa Hóa và phòng Thí nghiệm Phân tích trung tâm trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM, những người đã sát cánh cùng tôi trong quá trình thực hiện đề tài Xin cảm ơn em, vợ của tôi, người đã lo lắng, động viên, hỗ trợ hết lòng để tôi vững bước trên con đường nghiên cứu khoa học

Con xin cám ơn cha má, người đã sinh con ra và nuôi con khôn lớn đến ngày hôm nay Xin cha phù hộ cho con vững bước trên con đường này

MỤC LỤC Trang

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

Danh mục các chữ viết tắt

Lời mở đầu 1

1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về cây dó bầu 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Phân loại 3

1.1.4 Đặc tính sinh học 4

1.1.5 Công dụng của trầm hương và kỳ nam 5

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 6

1.2.1 Thành phần hóa học của trầm hương 6

1.2.2 Thành phần hóa học thân cây dó bầu 12

1.2.3 Thành phần hóa học trong lá cây dó bầu 14

1.3 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ GỐC TỰ DO DPPH• 15

1.3.1 Khái niệm về gốc tự do 15

1.3.2 Lợi ích của gốc tự do 16

1.3.3 Tác hại của gốc tự do 16

1.3.4 Gốc tự do DPPH• 16

1.3.5 Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa 17

2 NGHIÊN CỨU 19

2.1 Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ lá cây dó bầu 19

2.2 Thành phần hóa học lá cây dó bầu A crassna 21

2.2.1 Hợp chất DB1 21

2.2.2 Hợp chất DB2 22

2.2.3 Hợp chất DB3 23

2.2.4 Hợp chất DB4 25

2.2.5 Hợp chất DB5 28

2.2.6 Hợp chất DB6 29

2.2.7 Hợp chất DB7 32

2.3 Hoạt tính chống oxy hóa của các chất cô lập 35

2.4 Hàm lượng các chất trong lá dó bầu 36

3 THỰC NGHIỆM 37

3.1 Điều kiện thực nghiệm 37

3.2 Thu hái – xử lý mẫu 39

3.3 Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 39

3.3.1 Quy trình thử hoạt tính 39

3.4 Quy trình cô lập 41

3.4.1 Khảo sát cao ethyl acetate 41

3.4.2 Khảo sát cao butanol 41

3.5 Định lượng các chất trong lá cây dó bầu 43

3.5.1 Xử lý mẫu 43

3.5.2 Điều kiện phân tích 43

3.5.3 Xử lý số liệu phân tích 45

4 KẾT LUẬN 46

5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AC : acetone

COSY : Correlation Spectroscopy

d : doublet, mũi đôi

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DMSO : dimethyl sulfoxide

DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EA : ethyl acetate

GC-MS : sắc ký khí ghép khối phổ

HE : hexane

HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR-MS : khối phổ phân giải cao

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence

Cây dó bầu hay còn gọi là cây trầm hương là loại cây có khả năng hình thành

ở phần lõi của thân một sản phẩm quí là trầm hương và kỳ nam có giá trị kinh tế rất cao, nhất là trên thị trường quốc tế Là loại cây đặc trưng phân bố ở vùng Đông Nam Á, có khả năng tạo được sản phẩm có giá trị, lại thích nghi được với địa hình đồi núi nên cây dó bầu được khuyến khích nhân giống và phát triển rộng rãi khắp các tỉnh trong cả nước Theo thống kê của Hội Trầm hương đến nay đã có trên 23 tỉnh thành trồng cây dó bầu với tổng diện tích hơn 8000 ha Ước tính diện tích trồng

dó bầu mỗi năm tăng từ 2400 - 4000 ha và đến năm 2010 diện tích trồng cây dó bầu trên cả nước có thể lên đến 30.000 ha

Việc phát triển loài cây quý này ngoài việc thu được nguồn lợi lớn về kinh tế còn rất phù hợp để cải thiện tình hình môi trường ngày càng xuống cấp do nạn chặt phá rừng bừa bãi như hiện nay Tuy nhiên do thời gian thu hoạch khá lâu và chưa có phương pháp cụ thể để tạo trầm, người dân chủ yếu dựa vào kinh nghiệm nên gặp phải rất nhiều rủi ro Vấn đề này ảnh hưởng rất lớn đến các doanh nghiệp trồng dó bầu nhất là các doanh nghiệp vừa và nhỏ, vì thế việc nghiên cứu một nguồn thu khác nhanh hơn, ổn định hơn cho người dân trồng dó bầu là vô cùng cần thiết

Đã có nhiều nghiên cứu về trầm hương (agarwood) và tinh dầu trầm được

công bố trong và ngoài nước, tuy nhiên cho đến nay có rất ít nghiên cứu về lá cây

dó bầu Aquilaria crassna Để góp phần giải quyết vấn đề về nguồn thu cho người

dân cũng như mở rộng thêm những hiểu biết về cây dó bầu Việt Nam , trong đề tài

này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học trong lá của cây dó bầu A crassna, thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa các cao chiết và hợp chất tinh khiết cô

lập được từ đó đánh giá khả năng sử dụng lá dó bầu như nguồn nguyên liệu sản xuất sản phẩm thứ cấp tạo nguồn thu mới cho người dân trồng dó bầu trong khoảng thời gian chờ cây cho trầm

1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DÓ BẦU

Tên khoa học: Aquilaria crassna Pierre

Tên thông thường: cây trầm hương, dó bầu

Cây dó bầu là loại cây thân gỗ sống lâu năm, có thể cao đến 30-40 m, đường

kính 1-1.5 m, vỏ xám, tán thưa, thân thẳng, có xơ

Cây dó bầu phân bố rải rác trong các khu rừng thuộc kiểu ẩm nhiệt đới

nguyên sinh hoặc thứ sinh, sống thích hợp trong rừng hỗn giao, cây lá rộng Cây dó

bầu có thể tái sinh bằng chồi hay bằng hạt, sinh trưởng và phát triển trong các điều

kiện nhiệt độ ban ngày 15-36 oC, ban đêm 5-25 oC

Lá mọc so le, thuôn hay bầu dục ngọn giáo,

nhọn ở gốc, thon hẹp ở đầu, phiến lá dài 8-10 cm,

rộng 3.5-5.5 cm, có mép phồng lên thành vòng,

mặt trên màu lục, sáng bóng, nhẵn, mặt dưới nhạt

hơn, có lông mềm, cuống lá dài 4-6 mm

Hình 1.2 Lá cây dó bầu

Cây trên ba tuổi có thể ra hoa Hoa nhỏ có hình chuông màu vàng lục, trắng nhạt hoặc vàng xám Hoa mọc thành chùm hay thành tán Cây thường ra hoa, kết quả từ tháng 3 đến tháng 6

Hình 1.3 Hoa dó bầu

Hạt chỉ có một phần chính ở trên dạng nón và phần kéo dài ở dưới, vỏ ngoài hoá gỗ, bên trong mềm

Quả khô, loại quả nang, hình quả lê có lông mịn, thông thường dài 4 cm, rộng 3 cm, dày 2 cm

Hình 1.4 Quả dó bầu

1.1.2 Phân bố [2][3]

Cây dó bầu thường mọc rải rác trong các vùng rừng dọc miền Trung và các tỉnh phía Nam, xuống tận An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc, có nơi có mật độ cao đạt đến 120-150 cây/ha như Ba Rền (Quảng Bình), Hương Khê (Hà Tĩnh) Phân

bố tập trung nhất và nhiều nhất là ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Bắc, Hoà Bình, Tuyên Quang, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum, Bình Ðịnh, Phú Yên

và Kiên Giang (đảo Phú Quốc và Hà Tiên)

1.1.3 Phân loại [5]

Trên thế giới, có khoảng 25 loài dó bầu Ở nước ta, cây dó bầu có tất cả bốn

loài A crassna Pierre ex Lecomte, A baillonii Pierre ex Lecomte, A banaense Pham-Hoang-Ho và A rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler A rugosa L.C.Kiệt & PJ.A

Kessler là loài được phát hiện gần đây (2005) do GS.TS Lê Công Kiệt (Việt Nam)

và TS Paul Kessler (Hà Lan) tìm thấy ở cao nguyên Trung Bộ, đây được xem là loài thứ 4 ở Việt Nam và thứ 25 trên thế giới

1.1.4 Đặc tính sinh học [5]

Cây dó bầu có khả năng hình thành ở phần lõi của thân một loại sản phẩm

đặc biệt có giá trị kinh tế rất cao gọi là trầm hương hay kỳ nam Những nghiên cứu

trước đây cho thấy, không phải bất kỳ thân cây dó bầu nào cũng có trầm hương và

kỳ nam Chỉ có một số cây có bệnh mới chứa trầm ở phần lõi của thân cây và quá

trình này chỉ xảy ra đối với cây dó bầu còn sống

Sản phẩm trầm hương hay kỳ nam là kết quả của cả một quá trình chuyển

hóa các bệnh lý ở những nơi cây bị bệnh, bị thương, hoặc bị tác động bởi những yếu

tố bên ngoài tạo nên vết thương Ngày nay, người ta còn sử dụng các loài vi sinh để

tạo nên các vết thương cho cây nhằm tăng khả năng hình thành trầm hương

Tùy thuộc vào sự tạo trầm hương mà có thể thu được những sản phẩm khác

nhau như :

Tóc: do sự biến đổi một phần chất gỗ hình thành những đường đen như sợi

tóc nhưng lượng tinh dầu ít nên chỉ được dùng làm nhang đốt

Trầm hương: gỗ trầm hương nhẹ, có vị cay, hơi đắng, mùi thơm nhẹ, có

màu nâu hay sọc đen, ngấm tinh dầu trầm nhiều hơn tóc Trầm hương càng tốt khi

nó càng dễ chìm trong nước Khi đốt cháy trầm hương bốc khói lên hình vòng rồi

tan biến nhanh trong không khí

Kỳ nam: loại tốt nhất do có sự biến đổi hoàn toàn của phần gỗ, thấm nhiều

tinh dầu trầm, sản phẩm này có thể có các màu nâu đậm, đen, xanh, vàng hay trắng

Kỳ nam nặng và nhuyễn, chìm trong nước, có đủ vị đắng, cay, chua, ngọt thơm,

thường hình thành ở phần lõi của cây trầm hương Kỳ nam chứa nhiều tinh dầu trầm

nên khi cháy tạo ngọn lửa màu xanh, khói lên thẳng và cao, bay lơ lửng trong không

khí rất lâu Người ta thường gói kỳ nam trong lá chuối thật kín rồi đem phơi nắng,

đến tối đem vào nếu có nhiều chất dầu chảy ra là tốt Muốn giữ kỳ nam được tốt và

lâu thì nên bọc vào giấy thiếc, bỏ vào hộp có nắp đậy kín để tinh dầu khỏi bay hơi

hoặc chảy ra

Hình 1.5 Lõi cây dó bầu sau khi được cấy

tạo trầm ba tháng Hình 1.6 Trầm hương

1.1.5 Công dụng của trầm hương và kỳ nam [5]

Trong y học cổ truyền nước ta, trầm được coi là vị thuốc quý hiếm, có vị cay, tính hơi ôn, có tác dụng giáng khí, nạp thận, tráng nguyên dương, được dùng chủ yếu để chữa các bệnh như đau ngực, đau bụng, nôn mữa, tiêu chảy, đau dạ dày, hen suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, á khẩu và khó thở

Ở Ấn Độ và Trung Quốc, hương trầm còn được sử dụng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh ung thư tuyến giáp trạng

Y học dân tộc Thái Lan dùng trầm hương để điều trị các bệnh tiêu chảy, lợi tiểu, hạ sốt, chống nôn, bổ huyết và trợ tim

Theo Đông y, kỳ nam dùng để trị các chứng độc thủy do phong thổ gây nên, làm tiêu chứng chướng mãn, no hơi, đau bụng, ói mửa, hen suyễn, thở gấp, hạ được nghịch khí, thông chứng bế do khí hư gây nên

Nước sắc từ gỗ trầm có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt với các loại khuẩn

Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri

Trầm hương có tính cháy rất cao, khi đốt tỏa mùi rất thơm, nhiều quốc gia có tập quán đốt trầm hương hoặc nhang sản xuất từ trầm hương trong dịp lễ cúng Gỗ trầm làm đồ trang trí nội thất quý giá

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

1.2.1 Thành phần hóa học của trầm hương

Từ những năm 1980, thành phần hóa học của trầm hương (agarwood) đã

được nhóm các nhà khoa học như T Nakanishi; nhóm Yasuo Shimada; nhóm

Masakazu Ishihara ; nhóm Tenji Konishi ; nhóm Regula Naf quan tâm và có

nhiều công trình nghiên cứu Các báo cáo cho thấy thành phần hóa học chính trong

trầm hương bao gồm các chromone và sesquiterpen [7-11][14-18]

Một số hợp chất chromone[10][11] được tìm thấy trong trầm hương như :

8

O HO

O O

OH O

R 1

R 1

O

O 7

OH

9

3' 2' 1' 6' 5' 4'

7'

8' 2 O 9

8 6 5 O

CH 3 CO

CH 3 CO

CH 3 CO

CH 3 CO

O

11

Một số hợp chất sesquiterpen có khung sườn guaiane[8][24] được tìm thấy

trong trầm hương như α-agarofuran (12), (-)-10-epi-γ-eudesmol (13),

oxo-agarospirol (14), guaiane (15), 1(10),11-dien-15-ol (16),

(-)-carboxylic acid (17), methyl

guaia-1(10),11-diene-15-carboxylate (18), (+)-guaia-1,(10),11-dien-9-one (19), (-)-1,10-epoxyguai-11-ene

(20), (-)-guaia-1(10),11-dien-15,2-olide (21), (-)-rotundone (22)

OH CHO

Một số sesquiterpen có khung sườn eudesmane[9] cũng được cô lập từ trầm

hương (-)-selina-3,11-dien-14-al (23), (+)-selina-4,11-dien-14-al (24), (-)-methyl selina-3,11-dien-14-oate (25), (+)-methylselina-4,11-dien-14-oate (26), (+)-methyl 9-hydroxyselina-4,11-dien-14-oate (27), (-)-dehydrojinkoh-eremol (28), neopetasane (29)

Năm 2006, nhóm nghiên cứu của S Kadota đã cô lập được một sesquiterpen

có khung spirovetivane (4R,5R,7R)-1(10)-spirovetiven-11-ol-2-one (30).[30]

CHO H CHO COOCH H 3 COOCH 3

Năm 1995, tác giả Regular Naf và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành

phần hóa học tinh dầu của một mẫu trầm hương có nguồn gốc từ Ấn Độ (A

agallocha Roxb.), sau khi đem phân tích mẫu tinh dầu bằng các phương pháp

GC/MS thu được các kết quả sau [5] ( Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Kết quả GC/MS của mẫu trầm hương A agallocha Roxb ở Ấn Độ

1.2.2 Thành phần hóa học thân cây dó bầu [5]

Năm 2007, Nguyễn Thị Thùy Trang và các cộng sự trường đại học Khoa học

tự nhiên HCM đã cô lập được một số hợp chất flavon, lignan và chromone trong

thân cây dó bầu A crassna khi cây chưa có trầm như

5-hydroxy-7,4'-dimethoxyflavone (31), 5-hydroxy-7,3',4'-trimethoxyflavone (32),

5,7-dihydroxy-3',4'-dimethoxyflavone (33), luteolin (34),

4-hydroxy-1,4-bis(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-2,3-bis hydroxymethyl-1-oxo-butane (35),

HO OCH3

OCH3 H3CO

OH

35

38

1.2.3 Thành phần hóa học trong lá cây dó bầu

Năm 2008, từ lá cây dó bầu A sinensis phân bố ở Trung Quốc nhóm nghiên

cứu M Shimazawa, M Iinuma và các cộng sự đã cô lập được bốn hợp chất

mangiferin (39), iriflophenone 2-O-α-rhamnoside (40), genkwanin

5-O-β-primeveroside (41), iriflophenone 3,5-C,C-β-diglucoside (42), trong đó hợp chất 41

cho thấy hoạt tính nhuận tràng khi thử trên chuột thí nghiệm.[6]

OH O

HO HO HO

O

OH MeO

HO O OH OH

H O

H H

HO OH

HO

O

Năm 2009, nhóm nghiên cứu Bo-Yang Yu và các cộng sự cũng đã cô lập

được từ lá cây dó bầu A sinensis (Trung Quốc) một số hợp chất flavonoid và

benzophenone glycoside[12] là aquilarinoside A (43), 7-β-D-glucoside of

5-O-methylapigenin (44), iriflophenone (45), mangiferin (39), 5-O-xylosylglucoside

7,4-di-O-methylapigenin (46), 5-β-D-glucoside 7,3-di-O-methylluteolin (47), luteolin

(34), genkwanin (48), hydroxygenkwanin (49)

OH

O

OH HO

O O OH OH HOH 2 C

OH

O

OH HO

49 48

Mặc dù trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về trầm hương (agarwood )

cũng như cây dó bầu nhưng cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa

học cũng như hoạt tính chống oxy hóa của lá cây dó bầu A crassna Pierre phân bố

gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản

ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng

dây chuyền, quá trình này gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể [1][19]

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những

căng thẳng thần kinh, cơ thể bị bệnh hay mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá,

dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều

chlorine và ngay cả từ oxygen

Ví dụ: một số gốc tự do như hydroxyl (HO•), hydroperoxyl (HOO•), peroxyl

(ROO•), alkoxyl (RO•), lipoperoxyd (LOO•)

1.3.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

nồng độ thích hợp, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất mầu

melanine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa

nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần

kinh, co bóp cơ.[1]

1.3.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể, ngay từ lúc con người mới sinh

ra mỗi tế bào chúng ta phải chịu sự tấn công của hàng chục ngàn gốc tự do mỗi

ngày Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do có thể gây ra các bệnh thoái

hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị

nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên

1.3.4 Gốc tự do DPPH•

Có rất nhiều mô hình được sử dụng để xác định khả năng chống oxy hóa

nhưng hiện nay phổ biến nhất là phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH•

vì phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và cho kết quả có độ ổn định cao

DPPH• ( 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ) là gốc tự do tương đối bền, có màu tím

đậm, không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH• có

cực đại hấp thu tại bước sóng 517 nm, và sản phẩm khử của nó là

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam.[1][19]

Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH• bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt Phản ứng trung hòa gốc

tự do DPPH• của chất chống oxy hóa được minh họa trong hình 1.7

Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH• 1.3.5 Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa

™ Xác định phần trăm ức chế I (%)

Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất được tính dựa trên phần trăm ức chế Phần trăm ức chế được xác định theo công thức :

%100

*(%)

c s c

A A A

ƒ Ac : Giá trị mật độ quang của dung dịch không có hoạt chất (mẫu control)

ƒ As : Giá trị mật độ quang của dung dịch có hoạt chất (mẫu thật)

™ Xác định IC 50

IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo

sát IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó có khả năng ức chế 50% gốc

tự do hoặc enzym Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp

¾ Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau

ƒ Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính theo nồng độ, chúng

ta vẽ đồ thị đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức

chế và x là nồng độ )

ƒ Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ,

một cách gần đúng, ta chọn hai nồng độ ức chế trên và dưới 50 % và

cũng tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b Ta sẽ thu được phương

trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết

¾ Thay y = 50 % vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x Đó chính là giá

trị IC50

2 NGHIÊN CỨU

GIỚI THIỆU CHUNG

Trong đề tài này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học, hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết và chất tinh khiết thu được trong lá cây dó bầu

Aquilaria crassna Pierre thu hái ở Lộc Ninh – Bình Phước Hàm lượng các chất cô

lập trong lá cây dó bầu cũng được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò UV-VIS

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 2.1 Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ lá cây dó bầu

Khảo sát khả năng chống oxy hóa của lá cây dó bầu Aquilaria crassna

Pierre bằng phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên các cao chiết methanol, hexane, ethyl acetate, butanol, ethanol và cao nước từ lá cây dó bầu

Kết quả thu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Kết quả hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết từ lá cây dó bầu

™ Cao nước A : cao nước còn lại sau khi trích lần lượt với các dung môi

™ Cao nước B : cao nước thu được khi đun trực tiếp lá khô với nước

Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu khảo sát, chúng tôi sử dụng

quercetin làm chất đối chứng dương vì đây là chất có hoạt tính ức chế gốc tự do

DPPH mạnh, được sử dụng làm chất chuẩn trong các tài liệu tham khảo Kết quả

hoạt tính của chứng dương được trình bày ở bảng 2.2

O

O OH

HO

OH

OH OH

Nhận xét

Qua kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của sáu mẫu cao chiết cho

thấy ngoài cao hexane, các cao còn lại đều có hoạt tính chống oxy hóa trong đó cao

nhất là cao ethyl acetate (IC50 7.96 µg mL-1) và cao butanol (IC50 10.24 µg mL-1 ) từ

đó giúp định hướng cho quá trình nghiên cứu thành phần hóa học trong lá cây dó

bầu

Ngoài ra, cao nước và cao ethanol chiết trực tiếp từ lá cây dó bầu cũng thể

hiện khả năng chống oxy hóa với IC50 lần lượt là 42.29 µg mL-1 và 36.31 µg mL-1

2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU A CRASSNA

Khảo sát thành phần hóa học trong lá cây dó bầu A crassna Pierre thu hái ở

Lộc Ninh – Bình Phước Từ cao ethyl acetate và cao butanol chúng tôi đã cô lập

được bảy hợp chất tinh khiết DB1-DB7 Dựa vào các phương pháp phổ nghiệm hiện

đại 1D-NMR, 2D-NMR, HR-MS… cấu trúc các hợp chất đã được xác định

2.2.1 Hợp chất DB1 Hợp chất DB1 thu được có dạng tinh thể hình kim màu trắng, sắc ký lớp

mỏng cho vết hấp thu UV ở bước sóng 254 nm

Phổ 1H-NMR của chất DB1, ở vùng trường cao cho mũi cộng hưởng ứng với

một nhóm –OCH3 δ 3.90 ( 3H, s) Những tín hiệu ở vùng từ 6 – 8 ppm, cho thấy sự hiện diện của một vòng benzen mang hai nhóm thế ở vị trí 1, 4, hai cặp proton còn

lại ghép ortho với nhau [δ 6.88 (2H, d, J=9.0, H-2,6); δ 7.96 ( 2H, d, J=9.0, H-3,5)];

tín hiệu của một nhóm –OH δ 6.49 ( 1H, s)

ứng với tám nguyên tử carbon, trong đó có một nhóm CH3O- ở δ 52.1, bốn carbon CH- của vòng benzen và ba carbon tứ cấp Ở vùng trường thấp thấy tín hiệu của carbon nhóm carbonyl liên hợp với vòng benzen ở δ 167.5 và carbon vòng benzen liên kết với oxygen ở δ 160.3 ppm

Những dữ kiện trên cho thấy hợp chất DB1 có cấu tạo là một vòng benzen

mang hai nhóm thế -OH và nhóm CH3CO- ở vị trí 1,4 So sánh với dữ liệu trên thư

viện phổ SBDS (Spectral Database for Organic Compounds) thấy có sự trùng

khớp, từ đó có thể kết luận DB1 là methyl 4-hydroxybenzoate với những dữ liệu

DB1 (Methyl 4-hydroxybenzoate ) 2.2.2 Hợp chất DB2

Hợp chất DB2 thu được có dạng tinh thể màu vàng, sắc ký lớp mỏng cho vết

hấp thu UV ở bước sóng 254 nm

của một nhóm – OCH3 liên kết với vòng benzen δ 3.87 (3H, s, 7-OCH3 ), một nhóm

–OH kiềm nối ở δ 12.97 ( 1H, s, 5-OH ), một proton olefin δ 6.85 (1H, s, H-3 ) Ở

vùng trường thấp thấy xuất hiện các tín hiệu tương ứng với hai vòng benzen, một

vòng mang bốn nhóm thế, hai proton còn lại ghép meta với nhau [δ 6.38 ( 1H, d,

J=2.0, H-6 ); δ 6.78 ( 1H, d, J=2.0, H-8 )]; vòng thứ hai mang hai nhóm thế ở vị trí

1,4 bốn proton còn lại chia thành hai cặp ghép ortho với nhau [δ 6.94 (2H, d, J=7.0,

H-3’,5’); δ 7.97 ( 2H, d, J=7.0, H-2',6')]

của 16 carbon, vùng trường thấp có tín hiệu của một nhóm carbonyl liên hợp δ

181.9 (C-4 ), năm carbon hương phương liên kết với oxygen δ 165.1 (C-7), δ 164.1

(C-2), δ 161.3 (C-5), δ 161.2 (C-4' ) và δ 157.2 (C-9 ), ở vùng trường cao còn có tín

hiệu của nhóm CH3O- liên kết với vòng benzen δ 56.0 (7-OCH3 )

Các tín hiệu phổ trên cho thấy chất DB2 là một flavonoid có khung sườn

apigenin với một nhóm thế CH3O- ở vị trí C-7 So sánh với tài liệu tham khảo[25]

xác định hợp chất DB2 là 7-O-methylapigenin

O

O OH

H3CO

OH 1

2

3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4'

5' 6'

mỏng cho vết hấp thu UV ở bước sóng 254 nm

Phổ 1H-NMR của hợp chất DB3 cho những tín hiệu tương tự hợp chất DB2,

cho thấy đây cũng là hợp chất flavonoid có khung sườn apigenin Tuy nhiên ở hợp

chất DB3 ở vùng trường cao còn xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm methoxy δ

3.89 ( 3H, s, 4'-OCH3 ), do vẫn còn tín hiệu nhóm -OH kiềm nối 12.81 (1H, s,

5-OH) , nên nhóm methoxy này chỉ có thể liên kết với khung apigenin ở vị trí C-4'

tất cả 17 carbon, trong đó có hai nhóm CH3- , bảy nhóm -CH- và tám carbon tứ cấp

Vùng trường thấp có tín hiệu của một nhóm carbonyl liên hợp δ 182.5 (C-4), năm

carbon hương phương liên kết với oxygen δ 165.5 7), δ 164.1 2), δ 162.6

(C-4'), δ 162.2 (C-5) và δ 157.7 (C-9), ở vùng trường cao còn có hai tín hiệu của nhóm

CH3O- liên kết với vòng benzen δ 55.8 (7-OCH3 ) và δ 55.5 (4'-OCH3 )

Từ những dữ liệu trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo[32] có thể kết

luận hợp chất DB3 có cấu trúc xác định là 7,4'-O-dimethylapigenin

DB3 (7,4'-O-dimethylapigenin )

Bảng 2.4 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) của DB3 trong

mỏng cho vết hấp thu UV λ 254 nm

hiện diện của một nhóm -OCH3 gắn trên vòng benzen ở δ 3.90 ( 3H, s, 7-OCH3 ); Ở vùng trường thấp từ 6-8 ppm xuất hiện tín hiệu của hai vòng benzen Vòng thứ nhất mang bốn nhóm thế ở vị trí 1, 2, 3, 5, hai proton còn lại ghép meta với nhau [δ 6.86

(1H, d, J=2.0, H-6); 7.02 (1H, d, J=2.0, H-8 )],vòng thứ hai mang hai nhóm thế ở vị

trí 1, 4 , bốn proton còn lại chia thành hai cặp đối xứng ghép ortho với nhau [ δ 7.93

(2H, d, J =9, H-2',6'); δ 6.92 (2H, d, J=9, H-3', 5' )], một proton olefin δ 6.70 ( s,

1H, H-3 ) Ở vùng trường từ 3-5 ppm thấy xuất hiện tính hiệu của hai đơn vị đường với hai proton anomer β-glucose δ 4.80 (1H, d, J=7.5 ) và đường β-xylose δ 4.19 (1H, d, J=7.5)

579.1708) tương ứng với công thức phân tử C27H30O14

diện của 27 carbon trong đó có bảy carbon tứ cấp, một carbon -CH3, hai carbon

-CH2, 16 carbon -CH Ở vùng trường thấp có tín hiệu của một nhóm carbonyl liên hợp δ 177 ppm (s, C-4); năm carbon hương phương liên kết với oxy ở δ 155-165 ppm Ở vùng từ δ 60- 80 ppm thấy xuất hiện nhóm tính hiệu hiện diện của hai đơn

vị đường glucose và xylose và tín hiệu của carbon anomer của đường glucose δ

103.5 ppm và đường xylose δ 104.4 ppm

Từ các dữ kiện trên cho thấy hợp chất BD4 là một flavonoid có khung

apigenin mang nhóm thế methyl và hai đơn vị đường β-glucose và β-xylose

Phổ HMBC của DB4 cho các tín hiệu tương tác giữa H-3 với C-2, C-4, C-10,

C-1' ; giữa H-6 với C-5, C-7, C-8, C-10 ; H-8 với C-6, C-7, C-9, C-10 ; H-2',6' và

H-3',5' cùng tương tác với C-4 Ngoài ra còn có tương tác giữa proton nhóm CH3O-

và C-7, proton anomer của đường glucose H-1'' và C-5, proton anomer đường

xylose và C-6'' Từ đó có thể xác định được tất cả các tín hiệu carbon, proton và

cách liên kết của khung apigenin và phần đường

Từ phổ NMR một chiều và hai chiều, kết hợp với tài liệu tham khảo[6] xác

HO

H OH

O HO

HO

OH HO

1 2

3 4 5 6

8 9 10 1'

2' 3'4' 5' 6'

1'' 2'' 3'' 4'' 5''6"

1''' 2''' 3'''

4'''

7

DB4 (7-O-methylapigenin 5-O-[β –D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranoside])

Bảng 2.5 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) và tương quan HMBC của

DB4 trong DMSO-d6

DB4 Carbon

2.2.5 Hợp chất DB5

Hợp chất DB5 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng nhạt Sắc ký lớp mỏng

cho vết hấp thu UV λ 254 nm

Phổ 1H-NMR của hợp chất DB5 cho thấy tín hiệu của nhóm –OH kiềm nối ở

vùng trường thấp δ 13.82 (1H, s), sự hiện diện của ba proton vòng benzen ở δ 7.36

(1H, s), 6.82 (1H, s ) và 6.37 (1H, s ) Nhóm tín hiệu ở vùng từ 3-5 ppm cho thấy sự

hiện diện của một phân tử đường với proton anomer nằm ở vùng trường cao δ 4.58

(1H, d, J = 10 ), giá trị hằng số ghép lên đến 10 Hz, cho phép dự đoán đây là một

hợp chất C-glucoside

423.0921) tương ứng với công thức phân tử C19H18O11

10 carbon tứ cấp Ở vùng trường thấp có sự hiện diện của nhóm carbonyl tham gia

liên hợp δC 178.9, sáu carbon vòng benzen liên kết với oxygen δC 163.7 (C-3),

161.7 (C-1), 156.1 (C-4a), 150.9 (C-4b), 143.9 (C-7) Nhóm tín hiệu ở vùng δC 60 –

95 ppm cũng cho thấy sự hiện diện của một đơn vị đường C-glucoside với carbon

anomer ở δC 73.0 ppm

Từ những dữ liệu trên cho thấy DB5 là một xanthone C-glycoside, kết hợp

so sánh với số liệu đã công bố trong những nghiên cứu trước đây[13] có thể kết luận

DB5 là mangiferin

OH O

OH

HO O OH HO

HO

HO

1 2

7 8 8a 9a 1'

2' 3'

hấp thu UV λ254 nm Giá trị góc quay cực [α]D25-148.5 (c = 0.017, CH3OH)

Phổ 1H-NMR của hợp chất DB6, ở vùng từ trường thấp có tín hiệu của ba

proton olefin δH 5.89 (1H, s, H-4), 5.98 (1H, d, J = 15.5, H-7), 5.73 (1H, dd, J =

15.5;7.5, H-8), hai proton H-7, H-8 ghép trans với nhau Ở vùng từ 3-5 ppm có sự

hiện diện của một nhóm tín hiệu, tương ứng với một đơn vị đường β-D-glucose với

proton anomer δH 4.28 (1H, d, J = 8, H-1’), một proton của carbon liên kết với

oxygen δH 4.54 (1H, quint, J = 6.5, H-9)

Cặp tín hiệu tại δH 2.61 (1H, d, J = 16.5, H-2a) và δH 2.18 (1H, d, J = 16.5,

H-2b) cho thấy sự hiện diện của hai proton metylen ở vị trí α so với nhóm carbonyl

Ở vùng từ trường cao có bốn tín hiệu của bốn nhóm methyl ở δH 1.04 (3H, s,

H-11), δH 1.06 (3H, s, H-12), δH 1.30 (3H, d, J = 6.5, H-10), và δH 1.96 (3H, s,

H-13) trong đó H-12 và H-11 là hai proton của hai carbon cùng gắn trên cùng một

carbon tứ cấp

thuyết 409.1832) tương ứng với công thức phân tử C19H30O8.

Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu tương ứng với 19 carbon trong đó

có bốn carbon tứ cấp, hai nhóm -CH2- , bốn nhóm CH3, chín nhóm CH Tín hiệu

của nhóm carbonyl liên hợp trong vòng ở δC 201.2 (C-3) và hai liên kết đôi C=C ở

δC 133.8 (C-7), 133.8 (C-8), 127.1 (C-4), 167.1 (C-5) Ở vùng 60-80 pmm cũng cho

thấy sự hiện diện của một đơn vị đường glucose với carbon anomer ở δC 101.3 ppm

Dựa vào phổ COSY và HSQC ta có thể xác định được proton và các carbon

mang proton phần aglycone và phần đường của hợp chất DB6

Phổ HMBC cho thấy tương tác giữa proton anomer với C-9 nên nhóm đường

β-D-glucopyranosyl liên kết với C-9 Tín hiệu tương tác giữa H-8 với C-6, H-7 với

C-6 và C5 giúp xác định vị trí của liên kết đôi C=C với C-6

Mặt khác, ta thấy có sự tương quan giữa H-13 với C-6, C-4, C-5 nên nhóm

CH3-13 gắn ở vị trí C-5 Tương quan giữa H-11, H-12 với C-2, C-6, C-1 vậy hai

nhóm CH3-11 và CH3-12 gắn với C-1 và C-1 sẽ gắn với C-2 và C-6

Kết hợp những dữ liệu phổ trên cho thấy hợp chất DB6 có cấu trúc tương tự

với hợp chất (6R,9S)- roseoside, so sánh số liệu phổ đã công bố thấy có sự tương

hợp[31] , do đó đề nghị cấu trúc của hợp chất DB6 là (6R,9S)- roseoside

DB6 [ (6R,9S)- roseoside ]

Bảng 2.7 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) trong methanol-d4

của DB6 so với (6R, 9S)-roseoside

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10

11 12

2' 3' 4' 5'6'

1'

13 H

H H

O

H

Phổ 1H-NMR của hợp chất DB7, ở vùng từ trường thấp xuất hiện tín hiệu

của vòng benzen mang hai nhóm thế ở vị trí 1,4, hai cặp proton còn lại ghép ortho

với nhau [ δH 7.68 (1H, d, J = 8.5, H-2',6') và 6.81 (1H, d, J = 8.5, H-3',5') ] Vùng

từ 3-5 ppm cũng cho thấy nhóm tín hiệu tương ứng với đơn vị đường β-D-glucose

với proton anomer δH 4.95 (1H, d, J = 10), hằng số ghép lên đến 10 Hz cho phép dự

đoán đây là một hợp chất C-glucoside

571.1657) tương ứng với công thức phân tử C25H30O15 trong khi đó phổ 13C-NMR

của DB7 chỉ cho thấy 15 tín hiệu, điều đó cho thấy DB7 có cấu trúc đối xứng

carbonyl δC 198.7 (C-7), bốn carbon vòng benzen liên kết với oxygen δC 163.1

(C-4'), 160.2 (C-4 ), 159.0 (C-2,6 ) Ở vùng từ 60-90 ppm, những tín hiệu cho thấy sự

hiện diện của đơn vị đường β-D-glucopyranosyl với carbon anomer ở δC 77.0, điều

này cũng cho thấy DB7 là hợp chất C-glucoside

Phổ 2D-NMR, những tín hiệu trên COSY và HSQC cho phép xác định các

proton và các carbon mang proton phần aglycone và phần đường

Phổ HMBC cho thấy có sự tương tác giữa tín hiệu proton của H2’,6’ và

nhóm carbonyl (C-7); H-2', 6' và C-3',5'; tương quan giữa proton anomer với carbon

tứ cấp tại vị trí δC 105.4 (C-3), δC 159.0 (C-2), δC 160.3 (C-4), những tín hiệu tương tác trên giúp xác định sự liên kết trong phân tử và có hai nhóm đường glucoside đối xứng nhau liên kết với vòng benzen thứ hai và tại carbon C-3, C-5

Từ những dữ liệu trên cho thấy hợp chất DB7 là hợp chất có khung sườn

iriflophenone liên kết với hai đường tại vị trí 3,5 của vòng benzen

3,5-C,C-β-diglucopyranoside trình bày trong bảng dưới cho thấy có sự tương hợp[12] , do đó đề

nghị cấu trúc của hợp chất DB7 là iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucopyranoside

OH

OH OH

HO O OH

OH

HO HO

1 2 3

4 5 6

1' 2' 3'

4' 5' 6'

O

7

O OH HO

OH

1''' 2'''

3''' 4'''

5''' 6'''

1'' 2"

3''

6''

DB7 ( Iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucoside)

Bảng 2.8 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) của DB7 trong

methanol-d4 so với iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucopyranoside

Khả năng chống oxy hóa của các chất DB1-DB7 cô lập được từ lá cây dó

bầu A crassna Pierre cũng được xác định bằng phương pháp thử nghiệm hoạt tính

ức chế gốc tự do DPPH Kết quả thu được trình bày ở bảng 2.9

Bảng 2.9 Kết quả hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các chất DB1-DB7

% ỨC CHẾ STT MẪU

Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của bảy hợp chất cô

lập từ lá cây dó bầu A crassna cho thấy hợp chất DB5 ( mangiferin ) có hoạt tính

rất mạnh với IC50 5.14 µM so với chất đối chứng dương quercetin IC50 6.52 µM

2.4 Hàm lượng các chất trong lá dó bầu Aquilaria crassna

Hàm lượng các hợp chất cô lập từ lá dó bầu DB1-DB7 được xác định bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-UV Kết quả phân tích được trình

Kết quả hàm lượng các hợp chất trong lá cây dó bầu cho thấy hàm lượng

DB5 ( mangiferin ) trong lá cây dó bầu rất cao lên đến 17.16 mg/g ( tương đương

1.7% trong lá khô) chứng minh đây là hợp chất chính trong lá Điều này hứa hẹn

khả năng sử dụng lá cây dó bầu như nguồn nguyên liệu chiết xuất mangiferin cung

cấp cho ngành công nghiệp dược trong nước

3 THỰC NGHIỆM

3.1 ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM

Quá trình nghiên cứu thành phần hóa học, thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa và xác định hàm lượng các chất được thực hiện trong điều kiện như sau

™ Dung môi- hóa chất

ƒ Acetonitril ( Merck, HPLC )

ƒ Butanol (Trung Quốc )

ƒ Ethanol ( Merck, Analysis )

ƒ Ethyl acetate ( ChemSol )

ƒ Sắc ký lớp mỏng tráng sẵn ( Merck, Kielselgl 60 F254, 250 μm) Các cấu

tử trên bảng mỏng được phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm hoặc sử dụng H2SO4 20%, đun nóng

ƒ Sắc ký cột được thực hiện trên silica gel Merck (40-60 μm, Merck )

ƒ Máy quang phổ Shimadzu UV-1800

ƒ Máy đo quang A Kruss Optronic sử dụng để đo góc quay cực

ƒ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế LC-8A ghép đầu dò UV-VIS

ƒ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Varian 300 MHz ( đại học Roskilde Đan Mạch ) và máy Bruker AV 500 MHz ( đại học Khoa học tự nhiên HCM )

ƒ Khối phổ phân giải cao HR-MS được đo trực tiếp trên đầu dò Bruker microQ-TOF

Hình 3.1 Hình ảnh một số thiết bị sử dụng trong đề tài

Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz Máy cộng hưởng từ hạt nhân Varian 300 MHz

Sắc ký hiệu năng cao điều chế PHPLC-LC8A Khối phổ phân giải cao microQ-TOF

3.2 THU HÁI – XỬ LÝ MẪU

Nguyên liệu lá cây dó bầu A crassna Pierre được thu hái ở Lộc Ninh – Bình

Phước được cung cấp bởi công ty TNHH Trầm Hương Việt Lá cây tươi được phơi trong mát trong hai tuần và sấy ở 60oC trong 24 giờ, sau đó nghiền nhỏ để sử dụng trong thực nghiệm

Lá cây dó bầu khô (2.5 kg) được trích bằng phương pháp đun hoàn lưu với methanol trong ba giờ (mỗi mẫu đun ba lần), thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được 130 g cao metanol Lấy cao thô này hòa tan vào nước và trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi như hexane, ethyl acetate, butanol thu được các cao tương ứng và dịch nước còn lại (cao nước A) Các cao này được sử dụng để khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Điều chế cao nước B: lá dó bầu khô ( 2 g ) cắt nhỏ đun hoàn lưu trong nước

ba lần, mỗi lần 30 phút, lọc và đem cô quay ở 40oC thu được cao nước

Điều chế cao ethanol: lá dó bầu khô ( 2 g ) cắt nhỏ đun hoàn lưu trong dung dịch ethanol trong ba lần, mỗi lần 30 phút, lọc và đem cô quay ở 40oC thu được cao ethanol

3.3 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ GỐC TỰ DO DPPH 3.3.1 Quy trình thử hoạt tính

• Dung dịch DPPH : cân chính xác 3,94 mg DPPH pha trong bình định mức

100 mL bằng ethanol thu được dung dịch DPPH có nồng độ 100 µM

• Dung dịch mẫu thử: cân một lượng xác định mẫu thử (khoảng từ 4-5 mg ), hòa tan trong 1000 µL ethanol Sau đó pha loãng thành dung dịch có nồng độ 500 µg/ml rồi từ dung dịch này pha lần lượt thành các dung dịch có nồng độ là: 100 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, 10µg/ml theo thể tích trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Bảng pha nồng độ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

™ B : mẫu blank S : mẫu thử

Mỗi mẫu ban đầu được thử ở bốn nồng độ khác nhau 100, 50, 25,10 µg mL-1

Mỗi nồng độ được tiến hành ba lần, thu được ba giá trị phần trăm ức chế (I %) Lấy

trung bình ba giá trị đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng

nồng độ khảo sát

Đối với những mẫu có hoạt tính mạnh IC50 < 10 µg mL-1 (hoặc µM ), pha

loãng dung dịch làm việc xuống nồng độ 50 µg mL-1 ( đối với mẫu cao chiết ) hay

50 µM ( đối với chất cô lập ) và tiến hành pha dung dich như bảng 3.1 được các

nồng độ (10, 5, 2.5, 1 µg mL-1 hay µM ) để xác định giá trị IC50

Sau khi pha xong dung dịch mẫu thử, đem ủ trong bóng tối trong vòng 30

phút rồi đem đo quang tại bước sóng 517 nm quy trình thực hiện theo sơ đồ 1

Sơ đồ 3.1 Quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

3.4.1 Khảo sát cao ethyl acetate

Cao ethyl acetate (21 g ) được tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi hexane : ethyl acetate ( 9 : 1 tăng dần đến 1 : 9, kết thúc bằng metanol 100% ) thu được bảy phân đoạn từ AE1-AE7

™ Phân đoạn AE2 (1.2 g ) : thực hiện sắc ký cột trên silica gel pha thuận với

hệ dung môi giải ly hexane : ethyl acetate ( 8 : 2 ) thu được hợp chất tinh khiết màu

trắng đặt tên là DB1 (15 mg )

™ Phân đoạn AE3 ( 1.5 g ) : thực hiện sắc ký cột trên silica gel pha thuận với

hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O ( 90 : 10 : 0.1 ) thu được hai hợp chất tinh khiết

DB2 (32 mg ) và DB4 (10 mg )

™ Phân đoạn AE5 (0.9 g ): thực hiện sắc ký cột tương tự với hệ dung môi

hexane : acetone ( 5 : 5 ) thu được hợp chất tinh khiết màu vàng DB3 (35 mg ) 3.4.2 Khảo sát cao butanol

Cao butanol (28 g ) được tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thuận với

hệ dung môi chloroform : methanol : nước ( 20:6:1; 14:6:1 ; 10:5:1, kết thúc bằng metanol 100% ) thu được 25 phân đoạn BU1-BU25

™ Phân đoạn BU2 (2g ) thực hiện sắc ký cột với hệ dung môi chloroform : methanol : H2O ( 80:20:2 ), thu được hợp chất màu vàng nâu kết tinh lại trong

methanol : chloroform 5 : 5 thu được tinh khiết màu vàng nhạt DB5 (1.2 g )

™ Phân đoạn BU10 (0.8 g ) thực hiện sắc ký cột trên silice gel pha thuận với

hệ dung môi chloroform : aceton : metanol (4 : 3 : 1 ) thu được năm phân đoạn

BU10.1-BU10.5 Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (preparative HPLC )

phân đoạn BU10.2 trên cột C18, hệ dung môi metanol : nước (24 : 76 ), tốc độ dòng

5 ml/phút, đầu dò UV ở bước sóng 254 nm thu được hợp chất DB6 (7 mg )

™ Phân đoạn BU20 (1.2 g ) thực hiện sắc ký cột silicagel pha thuận với hệ

dung môi ethyl acetate : methanol : nước (8 :1 :1) thu được sáu phân đoạn

BU20.1-BU20.6 Sử dụng HPLC điều chế phân đoạn BU20.5 trên cột C18 với hệ dung môi

methanol : nước (17 : 83 ), tốc độ dòng 5 ml/phút, đầu dò UV ở bước sóng 254 nm

thu được hợp chất DB7 ( 25 mg )

Khảo sát thành phần hóa học trong cao ethyl acetate và butanol của lá cây dó

bầu A crassna Pierre thu được bảy hợp chất DB1-DB7, sơ đồ quá trình cô lập được

miêu tả trong sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Quá trình cô lập các chất trong lá cây dó bầu A crassna Pierre

3.5 ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY DÓ BẦU Tiến hành xác định hàm lượng các hợp chất DB1 methyl 4-hydroxybenzoate ,

DB2 7-O-methylapigenin, DB3 7,4'-O-dimethylapigenin, DB4 7-O-methylapigenin 5-O-[β –D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranoside], DB5 mangiferin, DB6

(6R,9S)- roseoside và DB7 iriflophenon 3,5-C-β-diglucoside trong lá cây dó bầu A crassna Pierre

3.5.1 Xử lý mẫu

Lá dó bầu khô được cân một lượng xác định (khoảng 1 g ) đun trong methanol trong hai giờ (ba lần ) Ba lần được gộp chung lại và thu hồi dung môi ở

áp suất kém thu được cao methanol, hòa tan lại cao methanol trong bình định mức

25 mL, làm sạch mẫu qua cột SPE chuẩn bị tiêm vào máy

3.5.2 Điều kiện phân tích

đầu dò UV-VIS ( HPLC Shimadzu ), cột phân tích Supelco Ascentis TM C-18 25cm x 4.6mm 5µm điều kiện phân tích thay đổi tùy theo mỗi hợp chất như sau

chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.8 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.2-3.3

Hình 3.2 Sắc ký đồ chuẩn DB1 Hình 3.3 Sắc ký đồ phân tích DB1 trong lá dó bầu

điều chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.7 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 238

nm Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.4-3.5

Hình 3.4 Sắc ký đồ chuẩn DB2, DB3 Hình 3.5 Sắc ký đồ phân tích DB2, DB3 trong lá dó bầu

chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.8 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm

Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.6-3.7

Hình 3.6 Sắc ký đồ chuẩn DB4 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân tích DB4 trong lá dó bầu

¾ Phân tích DB5: dung môi acetonitril : H2O 25 : 75 ( nước pH=2.5 điều

chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.9 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm

Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.8-3.9

Hình 3.8 Sắc ký đồ chuẩn DB5 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân tích DB5 trong lá dó bầu

chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.8 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.10-3.11

Hình 3.10 Sắc ký đồ chuẩn DB6 Hình 3.11 Sắc ký đồ phân tích DB6 trong lá dó bầu

chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.9 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.12-3.13

Hình 3.12 Sắc ký đồ chuẩn DB7 Hình 3.13 Sắc ký đồ phân tích DB7 trong lá dó bầu

3.5.3 Xử lý số liệu phân tích Kết quả hàm lượng được tính toán theo công thức :

2

S 1

S C

ƒ M m : khối lượng mẫu (g )

ƒ S 1 : diện tích peak mẫu

ƒ S 2 : diện tích peak chuẩn