khảo sát thành phần hóa học của cây lục bình ở hương thủy, thừa thiên huế

Xác định hàm lượng kim loại có trong mẫu cây lục bình bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 30 3.2.. DC2 Dịch chiết lỏng của cây lục bình trong etyl axetat C2 Cặn sau khi chiế

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA -

LÊ THỊ NHUNG

CÂY LỤC BÌNH Ở HƯƠNG THỦY, THỪA THIÊN HUẾ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SƯ PHẠM

Đà Nẵng- 2012

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA -

CÂY LỤC BÌNH Ở HƯƠNG THỦY, THỪA THIÊN HUẾ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SƯ PHẠM

SVTH : LÊ THỊ NHUNG LỚP : 08SHH

GVHD: ThS GIANG THỊ KIM LIÊN

Đà Nẵng- 2012

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘi CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

KHOA HOÁ -

-

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: LÊ THỊ NHUNG

Lớp: 08SHH

1 Tên đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY LỤC BÌNH Ở HƯƠNG THỦY, THỪA THIÊN HUẾ

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị:

- Nguyên liệu: Cây lục bình được thu hái tại Hương Thủy, Thừa Thiên Huế

- Dụng cụ, thiết bị: Tủ sấy, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS hiệu AAnalyst 100, máy đo sắc ký lỏng – khối phổ LC-

MS Xevo TQ hang Waters, Mỹ và thiết bị sắc ký khí- khối phổ (GC- MS) Aligent 7890A/5975C

3 Nội dung nghiên cứu:

- Xác định các thông số hóa lý của cây lục bình

- Chiết bằng phương pháp ngâm chiết tĩnh với các dung môi n-hexan, etyl axetat

và metanol

- Xác định thành phần dịch chiết trong n-hexan bằng phương pháp sắc ký khí- khối phổ (GC-MS) Xác định thành phần dịch chiết trong etyl axetat và metanol bằng phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS)

- Thử nghiệm hoạt tính sinh học

4 Giáo viên hướng dẫn: Th.S GIANG THỊ KIM LIÊN

5 Ngày giao đề tài:

6 Ngày hoàn thành:

Chủ nhiệm Khoa Giáo viên hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ, tên) (Ký và ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày 25 tháng 5 năm 2012

Kết quả điểm đánh giá:

Ngày…tháng…năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn khoa học ThS.Giang Thị Kim Liên, người đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc khoa Hóa-trường ĐHSP Đà Nẵng đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn, cùng với cán bộ phòng cấu trúc, Viện Hóa học, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Xin được gửi lời cảm ơn đến những người thân, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn

Tác giả

LÊ THỊ NHUNG

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 4

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC BẢNG, HÌNH 8

MỞ ĐẦU 10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1 Sơ lược về đặc điểm thực vật và phân bố của họ lục bình 13 1.2 Tình hình nghiên cứu về cây lục bình 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Thu gom và xử lý nguyên liệu 17 2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 17

2.2.1 Hóa chất 17 2.2.2 Thiết bị 17 2.3 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 19 2.3.1 Các phương pháp phân hủy mẫu phân tích 19 2.3.2 Phương pháp ngâm chiết 20 2.3.3 Phương pháp chưng cất để loại dung môi 20 2.3.4 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 21 2.3.5 Phương pháp sắc ký khí- khối phổ 22 2.3.6 Phương pháp sắc ký lỏng- khối phổ 23 2.3.7 Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Xác định các thông số hóa lý 28

3.1.2.2 Kết quả 30 3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại có trong mẫu cây lục bình bằng

phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 30

3.2 Khảo sát thành phần hóa học của các dịch chiết 31 3.2.1 Quy trình khảo sát thành phần hóa học các dịch chiết 32

3.2.3 Kết quả khảo sát thành phần hóa học DC1 35 3.2.4 Kết quả khảo sát thành phần hóa học DC2 41 3.2.5 Kết quả khảo sát thành phần hóa học DC3 45

DC2 Dịch chiết lỏng của cây lục bình trong etyl axetat

C2 Cặn sau khi chiết kiệt với etyl axetat

DC3 Dịch chiết lỏng của cây lục bình trong metanol

C3 Cặn sau khi chiết kiệt với metanol

EE Hợp chất hóa học trong dung môi etyl axetat

EM Hợp chất hóa học trong dung môi metanol

EtOH Etanol

L.f Lactobacillus fermentum

S.au Staphylococcus aureus

S.ent Salmonella enterica

E.coli Escherichia coli

P.aeru Pseudomonas aeruginosa

C.allbicans Candida albican

DANH MỤC BẢNG , HÌNH

Hình 1.1.Cây lục bình (hoa, lá, thân) 14

Hình 2.1 Mẫu bột khô của cây lục bình 17

Hình 2.2 Thiết bị đo AAS: AAnalyst 100 18

Hình 2.3 Thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Agilent 7890A/5975C 19

Hình 2.4 Sơ đồ thiết bị đo quang phổ hấp thụ nguyên tử 21

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của cây lục bình 29

Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lƣợng tro 30

Bảng 3.3 Kết quả xác định hàm lƣợng kim loại 31

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của cây lục bình 32

Hình 3.2 Dịch chiết của mẫu cây lục bình với n – hexanError! Bookmark not defined.33 Hình 3.3 Dịch chiết của mẫu lục bình với etyl axetat 33

Hình 3.4 Dịch chiết của mẫu cây lục bình với dung môi metanol.Error! Bookmark not defined.34 Hình 3.5 Sắc ký đồ của DC1 35

Bảng 3.4 Hiệu suất chiết 35

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát thành phần hóa học của DC1 35

Hình 3.6 Phổ khối của n – hexadecanoic axit 38

Hình 3.7 Phổ khối của phytol 38

Hình 3.8 Phổ khối của cholesterol Error! Bookmark not defined.39 Hình 3.9 Phổ khối của stigmasterol 39

Hình 3.10 Phổ khối của gamma- sitosterol 40

Hình 3.11 Phổ khối của 4,22- stigmastadiene-3-one 40

Hình 3.12 Sắc ký đồ LC của DC2 42

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thành phần hoá học của DC2 43

Hình 3.13 Phổ khối của (EE6) 44

Hình 3.14.Sắc ký đồ LC của DC3 45

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát thành phần của DC3 46

Hình 3.15 Phổ khối của (EM6) 47

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 49 Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa 50

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Từ nhiều thế kỷ nay, nền y học cổ truyền ở Việt Nam vẫn được duy trì, phát triển và ngày càng khẳng định được vai trò cũng như tiềm năng to lớn trong việc bảo vệ sức khỏe cho nhân dân Những chế phẩm y học cổ truyền được coi như một kho tàng dược liệu quý báu Cùng với sự tiến bộ của khoa học, con người đã có thêm điều kiện tốt để nghiên cứu, tìm ra thêm những công dụng của cây cỏ và góp phần làm giàu thêm cho nền y học cổ truyền Việt Nam

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quý Việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học Việt Nam Vậy nên, những bài thuốc từ thảo dược hiện nay là một chủ đề đang được các nhà khoa học Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung tích cực quan tâm Việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao Và việc nghiên cứu cây Lục bình cũng vậy

Lục bình (danh pháp khoa học: Eichhornia crassipes Solms) còn được gọi

là bèo tây, bèo sen hay bèo Nhật Bản, là một loài thực vật thủy sinh, thân thảo,

sống nổi theo dòng nước, thuộc về chi Eichhornia của họ Họ Bèo tây (Pontederiaceae) [1, 5, 9, 10] Lục bình có giá trị sử dụng lớn Nó được sử dụng

làm phân xanh bón ruộng, làm chất độn để ủ phân chuồng, làm thức ăn cho lợn, bò…Đọt non của lục bình được dùng làm thức ăn cho người Lục bình còn là nguyên liệu sản xuất giấy, sản xuất hàng thủ công mỹ nghệ, làm giá thể của sản xuất nấm rơm [24, 25, 26] Ngoài ra, người ta còn sử dụng nó vào việc chữa bệnh: lá và thân có vị ngọt cay, tính mát không độc, có tác dụng tiêu viêm giải độc lành da Lá lục bình tươi đem giã với muối rồi đem đắp lên ung nhọt, khô thì thay miếng khác, nhiều lần sẽ làm giảm sưng [4, 8, 19, 22]

Từ lâu, dù cây lục bình dễ sinh sôi, phát triển ở khắp Việt Nam, nhưng vẫn bị coi là thứ cây hoang dại ít được khai thác, sử dụng có hiệu quả Nhiều nơi, còn coi lục bình như là một mối họa môi trường vì lục bình gây tắc vướng giao thông đường thủy, cản trở dòng chảy kênh rạch [20] Hiện tại, ở vùng sông nước Nam Bộ, lục bình mới được người dân khai thác và sử dụng từ năm 2000 đến nay Còn đối với các vùng Trung Bộ và Bắc Bộ thì tiềm năng của cây lục bình vẫn chưa được người dân chú ý nhiều Những công trình nghiên cứu về cây lục bình vẫn còn rất ít, đặc biệt là việc nghiên cứu về thành phần hóa học của cây lục

bình và hoạt tính sinh học của nó Vì vậy, tôi chọn đề tài “ Khảo sát thành phần hóa học của cây lục bình ở Hương Thủy, Thừa Thiên Huế” làm đề tài khoá

luận tốt nghiệp của mình, nhằm góp phần cung cấp thêm những thông tin có ý nghĩa khoa học của cây lục bình để phục vụ cho việc nghiên cứu và ứng dụng nó vào thực tiễn

2 Đối tượng nghiên cứu

Cây lục bình được thu gom ở huyện Hương Thủy, tỉnh Thừa Thiên Huế

3 Mục đích nghiên cứu

Đề tài này nhằm mục đích khảo sát thành phần hóa học có trong cây lục bình để cung cấp thêm một số thông tin khoa học, góp phần cho việc nghiên cứu

và ứng dụng cây lục bình vào thực tiễn

4 Nội dung nghiên cứu

- Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu khô ướt kết hợp

- Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

- Chiết bằng phương pháp ngâm chiết tĩnh với các dung môi n-hexan, etyl axetat, metanol

- Xác định thành phần dịch chiết trong n-hexan bằng phương pháp sắc ký khí-khối phổ (GC - MS)

- Xác định thành phần dịch chiết trong etyl axetat và metanol bằng phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC - MS)

- Thử nghiệm hoạt tính sinh học

5 Bố cục của luận văn

Luận văn gồm 70 trang, trong đó có:

 Phần mở đầu ( 3 trang)

 Phần nội dung gồm 3 chương:

 -Chương 1: Tổng quan tài liệu (4 trang)

 -Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (10 trang)

 -Chương 3: Kết quả và thảo luận (22 trang)

 Kết luận và kiến nghị ( 2 trang)

 Tài liệu tham khảo ( 3 trang: 10 tài liệu tiếng Việt, 8 tài liệu tiếng Anh và 14 tài liệu Internet )

 Phụ lục (16 trang)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về đặc điểm thực vật và phân bố của họ lục bình

Họ Lục bình hay họ Bèo tây (danh pháp khoa học: Pontederiaceae) là một

họ thực vật hạt kín thuộc bộ Commelinales của nhánh commelinids thuộc nhánh lớn là monocots Đây là một họ nhỏ chứa các loài thực vật thủy sinh sống trôi nổi hay cắm rễ xuống bùn, rễ chùm, có hoa lưỡng tính, đối xứng tỏa tia là chủ yếu, nhưng có loài đối xứng hai bên Điểm đặc biệt là hoa dị kiểu (hay dị nhụy), sinh sống trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Thân sinh dưỡng ngắn hay bò lan, mập Lá mọc thành dạng giống như nơ hay phân bố dọc theo thân, xếp thành 2 dãy

Họ này theo Angiosperm Phylogeny Group có 6-9 chi và chứa khoảng 33 loài [27, 28]

 Eichhornia Kunth (bao gồm cả Piaropus): Bèo tây, bèo lục bình, bèo Nhật

Bản, phượng nhãn lam Một số tài liệu ghi nhận tới 7 loài trong chi này

 Eurystemon Có thể gộp trong chi Heteranthera

 Heteranthera Ruiz & Pav.: Dị nhị hoa Khoảng 11 loài tại Tây bán

cầu và châu Phi

 Hydrothrix : 1 loài lục thủy sam ở đông Brasil

 Monochoria C.Presl: Rau mác, vũ cửu hoa Khoảng 8 loài ở vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới châu Phi, châu Á và Australia

 Pontederia L.: Thoa ngư thảo Khoảng 6 loài ở Tây bán cầu

 Reussia Có thể gộp trong chi Pontederia

 Scholleropsis H.Perrier: 1 loài tại Madagascar

 Zosterella : Nghĩ cam tảo Có thể gộp trong chi Heteranthera

Ở Việt Nam có 2 chi (Monochoria, Eichhornia) và 5 - 7 loài

Chi Eichhornia gồm bảy loài bèo lục bình, là những cây lưu niên mọc tự

do, nổi trên mặt nước có nguồn gốc từ Nam Mỹ Với lá rộng, dày, bóng và có hình trứng, bèo lục bình trưởng thành có thể cao tới 1m Bề ngang lá từ 10-20

cm, nổi trên mặt nước nhờ thân dài, xốp, phồng ra hình củ Rễ có lông, có mày hơi tía đen Thân trắng đứng đỡ một cụm hoa từ 8-15 bông rất đẹp, phân biệt, có màu hoa oải hương hoặc hồng nhạt với sáu cánh hoa Bèo lục bình có thể sinh sản chính bằng thân bò lan, chúng cũng có thể sinh sôi bằng hạt Trong đó, cây

lục bình thông dụng nhất ( Eichhornia crassipes )

Hình 1.1.Cây lục bình (hoa, lá, thân)

Cây lục bình thuộc giới Plantae, bộ Commelinales, họ Pontederiaceae, chi

Eichhornia, tên khoa học là Eichhornia crassipes Đây là loài cỏ đa niên, là thực

vật thủy sinh, sinh sản rất nhanh, xâm lấn các dòng chảy chính Lục bình mọc cao khoảng 30 cm , là loài lá đơn, lá mọc thành hoa nhị, cuống xốp phồng lên thành phao nổi khi còn non, trưởng thành cuống thon dài Lá cuống vào nhau như những cánh hoa Hoa lưỡng tính không đều, màu xanh tím nhạt, cánh hoa có một đốm vàng Hoa có 6 nhụy gồm 3 dài 3 ngắn Bầu thượng 3 ô đựng nhiều noãn, quả nang Dò hoa đứng thẳng đưa hoa vươn lên khỏi túm lá Cây thân cỏ sống lâu năm, nổi trên mặt nước hay bám dưới bùn, rễ dài, rậm và trông như lông vũ sắc đen buông rũ xuống nước Kích thước cây thay đổi tùy theo môi trường có nhiều hay ít chất màu, sinh sản bằng con đường vô tính Từ các nách lá, đâm ra những thân bò dài và mỗi đỉnh thân bò cho một cây mới, sớm tách khỏi cây mẹ để trở thành một cá thể độc lập Ao, hồ, đầm nước lặng nhiều màu thì lục bình phát

Cây lục bình xuất xứ từ chây Nam Mỹ, du nhập Việt Nam khoảng năm

1905 [17], do đó trong tiếng Việt mới có tên bèo Tây Còn tên bèo Nhật Bản vì

có người cho là mang từ Nhật về

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây lục bình

Các công trình nghiên cứu về thành phần hoá học của cây lục bình trên thế giới rất ít và tại Việt Nam hầu như chưa có Còn các nghiên cứu về ứng dụng của cây lục bình thì đã được công bố khá nhiều

Lục bình có những công dụng như trồng làm cảnh Rễ bèo phơi khô làm vật liệu để chèn lót rất tốt, có sức đàn hồi cao, chịu được các hóa chất thông thường và ít bị nát vụn Ở dạng tự nhiên, lục bình có tác dụng hấp thụ những kim loại nặng như chì, thủy ngân và strontium và vì thế có thể dùng khử trừ ô nhiễm môi trường [22]

Ở Nhật Bản, người ta dùng lục bình để làm giấy và ép thành một thứ bìa nhẹ và cứng, dùng lục bình làm thuốc, chống ô nhiễm nguồn nước, có khả năng cung cấp năng lượng cho lên men bằng vi khuẩn….[29] Lục bình thuộc nhóm thức ăn xanh, chứ hầu hết các axit amin không thay thế, giàu vitamin, khoang đa lượng và vi lượng Có thể sử dụng lục bình cho gia súc khi thiếu thức ăn xanh Lượng chất khô thấp (6-7% ), lượng xơ cao (trên 200g/kg), khoáng tổng số cũng cao (180-190g/kg chất khô) nên giá trị năng lượng thấp Người ta còn sử dụng lục bình trong sản xuất thủ công mỹ nghệ nên cây lục bình cũng được khai thác mạnh để cung cấp nguồn nguyên liệu [24, 25]

Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn cây làm thuốc trị cảm mạo phát nhiệt, tiểu tiên đỏ đau, phong chẩn, mụn nhọt sưng đỏ

Ở Ấn Độ, hoa được dùng làm thuốc chữa bệnh về đường hô hấp…

Ở nước ta, người ta còn dùng lục bình làm phân xanh bón ruộng, làm chất độn để ủ phân chuồng và đặc biệt làm thức ăn xanh hoặc nấu chín với cám và bột bắp cho heo ăn Lục bình cũng là nguồn thức ăn tốt cho bò trong mùa khô thiếu

cỏ tươi… Cây lục bình được vứt bỏ hết phiến lá và rễ băm nhỏ, đem ủ lên men trong 24 giờ với một ít nước muối rồi trộn lẫn với cám cho bò ăn

Lục bình cũng có thể dùng làm rau ăn Người ta rút các đọt non, rửa sạch cắt mỏng dùng nấu canh, chỉ cần cho chín tái, không nên nấu chín nhừ, ăn nát không ngon Hoa ăn cũng ngon, có thể dùng ăn sống hoặc nấu canh như các đọt non

Năm 1979, Viện chăn nuôi đã cho biết thành phần hóa học của thân lục bình như sau (tính theo %): nước 92,3; protein 0,8; lipid 0,3; xenlulozo 1,4; dẫn

xuất không protein 5,08 và khoáng toàn phần 1,4 [20]

Hoa lục bình có vị nhạt, tính mát, có tác dụng sơ phong thanh, lợi niệu, giải độc, chữa sưng tấy hoặc viêm đau như sưng bắp chuối ở bẹn, tiêm bị áp xe, chín mé, sưng nách, viêm tinh hoàn, viêm khớp ngón tay, viêm hạch bạch huyết…[17] Khi ho hen ho đàm hoặc ho gió, chưng một nắm hoa với đường phèn uống, kết hợp thêm hoa hòe hoa khế càng tốt Người cao huyết áp mãn tính dùng hoa chế trà uống mỗi ngày cũng có tác dụng bình ổn Dùng khô thân và lá phơi khô sao thơm khử thổ phối hợp với các vị thuốc khác chữa hạch cổ tràng nhạc Ngoài ra, lá, hoa, thân và quả của lục bình là vị thuốc hiệu quả cao đối với người loãng xương và trẻ em gầy còm Ở miền Nam trước đây, bà con cũng thường dùng để chữa những vết thương trên cơ thể bị nhiễm độc chất hóa học Lục bình còn có tác dụng trị giun sán ở đường ruột trẻ em và người cao tuổi [30]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Thu gom và xử lý nguyên liệu

Cây lục bình được thu gom từ huyện Hương Thủy, tỉnh Thừa Thiên Huế vào ngày 3 tháng 8 năm 2011 Mẫu thực vật sau khi thu gom, rửa sạch, để ráo nước rồi đem cân Sau đó, đem mẫu khô đi xay nhỏ

Hình 2.1 Mẫu bột khô của cây lục bình

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

2.2.1 Hóa chất

 Dung môi n-hexan (C6H14)

 Dung môi etyl axetat (CH3COOC2H5)

 Dung môi methanol (CH3OH)

 Tủ sấy

 Cân kỹ thuật

 Các dụng thủy tinh dùng trong quá trình gồm có: bình tam giác loại 50mL,

100 mL, 250 mL, cốc thủy tinh các loại 5mL, 10mL, 20 mL, 50mL phễu Bruchner, ống hút, pipet, micropipet, đũa thủy tinh, lọ thủy tinh, chai đựng mẫu, ống đong 100 mL, ống nghiệm, giá đỡ, bình định mức 100mL, nhãn hóa chất, giấy lọc

 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS hiệu AAnalyst 100 ( phòng thí nghiệm khoa Hóa, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng)

Hình 2.2 Thiết bị đo AAS: AAnalyst 100

 Máy đo sắc kí lỏng kết hợp với khối phổ LC/MS Xevo TQ hãng Waters, Mỹ (phòng nghiên cứu cấu trúc – viện hóa học – viện khoa học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội) Hệ dung môi Metanol-nước; Tốc độ dòng : 0,25 ml/phút; Nguồn ion hóa của máy khối phổ : phun mù điện tử

 Thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Agilent 7890A/5975C ( Trung tâm kĩ thuật chất lượng đo lường 2, số 2 Ngô Quyền, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng)

Hình 2.3 Thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Agilent 7890A/5975C

- Điều kiện sắc ký: Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 280 oC Khí mang He: 7 psi Thể tích tiêm 1ul, split 10:1 Chương trình nhiệt độ lò: Nhiệt độ đầu 80oC, giữ ở

0 phút Sau đó tăng lên 290o

C với tốc độ gia nhiệt 10oC/phút, giữ ở nhiệt độ này trong 20 phút Cột sắc ký HP5MS 30m x 0.25mmx0.25um

- Điều kiện khối phổ: Nguồn Ion hoá:EI Năng lượng Ion hoá:70eV Nhiệt độ MS source: 230o

C Nhiệt độ MS Quad: 150 oC Nhiệt độ giao diện sắc

ký khí với detector khối phổ: 280oC Chế độ quét Fullscan: Thời gian trễ 0-3 phút, thời gian quét: 3-50 phút, khoảng khối quét: 35-600amu

2.3 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.3.1 Các phương pháp phân huỷ mẫu phân tích

Muốn phân tích một chất trong một đối tượng nào đó, trước hết ta phải chuyển chất đó vào dung dịch, đặc biệt đối với đối tượng phân tích là chất rắn

Phân loại: Phương pháp phân hủy mẫu phân tích bao gồm phương pháp

“ướt”, phương pháp “khô”, phương pháp kết hợp khô và ướt

- Phương pháp khô: Cách này thường dùng và đơn giản nhất Ta đem nung mẫu ở 500-5500C trong chén platin hay thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi Cần chú ý rằng trong quá trình

nung sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi như các halogen, thuỷ ngân, lưu huỳnh… Phương pháp này áp dụng cho mẫu hữu cơ dễ bị đốt cháy

- Phương pháp ướt: Thực hiện phản ứng oxi hóa khử bằng dung dịch axit

có tính oxi hóa mạnh Khó áp dụng cho mẫu hữu cơ Phương pháp này rất tốn dung môi và đòi hỏi dung môi phải tinh khiết Hàm lượng phân tích có khi lớn hơn lượng thực tế dẫn đến hiệu suất thu hồi lớn hơn 100% Tuy nhiên, phương pháp này lại hạn chế được việc bay hơi của các chất trong mẫu phân tích, kết quả phân tích gần với kết quả thực hơn

- Phương pháp khô ướt kết hợp: là sự kết hợp của hai phương pháp trên Cho lượng dung môi rất ít vào mẫu, mục đích phá vỡ các liên kết yếu rồi đưa vào

lò nung ở nhiệt độ thấp hơn so với nhiệt độ của phương pháp khô Phương pháp này giúp ta có thể nung ở nhiệt độ thấp nên hạn chế các chất bay hơi và lượng dung môi dùng ít hơn

2.3.2 Phương pháp ngâm chiết

Phương pháp chiết là phương pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng

Có thể chiết từ hổn hợp dung dịch hay từ chất rắn Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong hoá dược để tách các hoạt chất từ các vị thuốc có nguồn gốc động, thực vật

2.3.3 Chưng cất để loại dung môi

Chưng cất là phương pháp thường dùng để tách biệt và tinh chế những chất có nhiệt độ sôi khác nhau bằng cách đun sôi chất lỏng thành hơi rồi ngưng tụ hơi lại thành những chất lỏng tinh khiết

Chưng cất để loại dung môi bằng cách đun cách thuỷ hay đun bằng hơi nước hoặc cô cất quay chân không hoặc có thể để dung môi bay hơi một cách tự nhiên

2.3.4 Phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

2.3.4.1 Nguyên tắc của phép đo AAS

Trên cơ sở xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy phổ nguyên tử chỉ sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi Và do vậy muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các bước sau:

- Hoá hơi mẫu phân tích đưa về trạng thái khí Mục đích của quá trình này

là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích Có thể nguyên tử hoá mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc bằng kĩ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hưởng đến kết quả của phép đo AAS

- Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tố cần phân tích, chiếu chùm tia sáng đơn sắc đó vào đám hơi của nguyên tố cần phân tích

- Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích hướng vào khe đo để đo cường độ của nó

- Ghi nhận tín hiệu đo và kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị thích hợp

Hình 2.4 Sơ đồ thiết bị đo quang phổ hấp thụ nguyên tử

2.3.4.2 Trang thiết bị của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử

- Phải tạo ra được chùm tia phát xạ thuần khiết, chỉ bao gồm một số vạch nhạy của nguyên tố phân tích, phổ nền của nó phỉa không đáng kể

- Phải có cường độ cao nhưng bền theo thời gian

 Hệ thống nguyên tử hoá mẫu phân tích

Bộ phận nguyên tử hoá mẫu chuyển mẫu cần phân tích từ trạng thái ban đầu thành dạng hơi của các nguyên tử tự do dưới tác dụng của nhiệt độ Đám hơi của các nguyên tử tự do này chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử

2.3.5 Phương pháp sắc ký khí- khối phổ

2.3.5.1 Sắc ký khí

Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ Pha động mang hỗn

hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có

độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu

Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động

Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích thước, kích cỡ rất đa dạng Độ dài cột GC có thể là 25m, 30m, 50m, 100m và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tráng bằng một lớp polimer đặc biệt như phenyl 5% + dimetylsiloxane polymer 95%, đường kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn

Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ Đây gọi là sắc kí

đồ, mỗi một peak trong sắc kí đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp

từ cột sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu

2.3.5.2 Khối phổ

Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của

nó Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry) Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, do

đó chúng bị bỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ Những mảnh vụn thực tế là các ion, tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, tứ cự được thành lập bởi phần mền chương trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ

Về việc phân tích kết quả máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét Trục hoành biểu diễn tỉ lệ M/Z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector Đây là đồ thị của số khối

Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước Việc này

có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ sở để đăng ký một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng)

Thiết bị GC - MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng

để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS)

mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC - MS:Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC - MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí, nước…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó

Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học

Phương pháp phổ khối lượng với độ nhạy tuyệt vời (cỡ 10-6

– 10-9g) và tốc

độ ghi nhanh sẽ cho những thông tin xác định cấu trúc từ những lượng chất tách

ra được nhừ phương pháp sắc kí lỏng

Việc liên kết hai kỹ thuật đó đã tạo ra một công cụ mạnh mẽ để tách biệt

và nhận biết các hợp phần của các hỗn hợp tự nhiên và tổng hợp Nhờ có sự liên kết chặt này người ta có thể thu được phổ khối lượng đủ chấp nhận đối với tất cả các hợp phần mà sắc kí lỏng tách ra được, kể cả những hợp phần với khối lượng chỉ cỡ picogam và có mặt trong một vài giây

Ở hệ thống LC – MS người ta phải áp dụng những kỹ thuật đặc biệt để loại những dung môi phân cực dùng cho sắc kí lỏng trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng Toàn bộ quá trình vận hành và ghi kết quả đều được tự động điều khiển bởi computer

2.3.7 Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

2.3.7.1 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện theo phương pháp pha loãng nồng độ của Hadacek F và Greger H [12] tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng theo hai bước

Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm dịch chiết và các chất có hoạt tính

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất và của dịch chiết có hoạt tính

Chất đối chứng bao gồm: Ampixilin đối với vi khuẩn [Gram (+)] Tetraxilin đối với vi khuẩn [Gram (–)], Nystasin đối với nấm sợi

Các chủng vi sinh vật được chọn để thử gồm các vi khuẩn [Gram (–)],

Escherichia coli (E.C.) và Pseudomonas aeruginosa (P.A.)

E.C thuộc nhóm trực khuẩn Gram (–) thường sống ở đường ruột và gây một số bệnh ở người như tiêu chảy, viêm ruột thừa P.A là trực trùng mủ xanh thường gây mủ nhiễm trùng, có thể gây sốt, viêm mủ thận, tiêu chảy, khó điều trị

Các chủng vi sinh vật [Gram(+)] bao gồm: Bacillus subtilis (B.S.), Staphylococcus aureus (S.A.), Candida albicans (C.A.)

Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng Saboraud dextros broth và Trypcase soya broth (TSB) Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm)

Mẫu thử được hòa tan trong dung dịch DMSO 100% với 4 – 10 thang nồng độ được pha loãng từ dịch gốc rồi nhỏ trong phiến vi lượng 96 giếng Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hóa được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị MeLand (khoảng 108 vsv/ml) Để trong

tủ ấm 37oc trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30oC trong 48 giờ đối với nấm Sau

đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC)

Mẫu thô có giá trị MIC  200 μg/ml, mẫu tinh có MIC  50 μg/ml là có

hoạt tính

2.3.7.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa

 Phương pháp kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)

Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., M.B., Elena, K

và cộng sự (2003) Dựa theo nguyên tắc chất 1,1–diphenyl–2–picrylhydratzyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC50) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50

 Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza

Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC Adenine dextrose citrate), pha loãng 10 – 20 lần bằng nước cất Chia thành các ống nhỏ 0,5 – 1 ml Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh – 80oC Khi dùng pha loãng thêm 25 – 50 lần bằng RB H2O2 (0,2N hay 2%)

Indigo: chuẩn bị dung dịch stock – 80oC: 0,1N, pha loãng 100 lần sẽ thu được dung dịch phản ứng 0,001N

Chất thử:

– Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ

– Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng

độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm

Phản ứng:

– 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1N

– 10l chất thử pha trong DMSO và RB

– 60 l enzyme pha loãng 500 lần

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định các thông số hóa lý

3.1.1 Độ ẩm

3.1.1.1 Thực nghiệm

 Chuẩn bị các cốc được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong

tủ sấy đến khối lương không đổi m0 Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ

 Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu cây lục bình đã nghiền thành bột, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và sấy ở nhiệt

m

m m

m  

Trong đó:

m0: khối lượng cốc sứ (g)

m1: khối lượng mẫu (g)

m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

W (%): độ ẩm của mỗi mẫu

 Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 4 mẫu

3.3.1.2 Kết quả

Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của cây lục bình

Nhận xét: Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình của cây lục bình là

75,94% Giá trị này chỉ mang tính tương đối vì còn phụ thuộc vào các yếu tố khác như thời điểm lấy mẫu, điều kiện sinh thái môi trường

m1: là khối lượng của cốc sứ và mẫu cây lục bình trước khi sấy (g)

m3: là khối lượng của cốc sứ và mẫu cây lục bình sau khi tro hóa (g)

Hàm lượng tro trung bình là giá trị trung bình của hàm lượng tro tính cho

Nhận xét: Hàm lượng tro trung bình là 13,69%, như vậy hàm lượng chất

hữu cơ đã bị đốt cháy là 86,31%

3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại có trong mẫu cây lục bình bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

3.1.3.1 Thực nghiệm

Tro thu được sau khi nung các mẫu ở trên mang hòa tan vào dung dịch

H2SO4 và được định mức bằng nước cất Sau đó xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS: AAnalyst 100, phương pháp nguyên tử hoá mẫu bằng ngọn lửa với hỗn hợp khí đốt là khí axetylen và không khí

Định lượng bằng phương pháp lập đường chuẩn Các dung dịch chuẩn của các kim loại được chuẩn bị từ các dung dịch gốc 1000mg/l

3.1.3.2 Kết quả

Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại trong mẫu được trình bày ở

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng kim loại trong cây lục bình

Pb2+ Không phát hiện Không phát hiện

Cu2+ Không phát hiện Không phát hiện

Nhận xét: Căn cứ vào quyết định của bộ y tế số 505/BYT – QĐ ngày 13

tháng 4 năm 1992 về một số tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô đối với Pb: 2mg/kg; Zn: 20mg/kg; Cu: 20mg/kg thì hàm lượng kim loại nặng trong cây lục bình mà ta khảo sát ở bảng trên nhỏ dưới giới hạn cho phép, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

3.2 Khảo sát thành phần hoá học của các dịch chiết

3.2.1 Quy trình khảo sát thành phần hóa học của cây lục bình

Mẫu bột khô của cây lục bình được ngâm chiết tĩnh lần lượt qua 3 dung môi n-hexan, etyl axetat và metanol Sau đó, đem các dịch chiết thu được đi đo GC-MS và LC-MS để khảo sát thành phần hóa học của cây lục bình

Các phần dịch chiết còn lại được đem cô quay khô dung môi, thu được các cặn chiết tương ứng

Quy trình khảo sát thành phần hóa học của cây lục bình được tóm tắt trong hình 3.2

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của cây lục bình

Cân 30 gam mẫu bột lục bình khô cho vào bình tam giác có nút Sau đó, cho thêm dung môi n-hexan vào ngập hết mẫu bột khô và ngâm chiết tĩnh ở nhiệt

độ phòng Theo dõi sự thay đổi màu sắc của dịch chiết cho đến khi không đổi màu nữa thì lọc lấy dịch chiết có màu nâu đen và một lƣợng cặn không tan trong

Dịch lỏng tan trong n-hexan

có màu nâu đen: DC1

2 Cô đuổi dung môi

Dịch tan trong etyl axetat

có màu xanh nâu: DC2

Cặn không tan trong ethanol

n-hexan Tiếp tục chiết kiệt mẫu trong n-hexan như trên, sau 3 lần chiết thu được dich chiết DC1 và cặn không tan trong n-hexan là C1

Hình 3.2 Dịch chiết của mẫu cây lục bình với n – hexan

Tiếp tục chiết kiệt C1 trong dung môi etyl axetat Quá trình chiết cũng làm tương tự như đối với n-hexan Sau 3 lần chiết thu được dịch chiết DC2 màu xanh nâu và cặn không tan trong etyl axetat là C2

Hình 3.3 Dịch chiết của mẫu lục bình với etyl axetat

Cuối cùng, ta chiết kiệt C2 trong dung môi metanol Quá trình chiết cũng làm tương tự như đối với các dung môi trước Sau 3 lần chiết thu được dịch chiết DC3 có màu đen nâu và cặn không tan trong metanol là C3

Hình 3.4 Dịch chiết của mẫu cây lục bình với dung môi metanol

Đối với DC1: Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng phương pháp GC – MS

Đối với DC2 và DC3: Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết bằng phương pháp LC – MS

Hiệu suất chiết mẫu bằng các dung môi khác nhau được xác định theo công thức:

Hiệu suất chiết =  100

M

C m m

Trong đó:

mC: Khối lượng cặn khô tính theo gam

mM : Khối lượng mẫu khô tính theo gam

3.2.2 Hiệu suất chiết

Kết quả hiệu suất chiết của 3 dịch chiết được thể hiện qua bảng 3.4: