Phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ lá sa kê

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG LỆ THỦY 1101505 PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ SA KÊ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG LỆ THỦY 1101505 PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ SA KÊ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thái An DS Nguyễn Thị Thúy An Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hoàn thành khóa luận này, nhận đƣợc nhiều quan tâm, động viên giúp đỡ tận tình từ thầy cô, gia đình bạn bè Nhân dịp này, xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Nguyễn Thái An, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành khóa luận Đồng thời xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS Nguyễn Thị Thúy An, DS Bạch Thúy Anh cho đóng góp quý báu đề tài trực tiếp hƣớng dẫn hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dƣợc liệu - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội hỗ trợ trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, toàn thể thầy cô giáo, cán Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện để lĩnh hội kiến thức quý giá ngành Dƣợc suốt năm học Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè sát cánh, động viên hoàn thành khóa luận Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Lƣơng Lệ Thủy MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1.1.1 Vị trí phân loại chi Artocarpus J R Forst & G Forst 1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Dâu tằm (Moraceae) 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Artocarpus J R Forst & G Forst 1.1.4 Đặc điểm thực vật phân bố loài Artocarpus communis (J R Forst & G Forst.) 1.1.4.1 Đặc điểm thực vật 1.1.4.2 Phân bố sinh thái 1.1.4.3 Bộ phận dùng 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Rễ 1.2.2 Thân 1.2.3 Lá 1.2.4 Quả 12 1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CÂY SA KÊ 12 1.3.1 Tác dụng chống lao, chống sốt rét 12 1.3.2 Tác dụng chống xơ vữa động mạch 13 1.3.3 Tác dụng chống oxy hóa 13 1.3.4 Tác dụng làm trắng da 14 1.3.5 Tác dụng ức chế α-amylase α-glucosidase 15 1.3.6 Tác dụng kháng khuẩn 15 1.3.7 Tác dụng chống cao huyết áp 15 1.3.8 Tác dụng chống ung thƣ 16 1.3.9 Tác dụng chống muỗi 17 1.3.10 Tác dụng cầm máu, làm lành vết thƣơng 17 1.4 CÔNG DỤNG CỦA CÂY SA KÊ CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 17 20 20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Hóa chất thiết bị 20 2.1.2.1 Hóa chất 20 2.1.2.2 Máy móc thiết bị 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Định tính thành phần hóa học 21 2.2.2 Chiết xuất 21 2.2.3 Phân lập 22 2.2.3.1 Sắc kí cột 22 2.2.3.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế 23 2.2.4 Nhận dạng chất tinh khiết 23 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC 24 3.2 CHIẾT XUẤT 24 3.2.1 Xác định độ ẩm dƣợc liệu 24 3.2.2 Chiết xuất 3.3 ĐỊNH TÍNH CẮN PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT 24 26 3.3.1 Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat phản ứng hóa học 26 3.3.2 Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat sắc kí lớp mỏng 27 3.4 PHÂN LẬP 30 3.4.1 Phân lập 30 3.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 31 3.4.2.1 Hợp chất AR4 31 3.4.2.2 Hợp chất AR5 32 3.5 NHẬN DẠNG CÁC CHẤT PHÂN LẬP 34 3.5.1 Hợp chất AR4 34 3.5.2 Hợp chất AR5 36 3.6 BÀN LUẬN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 39 42 DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 1D-NMR One Dimension Nuclear Magnetic Resonance 2D-NMR Two Dimensions Nuclear Magnetic Resonance ABTS 2,20-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) ALT Alanine Aminotransferase AR Cắn toàn phần AR-C Cắn chloroform AR-E Cắn ethyl acetat AR-H Cắn n-hexan AR-W Cắn nƣớc AST Aspartate Aminotransferase 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR CAT Catalase CE Crude Enzym DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DHM Dihydromyricetin DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry EtOAc Ethyl acetat GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry GF254 Gypsum fluorescent 254nm GSH Glutathione HDL-C High Density Lipoprotein - Cholesterol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMG-CoA 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR HPLC High-performance Liquid Chromatography HSQC Hetoronuclear Single Quantum Coherence IC50 Half maximal inhibitory concentration LDH Lactate dehydrogenase LDL-C Low Density Lipoprotein – Cholesterol LPO Lipid peroxidation MABA Microplate Alamar Blue Assay MIC Minimum Inhibitory Concentration MS Mass Spectroscopy NXB Nhà xuất OxLDL Oxidized Low-Density Lipoprotein PC50 Half maximal penetration concentration Rf Retardation Factor SKC Sắc kí cột SKLM Sắc kí lớp mỏng SOD Superoxide dismutase STT Số thứ tự TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV254nm Ultra Violet 254nm UV365nm Ultra Violet 365nm DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 3.1 Các hợp chất flavonoid phân lập đƣợc từ Sa kê Bảng 3.2 Kết SKLM AR4 với hệ dung môi sau 32 quan sát UV254nm Bảng 3.3 Kết SKLM AR5 với hệ dung môi, quan sát 33 ánh sáng thƣờng sau phun thuốc thử Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR AR4 35 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR AR5 38 DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ Sa kê 25 Hình 3.2 Sắc kí đồ cắn ethyl acetat với hệ dung môi dƣới 28 UV365nm Hình 3.3 Sắc kí đồ cắn ethyl acetat với hệ I điều kiện 29 quan sát Hình 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl 31 acetat chiết xuất từ Sa kê Hình 3.5 Sắc kí đồ AR4 với hệ dung môi UV254nm 32 Hình 3.6 Sắc kí đồ AR5 với hệ dung môi quan sát ánh 33 sáng thƣờng sau phun thuốc thử Hình 3.7 Sắc kí so sánh AR5 cắn EtOAc 34 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học hợp chất AR4 36 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học hợp chất AR5 37 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR5 (MS, 1H-NMR, 13CNMR, DEPT, HMBC, HSQC) 100 150 LCMS SQ 8/1/2016 4:52:53 PM SYSTEM 20 40 60 80 100 MS Spectrum Print of window 80: MS Spectrum 200 241.0 242.0 250 300 350 400 Max: 53920 m/z Page of 2.000 1.006 AG1−MeOD−1H AR5−MeOD−1H 6.203 0.989 3.043 1.006 2.101 1.018 5.932 5.901 5.832 5.821 5.800 5.789 4.871 4.595 4.236 4.225 4.213 4.202 3.543 3.533 3.521 3.511 3.503 3.489 3.481 3.467 3.369 3.333 3.330 3.327 2.547 2.513 2.199 2.165 1.942 1.940 1.062 1.042 ppm F2 − Processing parameters SI 32768 SF 500.1300008 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 9.60 usec PL1 0.00 dB SFO1 500.1335009 MHz F2 − Acquisition Parameters Date_ 20160106 Time 14.52 INSTRUM spect PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 sec RG 71.8 DW 50.000 usec DE 6.00 usec TE 0.0 K D1 1.00000000 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec Current Data Parameters NAME 11K_AR5 EXPNO PROCNO 2.6 2.5 1.006 2.4 2.000 2.547 2.513 5.932 5.901 2.3 5.832 5.821 5.800 5.789 ppm 1.006 5.9 2.2 0.989 2.199 2.165 2.1 2.0 1.9 1.8 4.2 4.236 4.225 4.213 4.202 4.0 1.7 4.1 AG1−MeOD−1H AR5−MeOD−1H 1.942 1.940 3.043 1.018 1.6 3.9 1.5 3.8 1.4 3.7 1.3 3.6 1.2 3.5 ppm 2.101 3.543 3.533 3.521 3.511 3.503 3.489 3.481 3.467 1.1 1.062 1.042 6.203 ppm 220 201.255 200 180 160 132.545 132.438 127.167 140 120 100 80 80.138 167.306 AG1−MeOD−C13CPD AR5−MeOD−C13CPD 60 40 20 73.628 67.282 50.724 49.846 49.508 49.337 49.167 48.997 48.826 48.656 48.486 42.383 24.503 23.430 19.568 ppm F2 − Processing parameters SI 32768 SF 125.7576159 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.00 ======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 80.00 usec PL2 0.00 dB PL12 17.72 dB PL13 22.00 dB SFO2 500.1320005 MHz ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 5.80 usec PL1 −1.00 dB SFO1 125.7716224 MHz F2 − Acquisition Parameters Date_ 20160106 Time 14.58 INSTRUM spect PROBHD mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 128 DS SWH 31446.541 Hz FIDRES 0.479836 Hz AQ 1.0420883 sec RG 32768 DW 15.900 usec DE 6.00 usec TE 0.0 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec Current Data Parameters NAME 11K_AR5 EXPNO PROCNO 80 80.138 75 73.628 70 67.282 65 200 201.255 60 180 55 ppm 50 45 AG1−MeOD−C13CPD AR5−MeOD−C13CPD 167.306 50.724 49.846 49.508 49.337 49.167 48.997 48.826 48.656 48.486 42.383 40 35 132 132.545 132.438 130 30 ppm 127.167 25 24.503 23.430 ppm 19.568 200 210 C13CPD 210 200 200 CH2 CH&CH3 DEPT135 210 DEPT90 190 190 190 180 180 180 170 170 170 160 160 160 150 150 150 140 140 140 130 130 130 120 120 120 110 110 110 100 100 100 90 90 90 80 80 80 AG1−MeOD−C13CPD AR5−MeOD−C13CPD &DEPT 70 70 70 60 60 60 50 50 50 40 40 40 30 30 30 20 20 20 ppm ppm ppm 125 120 125 130 125 C13CPD 130 CH2 120 120 CH&CH3 DEPT135 130 DEPT90 115 115 115 110 110 110 105 105 105 100 100 100 95 95 95 90 90 90 85 85 85 80 80 80 75 75 75 70 70 70 65 65 65 60 60 60 AG1−MeOD−C13CPD AR5−MeOD−C13CPD &DEPT 55 55 55 50 50 50 45 45 45 40 40 40 35 35 35 30 30 30 25 25 25 ppm ppm ppm AR5−MeOD−HMBC AG1−MeOD−HMBC ppm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm AR5−MeOD−HMBC AG1−MeOD−HMBC ppm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 6.1 6.0 5.9 5.8 5.7 ppm AR5−MeOD−HMBC AG1−MeOD−HMBC ppm 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm AR5−MeOD−HMBC AG1−MeOD−HMBC ppm 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm AR5−MeOD−HSQC AG1−MeOD−HSQC ppm 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm AR5−MeOD−HSQC AG1−MeOD−HSQC ppm 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm AR5−MeOD−HSQC AG1−MeOD−HSQC ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm [...]... đã khảo sát đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của lá Sa kê và đã bước đầu phân lập được một số hợp chất Nhằm tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của lá Sa kê, đề tài Phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ lá Sa kê được thực hiện với các mục tiêu:  Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá Sa kê  Nhận dạng chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ Để thực hiện các mục... dung sau:  Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 2  Chiết xuất, định tính cắn phân đoạn ethyl acetat bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng  Phân lập một số hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat  Nhận dạng chất phân lập được dựa vào các dữ liệu phổ 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1.1.1 Vị trí phân loại của chi Artocarpus J R Forster & G Forster Theo hệ thống phân. .. prenylated flavonoid, và prenylated auron Ngoài ra Sa kê chứa một số triterpenoid và các hợp chất phenolic 1.2.1 Rễ  Vỏ rễ Năm 1991, Lin C N phân lập từ vỏ rễ 2 prenylflavonoid là cycloartomunin và dihydro cycloartomunin, cùng với một pyrano dihydro benzoxanthon là cycloartomunoxanthon [40] Năm sau đó, Lin C N tiếp tục phân lập 3 hợp chất pyranoflavonoid là cyclocommunol, cyclocommunin và dihydroisocycloartomunin,... H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất Sau đó cạo lớp silicagel có chất, phản hấp phụ và tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong dung môi thích hợp 2.2.4 Nhận dạng các chất tinh khiết Nhận dạng chất phân lập được từ dữ liệu các phổ: phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC, HSQC 13 C-NMR),... [18] Năm 1976, Altman và cộng sự phân lập 2 hợp chất sterol là cycloart-23ene-3β,25-diol và cycloart-25- ene-3β,24-diol từ dịch chiết cloroform quả Sa kê [21] Ngoài ra, Nguyễn Trung Nhân phân lập được 4 hợp chất gồm 2-formyl5-hydroxymethyl fural, acid gallic, 5-hydroxy-7,4'-dimetoxy flavon, epifriedelanol [13] 1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CÂY SA KÊ 1.3.1 Tác dụng chống lao, chống sốt rét Boonphong S sử... (11) trong đó hợp chất 3’’,3’’-dimethyl pyrano[3’,4’]2,4,2’-trihydroxychalcon lần đầu tiên được nhận dạng bằng dữ liệu phổ 1D, 2D- NMR [27] Năm 2010, Shamaun sử dụng phổ IR, MS, 1H và 13 C-NMR, xác định một prenylated flavon từ dịch chiết cloroform vỏ thân là hydroartocarpin [53] 1.2.3 Lá Nguyễn Thị Thúy An đã sơ bộ định tính xác định trong lá Sa kê có chứa một số nhóm chất là flavonoid, saponin, anthranoid,... Đông Nam Á [12] Trung tâm đa dạng nhất của các giống Sa kê nằm ở khu vực từ một số đảo thuộc Indonesia đến Papua New Guinea [14] Ở Việt Nam, Sa kê mới chỉ được trồng rải rác trong các vườn cây ăn quả của gia đình từ Đà Nẵng trở vào Cây không trồng được ở các tỉnh phía Bắc [14] Sa kê là loại cây gỗ lớn, ưa sáng và khí hậu của vùng nhiệt đới nóng và ẩm, nhiệt độ trung bình từ 23 - 30°C Cây có thể chịu... Thân rễ Boonphong S phân lập 6 prenylflavonoid là morusin, cudraflavon B, cycloartobiloxanthon, artonin E, cudraflavon C và artobiloxanthon [23] 1.2.2 Thân 7 Năm 1990, Hano Y phân lập được 2 prenyl flavonoid từ dịch chiết benzen vỏ thân Sa kê là artonin E và F, cùng với một hợp chất đã biết là cycloartobiloxanthon [28] Năm 1993, Chen C C tiếp tục phân lập được 6 prenyl flavonoid từ dịch chiết ethanol... đốt thành than, tán mịn, phối hợp với dầu dừa, nghệ tươi, giã nát, làm thành bánh để đắp [14]  Sưng háng, mụn nhọt, áp xe: lá Sa kê và Đu đủ để tươi, lượng bằng nhau, giã với vôi tôi đến khi màu vàng, đắp lên chỗ mụn [14]  Trị tiểu đường týp 2: 100g lá Sa kê tươi, 100g trái Đậu bắp tươi, 50g lá Ổi non, nấu nước uống trong ngày [15]  Chữa viêm gan, vàng da: 100g lá Sa kê tươi, 50g Diệp hạ châu tươi,... không chỉ vô hại với tế bào B16F10 và tế bào sợi của người mà còn không gây kích ứng da chuột, bên cạnh đó, nó ức chế hoạt động của tyrosinase (TRP-1 và TRP-2) và giảm lượng melanin [37] 1.3.5 Tác dụng ức chế α-glucosidase và α-amylase Các hợp chất altilisin H, I, J phân lập từ lá Sa kê có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase với IC50 lần lượt là 4,9 và 5,4 µM [43] Nair và cộng sự thử nghiệm in vitro đánh