thành phần hóa học lá cây dó bầu aquilaria crassna pierre

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG UY NHÂN THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU AQUILARIA CRASSNA PIERRE. CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. TRẦN LÊ QUAN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010 LỜI CẢM ƠN Thực hiện một luận văn thạc sĩ là một công việc khó khăn mà em phải làm từ trước cho đến nay. Trên con đường bắt đầu nghiên cứu khoa học thật không thể tránh khỏi nhiều bỡ ngỡ, khó khăn và nhiều lần thất bại … nếu không có những lời động viên, sự giúp đỡ chân thành từ thầy cô, bè bạn và gia đình chắc chắn em không thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người. Em xin cảm ơn thầy Trần Lê Quan, người đã hết lòng lo lắng, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài. Thầy không chỉ truyền dạy cho em những kiến thức chuyên môn sâu sắc mà còn hướng dẫn cho em nhiều điều bổ ích trong cuộc sống. Em xin cảm ơn GS. Poul Erik Hansen và các cộng sự của thầy đã hết lòng giúp đỡ em trong thời gian làm việc tại đại học Roskilde Đan Mạch. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TSKH. Nguyễn Công Hào, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh và thầy TS. Nguyễn Trung Nhân đã đóng góp nhiều ý kiến thiết thực quý báu để em hoàn chỉnh luận văn của mình. Xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô, các em sinh viên, những người bạn khoa Hóa và phòng Thí nghiệm Phân tích trung tâm trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM, những người đã sát cánh cùng tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn em, vợ của tôi, người đã lo lắng, động viên, hỗ trợ hết lòng để tôi vững bước trên con đường nghiên cứu khoa học. Con xin cám ơn cha má, người đã sinh con ra và nuôi con khôn lớn đến ngày hôm nay. Xin cha phù hộ cho con vững bước trên con đường này. MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC Danh mục các chữ viết tắt Lời mở đầu 1 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Giới thiệu về cây dó bầu 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Phân bố 3 1.1.3. Phân loại 3 1.1.4. Đặc tính sinh học 4 1.1.5. Công dụng của trầm hương và kỳ nam 5 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 6 1.2.1. Thành phần hóa học của trầm hương 6 1.2.2. Thành phần hóa học thân cây dó bầu 12 1.2.3. Thành phần hóa học trong lá cây dó bầu 14 1.3. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ GỐC TỰ DO DPPH• 15 1.3.1 Khái niệm về gốc tự do 15 1.3.2. Lợi ích của gốc tự do 16 1.3.3. Tác hại của gốc tự do 16 1.3.4. Gốc tự do DPPH• 16 1.3.5. Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa 17 2. NGHIÊN CỨU 19 2.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ lá cây dó bầu 19 2.2. Thành phần hóa học lá cây dó bầu A. crassna 21 2.2.1. Hợp chất DB1 21 2.2.2. Hợp chất DB2 22 2.2.3. Hợp chất DB3 23 2.2.4. Hợp chất DB4 25 2.2.5. Hợp chất DB5 28 2.2.6. Hợp chất DB6 29 2.2.7. Hợp chất DB7 32 2.3. Hoạt tính chống oxy hóa của các chất cô lập 35 2.4. Hàm lượng các chất trong lá dó bầu 36 3. THỰC NGHIỆM 37 3.1. Điều kiện thực nghiệm 37 3.2. Thu hái – xử lý mẫu 39 3.3. Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 39 3.3.1. Quy trình thử hoạt tính 39 3.4. Quy trình cô lập 41 3.4.1. Khảo sát cao ethyl acetate 41 3.4.2. Khảo sát cao butanol 41 3.5. Định lượng các chất trong lá cây dó bầu 43 3.5.1. Xử lý mẫu 43 3.5.2. Điều kiện phân tích 43 3.5.3. Xử lý số liệu phân tích 45 4. KẾT LUẬN 46 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AC : acetone COSY : Correlation Spectroscopy d : doublet, mũi đôi dd : mũi đôi đôi DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO : dimethyl sulfoxide DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA : ethyl acetate GC-MS : sắc ký khí ghép khối phổ HE : hexane HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao HR-MS : khối phổ phân giải cao HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence J : hằng số ghép spin m : multiplet, mũi đa NMR : cộng hưởng từ hạt nhân PHPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế q : quartet, mũi bốn s : singlet, mũi đơn SKC : sắc ký cột t : triplet, mũi ba 1 LỜI MỞ ĐẦU Cây dó bầu hay còn gọi là cây trầm hương là loại cây có khả năng hình thành ở phần lõi của thân một sản phẩm quí là trầm hương và kỳ nam có giá trị kinh tế rất cao, nhất là trên thị trường quốc tế. Là loại cây đặc trưng phân bố ở vùng Đông Nam Á, có khả năng tạo được sản phẩm có giá trị, lại thích nghi được với địa hình đồi núi nên cây dó bầu được khuyến khích nhân giống và phát triển rộng rãi khắp các tỉnh trong cả nước. Theo thống kê của Hội Trầm hương đến nay đã có trên 23 tỉnh thành trồng cây dó bầu với tổng diện tích hơn 8000 ha. Ước tính diện tích trồng dó bầu mỗi năm tăng từ 2400 - 4000 ha và đến năm 2010 diện tích trồng cây dó bầu trên cả nước có thể lên đến 30.000 ha. Việc phát triển loài cây quý này ngoài việc thu được nguồn lợi lớn về kinh tế còn rất phù hợp để cải thiện tình hình môi trường ngày càng xuống cấp do nạn chặt phá rừng bừa bãi như hiện nay. Tuy nhiên do thời gian thu hoạch khá lâu và chưa có phương pháp cụ thể để tạo trầm, người dân chủ yếu dựa vào kinh nghiệm nên gặp phải rất nhiều rủi ro. Vấn đề này ảnh hưởng rất lớn đến các doanh nghiệp trồng dó bầu nhất là các doanh nghiệp vừa và nhỏ, vì thế việc nghiên cứu một nguồn thu khác nhanh hơn, ổn định hơn cho người dân trồng dó bầu là vô cùng cần thiết. Đã có nhiều nghiên cứu về trầm hương (agarwood) và tinh dầu trầm được công bố trong và ngoài nước, tuy nhiên cho đến nay có rất ít nghiên cứu về lá cây dó bầu Aquilaria crassna. Để góp phần giải quyết vấn đề về nguồn thu cho người dân cũng như mở rộng thêm những hiểu biết về cây dó bầu Việt Nam , trong đề tài này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học trong lá của cây dó bầu A. crassna, thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa các cao chiết và hợp chất tinh khiết cô lập được từ đó đánh giá khả năng sử dụng lá dó bầu như nguồn nguyên liệu sản xuất sản phẩm thứ cấp tạo nguồn thu mới cho người dân trồng dó bầu trong khoảng thời gian chờ cây cho trầm. 2 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY DÓ BẦU Tên khoa học: Aquilaria crassna Pierre. Tên thông thường: cây trầm hương, dó bầu. Họ: Trầm hương (Thymelacaceae ) Bộ: Mytales. Lớp: Magnoliopsida. Hình 1.1. Cây dó bầu 1.1.1. Đặc điểm thực vật [2][3] Cây dó bầu là loại cây thân gỗ sống lâu năm, có thể cao đến 30-40 m, đường kính 1-1.5 m, vỏ xám, tán thưa, thân thẳng, có xơ. Cây dó bầu phân bố rải rác trong các khu rừng thuộc kiểu ẩm nhiệt đới nguyên sinh hoặc thứ sinh, sống thích hợp trong rừng hỗn giao, cây lá rộng. Cây dó bầu có thể tái sinh bằng chồi hay bằng hạt, sinh trưởng và phát triển trong các điều kiện nhiệt độ ban ngày 15-36 o C, ban đêm 5-25 o C. Lá mọc so le, thuôn hay bầu dục ngọn giáo, nhọn ở gốc, thon hẹp ở đầu, phiến lá dài 8-10 cm, rộng 3.5-5.5 cm, có mép phồng lên thành vòng, mặt trên màu lục, sáng bóng, nhẵn, mặt dưới nhạt hơn, có lông mềm, cuống lá dài 4-6 mm. Hình 1.2. Lá cây dó bầu 3 Cây trên ba tuổi có thể ra hoa. Hoa nhỏ có hình chuông màu vàng lục, trắng nhạt hoặc vàng xám. Hoa mọc thành chùm hay thành tán. Cây thường ra hoa, kết quả từ tháng 3 đến tháng 6. Hình 1.3. Hoa dó bầu Hạt chỉ có một phần chính ở trên dạng nón và phần kéo dài ở dưới, vỏ ngoài hoá gỗ, bên trong mềm. Quả khô, loại quả nang, hình quả lê có lông mịn, thông thường dài 4 cm, rộng 3 cm, dày 2 cm. Hình 1.4. Quả dó bầu 1.1.2. Phân bố [2][3] Cây dó bầu thường mọc rải rác trong các vùng rừng dọc miền Trung và các tỉnh phía Nam, xuống tận An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc, có nơi có mật độ cao đạt đến 120-150 cây/ha như Ba Rền (Quảng Bình), Hương Khê (Hà Tĩnh). Phân bố tập trung nhất và nhiều nhất là ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Bắc, Hoà Bình, Tuyên Quang, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum, Bình Ðịnh, Phú Yên và Kiên Giang (đảo Phú Quốc và Hà Tiên). 1.1.3. Phân loại [5] Trên thế giới, có khoảng 25 loài dó bầu. Ở nước ta, cây dó bầu có tất cả bốn loài A. crassna Pierre ex Lecomte, A. baillonii Pierre ex Lecomte, A. banaense Pham-Hoang-Ho và A. rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler. A. rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler là loài được phát hiện gần đây (2005) do GS.TS Lê Công Kiệt (Việt Nam) và TS. Paul Kessler (Hà Lan) tìm thấy ở cao nguyên Trung Bộ, đây được xem là loài thứ 4 ở Việt Nam và thứ 25 trên thế giới. 4 1.1.4. Đặc tính sinh học [5] Cây dó bầu có khả năng hình thành ở phần lõi của thân một loại sản phẩm đặc biệt có giá trị kinh tế rất cao gọi là trầm hương hay kỳ nam. Những nghiên cứu trước đây cho thấy, không phải bất kỳ thân cây dó bầu nào cũng có trầm hương và kỳ nam. Chỉ có một số cây có bệnh mới chứa trầm ở phần lõi của thân cây và quá trình này chỉ xảy ra đối với cây dó bầu còn sống. Sản phẩm trầm hương hay kỳ nam là kết quả của cả một quá trình chuyển hóa các bệnh lý ở những nơi cây bị bệnh, bị thương, hoặc bị tác động bởi những yếu tố bên ngoài tạo nên vết thương. Ngày nay, người ta còn sử dụng các loài vi sinh để tạo nên các vết thương cho cây nhằm tăng khả năng hình thành trầm hương. Tùy thuộc vào sự tạo trầm hương mà có thể thu được những sản phẩm khác nhau như : Tóc: do sự biến đổi một phần chất gỗ hình thành những đường đen như sợi tóc nhưng lượng tinh dầu ít nên chỉ được dùng làm nhang đốt. Trầm hương: gỗ trầm hương nhẹ, có vị cay, hơi đắng, mùi thơm nhẹ, có màu nâu hay sọc đen, ngấm tinh dầu trầm nhiều hơn tóc. Trầm hương càng tốt khi nó càng dễ chìm trong nước. Khi đố t cháy trầm hương bốc khói lên hình vòng rồi tan biến nhanh trong không khí. Kỳ nam: loại tốt nhất do có sự biến đổi hoàn toàn của phần gỗ, thấm nhiều tinh dầu trầm, sản phẩm này có thể có các màu nâu đậm, đen, xanh, vàng hay trắng. Kỳ nam nặng và nhuyễn, chìm trong nước, có đủ vị đắng, cay, chua, ngọt thơm, thường hình thành ở phần lõi của cây trầm hương. Kỳ nam chứa nhiều tinh dầu trầm nên khi cháy tạo ngọ n lửa màu xanh, khói lên thẳng và cao, bay lơ lửng trong không khí rất lâu. Người ta thường gói kỳ nam trong lá chuối thật kín rồi đem phơi nắng, đến tối đem vào nếu có nhiều chất dầu chảy ra là tốt. Muốn giữ kỳ nam được tốt và lâu thì nên bọc vào giấy thiếc, bỏ vào hộp có nắp đậy kín để tinh dầu khỏi bay hơi hoặc chảy ra. 5 Hình 1.5. Lõi cây dó bầu sau khi được cấy tạo trầm ba tháng. Hình 1.6. Trầm hương 1.1.5. Công dụng của trầm hương và kỳ nam [5] Trong y học cổ truyền nước ta, trầm được coi là vị thuốc quý hiếm, có vị cay, tính hơi ôn, có tác dụng giáng khí, nạp thận, tráng nguyên dương, được dùng chủ yếu để chữa các bệnh như đau ngực, đau bụng, nôn mữa, tiêu chảy, đau dạ dày, hen suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, á khẩu và khó thở. Ở Ấn Độ và Trung Quốc, hương trầm còn được s ử dụng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh ung thư tuyến giáp trạng. Y học dân tộc Thái Lan dùng trầm hương để điều trị các bệnh tiêu chảy, lợi tiểu, hạ sốt, chống nôn, bổ huyết và trợ tim. Theo Đông y, kỳ nam dùng để trị các chứng độc thủy do phong thổ gây nên, làm tiêu chứng chướng mãn, no hơi, đau bụng, ói mửa, hen suyễn, thở g ấp, hạ được nghịch khí, thông chứng bế do khí hư gây nên. Nước sắc từ gỗ trầm có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt với các loại khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri. Trầm hương có tính cháy rất cao, khi đốt tỏa mùi rất thơm, nhiều quốc gia có tập quán đốt trầm hương hoặc nhang sản xuất từ trầm hương trong dịp lễ cúng. Gỗ trầm làm đồ trang trí nội thất quý giá. [...]... chống oxy hóa trong đó cao nhất là cao ethyl acetate (IC50 7.96 µg mL-1) và cao butanol (IC50 10.24 µg mL-1 ) từ đó giúp định hướng cho quá trình nghiên cứu thành phần hóa học trong lá cây dó bầu Ngoài ra, cao nước và cao ethanol chiết trực tiếp từ lá cây dó bầu cũng thể hiện khả năng chống oxy hóa với IC50 lần lượt là 42.29 µg mL-1 và 36.31 µg mL-1 21 2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU A CRASSNA. .. hành khảo sát thành phần hóa học, hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết và chất tinh khiết thu được trong lá cây dó bầu Aquilaria crassna Pierre thu hái ở Lộc Ninh – Bình Phước Hàm lượng các chất cô lập trong lá cây dó bầu cũng được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò UV-VIS KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 2.1 Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ lá cây dó bầu Khảo sát khả...6 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học của trầm hương Từ những năm 1980, thành phần hóa học của trầm hương (agarwood) đã được nhóm các nhà khoa học như T Nakanishi; nhóm Yasuo Shimada; nhóm Masakazu Ishihara ; nhóm Tenji Konishi ; nhóm Regula Naf quan tâm và có nhiều công trình nghiên cứu Các báo cáo cho thấy thành phần hóa học chính trong trầm hương bao gồm... cây dó bầu Khảo sát khả năng chống oxy hóa của lá cây dó bầu Aquilaria crassna Pierre bằng phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên các cao chiết methanol, hexane, ethyl acetate, butanol, ethanol và cao nước từ lá cây dó bầu Kết quả thu được trình bày ở bảng 2.1 Bảng 2.1 Kết quả hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết từ lá cây dó bầu MẪU % ỨC CHẾ IC50 1 Cao ethyl acetate... hương (agarwood ) cũng như cây dó bầu nhưng cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính chống oxy hóa của lá cây dó bầu A crassna Pierre phân bố ở Việt Nam 1.3 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ GỐC TỰ DO DPPH• 1.3.1 Khái niệm về gốc tự do Trong cơ thể chúng ta, oxygen giữ một vai trò rất quan trọng, nó tham gia vào hầu hết các quá trình sinh hóa trong cơ thể như hô hấp... (2R,8R,8aS)-2-(1,2,3,5,6,7,8,8a-Octahydro-8,8a-dimethyl-2-napthyl)2-propenol Karanon 0.9 2.4 1.1 4.4 0.6 6.6 2.7 2.2 12 1.2.2 Thành phần hóa học thân cây dó bầu[ 5] Năm 2007, Nguyễn Thị Thùy Trang và các cộng sự trường đại học Khoa học tự nhiên HCM đã cô lập được một số hợp chất flavon, lignan và chromone trong thân cây dó bầu A crassna khi cây chưa có trầm như 5-hydroxy-7,4'dimethoxyflavone (31), 5-hydroxy-7,3',4'-trimethoxyflavone... 6,7-dimetoxy-2-(2-phenylethyl)chromone (37), 5,5'bis [7-hydroxy-2-(2-phenylethyl)]chromone (38) OCH3 OCH3 H3CO O OH O 31 32 33 34 13 O H3CO CH2OH HO HO CH2OH OCH3 H3CO OCH3 OH 35 38 14 1.2.3 Thành phần hóa học trong lá cây dó bầu Năm 2008, từ lá cây dó bầu A sinensis phân bố ở Trung Quốc nhóm nghiên cứu M Shimazawa, M Iinuma và các cộng sự đã cô lập được bốn hợp chất mangiferin (39), iriflophenone 2-O-α-rhamnoside (40),... trực tiếp từ lá cây dó bầu cũng thể hiện khả năng chống oxy hóa với IC50 lần lượt là 42.29 µg mL-1 và 36.31 µg mL-1 21 2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU A CRASSNA Khảo sát thành phần hóa học trong lá cây dó bầu A crassna Pierre thu hái ở Lộc Ninh – Bình Phước Từ cao ethyl acetate và cao butanol chúng tôi đã cô lập được bảy hợp chất tinh khiết DB1-DB7 Dựa vào các phương pháp phổ nghiệm hiện đại... chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH• bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH• của chất chống oxy hóa được minh họa trong hình 1.7 Chất chống oxy hóa Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH• 1.3.5 Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa Xác định phần trăm ức... spirovetivane (4R,5R,7R)-1(10)-spirovetiven-11-ol-2-one (30).[30] 10 H CHO 23 H COOCH3 CHO COOCH3 26 25 24 OH O O OH COOCH3 27 28 OH 29 30 Năm 1995, tác giả Regular Naf và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu của một mẫu trầm hương có nguồn gốc từ Ấn Độ (A agallocha Roxb.), sau khi đem phân tích mẫu tinh dầu bằng các phương pháp GC/MS thu được các kết quả sau [5] ( Bảng 1.1) Bảng 1.1 Kết . 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 6 1.2.1. Thành phần hóa học của trầm hương 6 1.2.2. Thành phần hóa học thân cây dó bầu 12 1.2.3. Thành phần hóa học trong lá cây dó bầu 14 1.3. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT. ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG UY NHÂN THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU AQUILARIA CRASSNA PIERRE. CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU. xác định khả năng chống oxy hóa 17 2. NGHIÊN CỨU 19 2.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ lá cây dó bầu 19 2.2. Thành phần hóa học lá cây dó bầu A. crassna 21 2.2.1. Hợp chất